跳过调节TGF -β1-Induced细胞外基质降解蛋白酶表达在人类曲泽前列腺癌细胞

文摘

目的。确定Ski-interacting蛋白质(跳过)调节TGF -β1-stimulated表达urokinase-type纤溶酶原激活物(uPA),矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)和uPA抑制剂(PAI-1) androgen-independent人类前列腺癌的细胞模型。材料和方法。使用曲泽前列腺癌细胞系。跳过的作用是评估使用合成小干扰RNA (siRNA)化合物。的表达uPA、MMP-9 PAI-1被zymography分析评估,rt - pcr和启动子transactivation分析。结果。曲泽细胞TGF -β1治疗刺激uPA、PAI-1 MMP-9表达式。跳过的击倒曲泽细胞增强uPA的基础水平,和TGF -β1治疗抑制uPA生产。PAI-1和MMP-9生产水平增加以应对TGF -β1。跳过的异位表达抑制两TGF -β1-induced uPA和transactivation MMP-9发起人,而PAI-1子反应因素是未受影响。结论。跳过调节的表达uPA、PAI-1 MMP-9刺激TGF -β1在曲泽细胞。因此,跳过是参与调节细胞外基质降解,因此可以认为小说在前列腺癌治疗的治疗目标。

1。介绍

转化生长因子β1 (TGF -β1)是参与调节细胞增殖、分化、迁移,以及细胞外基质(ECM)生产、细胞凋亡和肿瘤发生1]。TGF -β1是经常在癌的细胞,包括前列腺癌细胞,导致细胞和细胞外基质的旁分泌刺激和修改组件的肿瘤微环境(2]。urokinase-type的纤溶酶原激活物(uPA)系统被认为发挥关键作用在癌症入侵和转移。uPA分泌丝氨酸蛋白酶,将纤溶酶原血纤维蛋白溶酶,物trypsin-like丝氨酸蛋白酶,这反过来会降低各种ECM组件和使肿瘤细胞穿透基底膜,通过促进细胞迁移和侵袭性3]。uPA紧密控制的特定serpin抑制剂PAI-1,也是调节癌症。PAI-1能促进细胞迁移和血管生成独立于它的影响uPA-activated血纤维蛋白溶酶(4]。

基质金属蛋白酶(MMPs)也被视为关键分子在帮助肿瘤细胞转移。MMP-9 IV型胶原酶的一员,是影响细胞增殖、分化、血管生成、细胞凋亡和转移。激活后,MMP-9参与蛋白水解降解ECM (5]。

增加表达uPA、PAI-1 MMP-9相关报道在癌症肿瘤分化差、阶段的浸润性癌患者预后差,转移到辅助器官,和更短的生存时间3,5- - - - - -8]。此外,在前列腺癌细胞TGF -β1刺激uPA的表达和活性,PAI-1, MMP-9,导致净增量pericellular纤溶酶原激活物,MMP-9的激活增加,最后增加肿瘤细胞浸润和转移(9,10]。

的信号通路TGF -β发挥其对癌细胞的迁移和入侵的影响正逐渐被阐明。最近,据报道,Ski-interacting蛋白质(跳过)与Smad2, 3加强TGF -β端依赖转录,暗示其监管的作用通过TGF -细胞生长和分化β通路(11]。跳跃是一种守恒的转录适配器蛋白,根据细胞的上下文,招募激活或抑制复合物功能协调多个信号通路参与控制细胞增殖和分化12]。然而,它的精确作用刺激肿瘤发生的TGF -β1了解甚少。在这项研究中,我们调查是否跳过调节TGF -β1-induced细胞外基质降解系统uPA / PAI-1和MMP-9表达在前列腺癌曲泽细胞系。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类前列腺癌细胞系(曲泽)从写明ATCC获得(弗吉尼亚州Mannassas)和在DMEM培养:F12(1: 1)补充10%胎牛血清。TGF -β1治疗,人类重组TGF -β1(研发、明尼阿波利斯、MN)使用5 ng / mL。

2.2。抗体

跳过(C-15)和Smad2/3 ((fl - 425): sc - 8332)兔多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术(美国CA)。从Calbiochem p-Smad3兔多克隆抗体购买,(达姆施塔特,德国)。Anti-HA和二级抗体结合辣根过氧化物酶是购自σ(圣路易斯密苏里州,美国)。

2.3。质粒和核

HA-SKIP表达质粒是请提供的m·海曼博士(美国石溪大学)。小干扰rna (sc - 37164)和控制人类跳过核(sc - 37007)购买从圣克鲁斯生物技术。uPA启动子(+ 2062 + 27)在荧光素酶报告基因质粒pGL2基本(p-uPA-Luc)博士是一个慷慨的礼物Soishi小岛从物理和化学研究所(日本),筑波、茨城、日本。MMP-9子隆博士提供的施工请小林(千叶大学医学院、美国)。PAI-1的启动子,p - 800 - luc(+ 71−800)请提供的c·伯纳乌博士(CIB、西班牙)。

