文摘

前列腺癌(PCa)有一个变量生物学从潜在的癌症非常激进的肿瘤。增殖活动的癌症可能表明生物的潜力。流仪测定计算最大增殖一倍时间()的PCa根治性前列腺切除术术前后的标本在活的有机体内溴脱氧尿苷(BrdU)注入。只有4/17的标本肿瘤足够大了流量仪分析。的肿瘤相似,范围从0.6到3.6个月。肿瘤计算翻倍2 - 25倍的速度比他们匹配的正常组织。标记指数和的变化观察肿瘤内以及不同格里森评分。观察到的PSA翻倍(PSA-DT)范围从18.4到32.0个月,大大低于相应的肿瘤的介入。虽然缺乏对凋亡率的数据是一个限制,明显的潜在的和激进的PCa之间生理上的差异可能是由于这些肿瘤的凋亡率的变化而不是他们的细胞增殖率。

1。介绍

在2010年,估计有217000人将被诊断为前列腺癌和32000人死于这种疾病仅在美国(1]。前列腺癌(PCa)是一种多病灶的疾病,其特征是显著的异质性的形态以及临床行为。将近三分之二的前列腺包含多个癌症病灶和索引或最大的肿瘤可能不一定确定临床结果(2]。解剖研究表明,> 50%的年龄在50岁及50岁以上的男性有组织学证据表明PCa (3]。这些潜在的肿瘤组织学上与积极的主成分分析,但没有进展或尽管成为临床上明显的组织学相似之处。咄咄逼人的PCa基于体积,可以从潜在的分化癌组织学分级、肿瘤翻倍(4,5]。

组织学结构分级PCa(被认为是主要的预后工具6]。然而,扩散的速度和倍增时间预计也将肿瘤预后相关性,并理解肿瘤的生物学行为(关键5,7,8]。在这个方向的研究是有限的由于困难获得准确的细胞动力学数据在临床的设置。准确预测肿瘤恶化和患者的生存是一个具有挑战性的问题在前列腺癌的临床管理。

潜在的生物学行为和侵略性的肿瘤的知识将帮助临床医生在定制治疗方法。当前概念是前列腺癌存在两大类:(1)那些潜在的和不会成为临床上重要的病人的一生,和(2)临床上重要的肿瘤入侵并有可能转移至遥远的网站导致死亡。前列腺肿瘤的广泛不同的卷(范围0.001 -35 cc)中可以找到一个前列腺切除术标本(2]。通常认为,“小”体积肿瘤代表潜在的增长缓慢,而“大”代表体积肿瘤快速增长的临床意义的。没有绝对体积定义从“大”“小”肿瘤。此外,(a)肿瘤体积小可以优质和(b)甚至低级,容量可以局部浸润性癌(2]。虽然这些类别暗示这样的肿瘤有显著不同的翻倍,不存在数据,直接测量这个变量在适当的肿瘤。

方法常用来衡量增殖活动评价肿瘤(s阶段分数的9]。这是进行放射自显影法,具有一定的局限性。几个调查人员使用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入乙醇固定前列腺活检组织研究s阶段分数或潜在的PCa(翻倍10,11]。潜在的23 - 61天翻倍观察,但低标记指数的PCa是一个混杂的问题(11]。本研究建立技术进行分离细胞核从formalin-fixed激进retropubic前列腺切除术(RRP)石蜡包埋标本病人充满BrdU之前手术。这些标本是用来计算最大增殖一倍时间()仪分析PCa的流。