2.4。瞬时转染和报告基因的测量

曲泽细胞播种在24孔板(~ 2×10⁴细胞/)转染500 ng /启动子荧光素酶的结构和SV40 - 25 ng /好β加作为转染效率的内部控制。转染细胞治疗TGF -β1为24小时。萤火虫荧光素酶活性(美国爱迪生WI Promega)标准化β牛乳糖活动(美国马Tropix,贝德福德)。为跳过击倒实验,曲泽细胞生长在6孔板(~ 3×10⁵细胞/)与20 nM跳过转染核或无效的控制核。

2.5。免疫印迹、Zymography和rt - pcr检测

其他西方墨迹图进行描述(13]。MMP-9 uPA活动被化验血清媒体条件的24小时与TGF -细胞培养或不治疗β1。的媒体受到sds - page zymography凝胶含有1毫克/毫升明胶MMP-9或casein-zymography uPA化验,先前报道(14]。

总RNA是获得使用试剂盒和互补DNA上标合成第一链系统生成的rt - pcr(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)使用益生元(dT)底漆。以下引物被用于这项研究:跳过:5′-GCG-CTC-ACC-AGC-TTT-TTA-CCT-GCA-CC-C-3′, 5′-CAC-GAC-AGG-CGC-AGG-AGG-AGA-AGC-3′逆转,700个基点;MMP-9: 5′-GAG-ACC-GGT GAG-CTG-GAT-AG 3′, 5′TCG-AAG-ATG-AAG-GGG-AAG-TG 3′逆转,500 kb;PAI-1: 5′CCA-CTT-CTT-CAG-GCT-GTT-CC 3′, 5′GCA-GTT-CCA-GGA-TGT-CGT-AG 3′逆转,350 kb;和GAPDH: 5′ACC-ACA-GTC-CAT-GCC-ATC-AC 3′, 5′TCC-ACC-ACC-CTG-TTG-CTG-TA 3′逆转,450个基点。产品获得30到35个循环扩增后,在1.2%琼脂糖凝胶电泳。

2.6。统计数据

数据给出意味着±SEM从至少三个独立的实验。星号(*)表示值的显著差异。水平支架覆盖组相比较的统计学意义。

3所示。结果

3.1。跳过表达和TGF -β曲泽1-Induced uPA、MMP-9 PAI-1生产细胞

首先我们检查跳过的表达在前列腺癌细胞的免疫印迹和rt - pcr分析。图1(一)表明曲泽细胞表达跳过mRNA和蛋白。接下来,我们决定TGF -的能力β1调节细胞外基质降解酶的生产,uPA和MMP-9以及uPA抑制剂PAI-1曲泽细胞。TGF -β1极大地增强了生产uPA和MMP-9,由zymography化验(图1 (b)),以及PAI-1 mRNA的表达转录取决于rt - pcr(图1 (c))。

3.2。可拆卸的siRNA曲泽细胞的跳过

分析是否跳过参与TGF -的影响β1曲泽细胞,我们受到细胞siRNA-mediated下调跳过。观察图1 (d)小干扰rna (20 nM),转染产生了戏剧性的损耗跳过小干扰rna转染细胞表达与控制。我们进一步分析的功能通过Smad3激活TGF -跳过击倒β1。如图1 (e)显示,跳过的沉默曲泽细胞导致强烈的TGF -镇压β1-induced Smad3的磷酸化与控制。

3.3。跳过调节uPA和PAI-1表达式

分析是否参与TGF -跳过β1-induced uPA曲泽细胞中表达,uPA的活动小干扰rna转染细胞分泌的条件媒体跳过被zymography试验研究。SKIP-silenced细胞,增强生产uPA基础水平的检测,而TGF -β1治疗导致显著抑制uPA表达,而在与控制siRNA TGF -细胞转染β(图1增强uPA生产2(一个))。有趣的是,跳过的异位表达也强烈抑制TGF -β1-induced uPA发起人transactivation(图2 (b))。

此外,跳过击倒增强PAI-1 mRNA表达的基础水平,稍微修改了TGF -β1在控制细胞达到PAI-1表达水平TGF -β1治疗(图3(一个))。有趣的是,当我们决定跳过的异位表达的影响PAI-1启动子,我们并没有发现显著变化的感应transactivation TGF -β(图1与控制相比,转染细胞3 (b))。