2。材料和方法

本研究通过科罗拉多多个机构审查委员会在科罗拉多大学丹佛。1999年8月至2002年4月,书面知情同意了从17 RRP病人。25毫克/毫升的BrdU溶液稀释到250毫升生理盐水。剂量强度是200毫克/米²身体表面积。20至48小时前手术,患者接受BrdU IV政府超过30分钟的时间。灌注记录的开始和结束时间,以及手术切除前列腺的时间。切除前列腺被浸泡在福尔马林溶液,连续分为4毫米厚块,和石蜡包埋埋部分的准备(12]。从近端每个石蜡块表面,两个5微米部分被削减。一套5微米的部分从每一块与苏木精和伊红染色(圆))常规病理组织学检查。剩余的5微米部分用于免疫组织化学染色BrdU确认核合并。格里森的边界品位的肿瘤重点概述了在墨水)幻灯片和乙酸转移到地图生成的3 d电脑模型前列腺如前所述[13,14]。Biomorphometric数据包括multifocality、肿瘤体积,格里森组成、胶囊穿孔的3 d电脑模型提取每个RRP标本(14]。接下来,3套交替50 -分米和5微米部分被削减的近端表面每个石蜡块包含感兴趣的肿瘤倍增时间分析。每个5微米部分再次)染色和映射如上所述。这是必要的,以确定肿瘤的存在,因为他们通过块进展,并跟踪这些肿瘤转移的位置。每个50 -分米部分是圆)的顶部包含了肿瘤的幻灯片。后跟踪肿瘤到厚的边缘部分,肿瘤切除使用刀片。所有肿瘤的格里森评分。相对纯平滑肌也标志着和切除用作正常二倍体,为每个病人的前列腺癌生长缓慢的控制。我们定义增殖的肿瘤倍增时间的理论最大值倍增时间假设没有细胞死亡。切除组织处理如下。

2.1。Deparaffinization和补液

组织样本被放置在埃普多夫离心管和石蜡是被孵化与Americlear 3分钟(richard allan科学,卡拉马祖,MI)。样本离心机为2分钟389×g轻轻颗粒组织,和Americlear移除。的洗Americlear重复两次。剩余Americlear被从组织2的变化100%乙醇,轻轻涡流,和每个离心前孵化3分钟。组织在新鲜resuspended 100%乙醇(0.5毫升),添加蒸馏水是一滴一滴地,利用管间滴,慢慢再水化的最终体积1毫升(注意:如果组织包含残余Americlear,上层清液变得多云时添加的水,和需要额外的乙醇洗之前补液)。离心后,组织在蒸馏水洗一次,再离心,上层的移除。

2.2。胃蛋白酶消化

样本resuspended 1毫升0.5%胃蛋白酶在0.9%氯化钠(pH值1.5),和孵化为30分钟37°C, 15分钟后涡流。颗粒细胞离心后,上清液被和新鲜的胃蛋白酶补充道。悬架是用移液器吸取分解细胞碎片,然后孵化为30分钟37°C。涡流之后,一夜之间被允许继续消化样品在4°C。细胞被离心机和洗一次磷酸缓冲盐(PBS)和pH值7.4和一次蒸馏水,留下约150μL的上层清液在每个颗粒resuspend攻之前。

2.3。酸变性的DNA

慢慢涡流每个样本,1毫升的2 M盐酸triton x - 100添加一滴一滴地0.5%。如果增加过快,核溶解。样品在室温下培养了30分钟,离心机在389 g×5分钟,和中和1毫升0.1四硼酸钠,pH值8.5。PBS(1毫升)被添加到每个管,并通过35暂停运行μM细胞过滤器去除未消化的碎片。细胞被离心机和在PBS洗一次0.1%牛血清白蛋白和0.5% Tween-20 (PBS-AT)。

2.4。抗体染色

从每个样本删除大部分上层清液后,每个管的体积是调整到182.5μ与PBS-AT L, 87.5μL(每个被转移到新管双特异性的控制。BrdU检测,5μL鼠单克隆抗体anti-BrdU(克隆PrB1 FITC-labeled,凤凰流系统公司,圣地亚哥,CA)被添加到一组管,产生最终的抗体浓度为12.5μ100年g / mLμl .测量非特异性抗体染色,剩下的管子收到12.5μL FITC-labeled鼠标IgG1(克隆Dak-G01 Dako Corp . Carpenteria, CA)产生12.5μ100年g / mLμl .后轻轻搅拌,管是孵化为40分钟在黑暗中在室温(20分钟后混合),或在黑暗中一夜之间在4°C(搅拌1小时后)。样品在PBS-AT洗3次,每次在室温下孵化20 - 30分钟前离心法。这些孵化项目允许扩散释放的关键从变性DNA抗体。最终细胞颗粒resuspended 0.4毫升PBS 10μg / mL propidium碘和0.05毫克/毫升DNase-free核糖核酸酶a样本培养1 - 3小时4°C(受光)允许夹层propidium碘和任何剩余的RNA降解。

2.5。流仪分析

样本分析首次报道的红色和绿色荧光贝格et al。9]在Coulter XL流式细胞分析仪(Coulter-Beckman富勒顿,CA)。Listmode数据得到使用50000个细胞对于大多数样本,对小型肿瘤标本和至少10000个细胞。更仔细地分析了初始listmode所有文件随后使用Cytomation峰会软件(Cytomation Inc .)、柯林斯堡有限公司)来调整所有盖茨和统计区域。三个独立分析相同的listmode为每个样本数据进行,考虑到不同的盖茨和统计区域是如何绘制的。以下值收集从流仪直方图。

柱状图1(图1(一))
双重歧视是企图通过控制紧密G0 / G1, s阶段,G2 / M的人口。这是可能排除hypertetraploid细胞是否存在,以及对比。

柱状图2(图1 (b))
从这个柱状图得到了四种不同的测量:FG1, FG2 / M, FL,李。FG1估计红色荧光的程度(衡量模式而不是意味着)BrdU-negative G0 / G1的人口。BrdU-positive细胞被排除在测量。FG2 / M措施红色荧光BrdU-negative G2 / M(模式)的人口。FL措施的意思是红色荧光BrdU-positive细胞s阶段和G2 / M(排除G0 / G1)。标记指数测量所有BrdU-positive细胞的百分比。

可能翻倍计算每个样本被使用贝格等人的原始公式(9)、流量仪的值和之间的时间长度BrdU注入和前列腺癌的手术切除();

2.6。免疫组织化学染色BrdU和ki - 67

两组连续5微米部分从标本石蜡包埋块,用于免疫组织化学染色(包含IHC) BrdU和ki - 67 (15]。第一套5微米的部分在60°C烤箱烤1小时。老鼠充满BrdU牺牲和小肠收获作为组织控制。deparaffinization后,抗原检索在BORG执行解决方案,pH值9.5 (Biocare医疗、康科德,CA) 5分钟的显现室高压锅(Biocare)。幻灯片被放在工作台面在室温下5 - 10分钟冷却。内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢溶液10分钟。幻灯片在APK冲洗洗(1 x的解决方案,Ventana医疗系统,图森市AZ)。所有反应在室温下进行。测试幻灯片和积极控制在anti-BrdU孵化,1:10日(现场装备,BD生物科学,圣地亚哥,CA)湿室1小时。消极的控制与小鼠腹水孵化,1:500年(西格玛奥德里奇、圣路易斯、钼)。幻灯片在APK冲洗3次每次5分钟,然后进一步孵化Streptavidin-HRP的提供现场调湿室装备了30分钟。1毫升的混合物涂(diaminobenzidine)缓冲区和1滴轻拍色原是孵化的幻灯片5分钟。后来,民建联缓冲与去离子水漂洗干净。幻灯片是平衡含水1%乙酸,彩色的浅绿色科幻淡黄色5下降0.02%,回到了醋酸浴设置颜色。最后,幻灯片在分级醇脱水,二甲苯清理,安装与合成树脂。

包含IHC染色ki - 67进行第二组5微米部分。一只老鼠反人类的抗体ki - 67 (DAKO Carpinteria, CA M7240;1:300)是用来测量扩散的组织部分。抗原在BORG检索解决方案,pH值9.5 (Biocare医疗、和谐、CA、BDS1000G1)进行5分钟的Decloaker高压锅(Biocare)在125°C (psi) 22日。由Ventana孵化项目都完成一节(亚利桑那州图森市Ventana医疗系统)应用在37°C。Ventana我认为轻拍检测设备用于检测抗原通过通用二次抗体,streptavidin-horseradish过氧化物酶酶,民建联可视化。应用的部分被删除和复染色浅绿色科幻淡黄色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,L1886-25G;0.04% w / v) 10秒钟,迅速在分级醇脱水,二甲苯清理,安装与合成树脂。BrdU和ki - 67使用包含IHC染色计数测定积极染色细胞每1000细胞的数量。