3.4。跳过沉默增强TGF -β1-Induced MMP-9表达式

我们的下一个目标是分析是否跳过调节TGF -β1-induced MMP-9生产。如图4(一)TGF - MMP-9的刺激生产β1、由zymography强烈增强SKIP-depleted细胞相对于刺激控制细胞。这个结果平行与rt - pcr分析,得到的表达式的MMP-9 mRNA转录增强跳过siRNA-transfected细胞受到TGF -β1小干扰rna转染细胞治疗与控制。此外,跳过的异位表达抑制的影响TGF -的刺激β1 MMP-9子活动相比,控制(图4 (b))。

4所示。讨论

TGF -β是一种多功能细胞因子,建立了作为prometastatic代理在晚期癌症,和它的表达与患者预后负相关在人类前列腺恶性肿瘤(2]。TGF -的能力β刺激入侵可能代表一个重要的贡献在前列腺癌的致癌过程。自TGF -β1刺激肿瘤细胞的侵袭性[1),重要的是发现机制控制转化细胞的胞内信号的因素。最近,Ski-interacting蛋白(跳过)已被证明在TGF -调节Smads”活动β1信号通路(11TGF -],即使它的作用β1-induced人类细胞恶性还没有好了。

在目前的工作中,我们分析的角色跳过TGF -β1-stimulated表达细胞外蛋白酶降解uPA、MMP-9 uPA的抑制剂,PAI-1。这些蛋白是高度参与肿瘤细胞浸润和转移,也称为不良预后标记在人类癌症3,5- - - - - -8]。作为细胞模型,我们使用了人类前列腺癌曲泽细胞系,成立于从前列腺腺癌骨转移,保留在体外常见上皮来源的肿瘤细胞14]。我们观察到曲泽细胞表达检测跳过mRNA转录和跳过蛋白质的水平,并且在TGF -β1治疗细胞诱导增加生产uPA、MMP-9, PAI-1(图1),这是在协议与几个先前的报道(15- - - - - -17]。

跳过uPA基底生产增加的击倒,虽然减少了uPA TGF -后生产β1治疗(图2)。鉴于跳过损耗减少Smad3激活(13),我们曾报道Smad3作为TGF -至关重要β1-induced uPA在转化细胞(18),我们可以推测,减少Smad3激活TGF -β5月1日逆生长因子的细胞反应,而在基础条件的影响上跳过uPA表达式可能Smad3信号独立的。

uPA的活动也受其抑制剂的表达PAI-1 [3,4]。跳过的差别有趣的是,对这些基因的增强基底PAI-1生产和这个水平是影响TGF -β1(图3)。可以想象猜测这一结果可能会跳过的参与在视网膜母细胞瘤(Rb)抑制。在hypophosphorylated Rb和E2F在复杂,细胞周期的监管机构,而当Rb由CDKs磷酸化,E2F释放和自由形式作为抑制剂PAI-1表达式(19]。跳过的低表达可能会让Rb / E2F在复杂,这可以导致PAI-1表达式的增量TGF -独立的β1刺激。此外,E2F也是一个负监管机构uPA表达,这可能部分解释增强基底uPA表达水平下跳过损耗。因此,跳过损耗可能影响基底uPA和PAI-1表达独立的Smad3曲泽细胞。

另外,我们观察到曲泽细胞增加MMP-9 TGF -下的表达式β1治疗和跳过的减少提高了TGF -β1-induced MMP-9表达式,而跳过的异位表达抑制MMP-9发起人transactivation(图4)。TGF -差别跳过对这些基因的影响β1-induced MMP-9部分可以解释为减少Smad3激活,这可能需要调节MMP-9的足够水平的表达,而低水平的Smad3激活可能放松控制MMP-9表达TGF -曲泽细胞反应β1。这个观察支持报告的错义突变Smad3 Smad3基因或损耗的基因敲除小鼠显示增加MMP-9生产(20.,21]。

5。结论

这里给出的结果表明,跳过调节uPA的表达,PAI-1, MMP-9 TGF -的反应β1在曲泽细胞,暗示跳过调节细胞外基质的降解。进一步的研究应该执行为了理解的大小可能跳过在前列腺癌进展的作用。调查致力于决定跳过表达水平与不同级别的前列腺癌细胞恶性前列腺癌临床样本的以及分析其表达和分布的高利息。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是FONDECYT赠款支持。1050476,智利,也没有。175062年教育部、科学和技术发展的塞尔维亚共和国。

引用

1. d·帕多瓦和j . Massague TGFbeta的角色转移。”细胞研究,19卷,第102 - 89页,2009年。视图:谷歌学术搜索
2. p . Wikstrom p . Stattin Franck-Lissbrant, j . e . Damber和a·马瑞医生”转化生长因子B1与血管生成有关,转移,在前列腺癌临床疗效不佳,“前列腺癌37卷,19-29,1998页。视图:谷歌学术搜索
3. n Sidenius和f·布拉西,尿激酶纤溶酶原激活物系统在癌症:最新进展和影响预后和治疗,”癌症和转移的评论,22卷,不。2 - 3、205 - 222年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m . k . j . s . Bodker勾勒出a·克里斯滕森et al .,“纤溶酶原激活物inhibitor-1和肿瘤生长,入侵和转移,”血栓和止血法卷,91年,第449 - 439页,2004年。视图:谷歌学术搜索
5. 依Deryugina和j.p.奎格利基质金属蛋白酶与肿瘤转移。”癌症和转移的评论,25卷,不。1,9-34,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. k . Dass a·艾哈迈德·a . s .阿,s . h . Sarkar和p.h. Sarkar”进化uPA / uPAR系统在人类癌症中的作用,“癌症治疗的评论,34卷,不。2、122 - 136年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c . Festuccia m·博洛尼亚c Vicentini制作et al .,“矩阵metalloproteinase-9分泌增加短期的前列腺肿瘤细胞组织培养,“国际癌症杂志》上卷,69年,第393 - 386页,1996年。视图:谷歌学术搜索
8. p . j . Van Veldhuizen r . Sadasivan r . Cherian和a·怀亚特,“Urokinase-type纤溶酶原激活物表达在人类前列腺癌,”美国医学科学杂志》上,卷312,不。1,8 - 11,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c . Festuccia a . Angelucci g . l . Gravina et al .,“Osteoblast-derived TGF-beta1调节基质降解蛋白酶表达在前列腺癌细胞和活动,“国际癌症杂志》上卷,85年,第415 - 407页,2000年。视图:谷歌学术搜索
10. l·康拉德·j·a .任由l·施瓦兹的a·j·施克拉德,“TGF - r·霍夫曼β1、TGF -β2大力增强纤溶酶原激活物的分泌inhibitor-1和矩阵metalloproteinase-9人类前列腺癌的细胞系曲泽,”监管肽,卷155,不。1 - 3,28-32,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 通用汽车梁:安,j·菲格罗亚et al .,“Ski-interacting蛋白质与Smad蛋白质增加转换增长factor-beta-dependent转录,”《生物化学》杂志上,卷276,不。21日,第18248 - 18243页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. p .民间、f . Půta和m . Skružny“转录coregulator SNW /跳过:不同通路的隐蔽的领带,“细胞和分子生命科学,卷61,不。6,629 - 640年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 诉道,j . Kocic d . Bugarski g . Jovcic和j . f . Santibanez”需要跳过TGF -β1-induced上皮间充质过渡和转换角化细胞迁移,”2月的信,卷584,不。22日,第4592 - 4586页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. j . f . Santibanez a·纳瓦罗和j·马丁内斯,“染料木黄酮抑制体外增殖和侵袭性潜在的人类前列腺癌的细胞系,”抗癌的研究,17卷,不。2、1199 - 1204年,1997页。视图:谷歌学术搜索
15. j . f . Santibanez p . Frontelo m·伊格莱西亚斯j·马丁内斯,业务,和m . Quintanilla说道“尿激酶与转化生长因子的表达和绑定活动联系起来beta1-induced迁徙和侵入性表型小鼠表皮角质细胞,”细胞生物化学杂志》上卷,74年,第73 - 61页,1999年。视图:谷歌学术搜索
16. 业务,j .弗朗西斯科Santibaez j·格雷罗州,m . Quintanilla说道a·布拉和j·马丁内斯,”转化生长因子-β1调节矩阵metalloproteinase-9生产通过Ras / MAPK信号通路在转换角化细胞,”生物化学和生物物理研究通信,卷296,不。2、267 - 273年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. d . Bello-DeOcampo和d . j . Tindall TGF -β前列腺癌/ smad信号”,目前的药物靶点,4卷,不。3、197 - 207年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j . Kocic d . Bugarski和j·f·Santibanez SMAD3转化生长因子-至关重要β1-induced尿激酶型纤溶酶原激活物表达和转换角化细胞迁移,”欧洲癌症杂志48卷,第1557 - 1550页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m . Koziczak w . Krek y Nagamine,“口袋里的蛋白质镇压urokinase-type纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂1 E2F1基因表达,“分子和细胞生物学,20卷,不。6,2014 - 2022年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 王j.y.姚明,y, j . et al .,“Smad3基因的突变分析人类骨关节炎,“欧洲人类遗传学杂志》上,11卷,不。9日,第717 - 714页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. p . Bonniaud m·科尔布·t·高尔特et al .,“Smad3 null老鼠开发领空扩大和抵抗TGF -β介导的肺纤维化”,免疫学杂志,卷173,不。3、2099 - 2108年,2004页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2013维克多·维拉尔et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。