3所示。结果

17岁患者的平均年龄为57.6±5.17年(范围44 - 66年),平均年龄58岁。前列腺体积的平均值为34.39±10.45 cc(范围17.17 - -54.34 cc),意味着肿瘤体积为1.62±3.34 cc(范围0.001 - -8.663 cc),和单独的肿瘤的平均数是2.6(范围1 - 8)。只有4/17的前列腺肿瘤足够大了流量仪分析。四个前列腺肿瘤biomorphometry数据流仪分析归纳在表格中使用1。的包含IHC染色BrdU和ki - 67的表2。的意思是BrdU和ki - 67为2.14±1.94%和6.18±4.27,分别。之间没有显著相关性BrdU和ki - 67(皮尔森相关系数,)。图2说明了格里森模式的显微照片3 PCa BrdU已经纳入5 - 7%的DNA分裂s阶段癌细胞。在格里森BrdU-incorporated细胞核的典型分布模式4腺体如图3。表3总结了流式细胞仪数据和从四个前列腺前列腺肿瘤。的意思是和前列腺肿瘤和匹配平滑肌控制(括号)分别为5.3±3.1%(2.5±0.28%)和58±27小时(224±318小时),分别。平滑肌在不同病人的变化从99年到636天。所有肿瘤范围从19到108天(0.6至3.6个月),他们翻倍2倍和25倍的速度比之间匹配平滑肌控制。

大型肿瘤PBr4-T1大约翻了一番2-3-times速度比小肿瘤PBr4-T2根据块的大型肿瘤样本被切除。例如,T1大约翻了一倍两倍T2当样本块H,但共产党连续翻番速度当采样块f .类似的翻倍速率变化观察PBr18-T2大肿瘤。在这种情况下,格里森模式3和4部分的T2块B和D翻了一倍两倍的格里森模式4部分相同的肿瘤块D .然而,小肿瘤PBr18-T1块B 1.5共产党连续翻了一倍速度比大肿瘤T2在剩下的两个标本块B和D (PBr6 PBr16),只有一个大肿瘤的报道,因为我们没有足够的细胞计数仪运行流分析相应的小肿瘤。还仅限于在PBr16-T1,分析肿瘤切除从只有两个街区(E、G)。对平滑肌标本之间保持相对恒定,但不同的肿瘤以及肿瘤内。PSA翻倍(PSA-DT)病人也被计算16),展示在表4相应的平均对于每一个肿瘤。即使在这个小的肿瘤样本分析,肿瘤相关的值是速度大大快于相应的PSA-DT观察每个病人。

4所示。讨论

我们已经开发了一个分析使用在活的有机体内formalin-fixed BrdU注入,石蜡包埋RRP标本通过流量仪分析评价。这是第一个建立一个报告在活的有机体内BrdU合并技术在formalin-fixed前列腺肿瘤和计算患者的前列腺癌。这个协议似乎准确估计翻倍与大鼠小肠组织控制是最快的(24 - 48小时)和人类前列腺平滑肌是最慢的。我们的数据表明,可以研究前列腺肿瘤的增殖活动的直接测量。我们的数据也表明有变化计算肿瘤根据肿瘤内取样。相似的变化中观察到一个特定的格里森评分以及在不同格里森成绩。这种可变性在前列腺肿瘤的增殖活动的规模和格里森模式可能是由于(a) block-to-block固定的变化,和(b)癌细胞的异构特性的multifocality这个特定的疾病。因为我们使用的平均值计算每个肿瘤部分连续三个样品,贡献由于可变性的方法与其他因素相比应该小。免疫组织化学染色证实BrdU已被纳入PCa分裂细胞的DNA。每个肿瘤有2%或更多的标记细胞,满足仪分析和流动计算。

17个病人,我们可以分析只有4名患者的肿瘤。大多数肿瘤很小(< 0.1 cc),因此我们不能将足够数量的50 -分米厚流仪分析组织部分。几家大型肿瘤被用来开发和完善流动仪的协议。这个小样本大小是我们研究的一个限制。

Nemoto分数等人研究了s阶段收集的患者的活检在活的有机体内BrdU公司(10]。活检与乙醇固定,嵌入在石蜡切片,染色,使用anti-BrdU单克隆抗体间接immunoperoxidase方法。由计算标记细胞的数量决定。他们展示了平均格里森年级3、2和1 PCa 4.37±0.48%, 2.41±0.49%,分别和1.36±0.39%。Haustermans等人也用乙醇固定患者的活检组织在活的有机体内合并和报告潜在的倍增时间从23到61天5患者前列腺肿瘤(11]。

在我们的研究中,意味着BrdU通过包含IHC染色为2.14±1.94%和流式细胞术5.3±3.1%。ki - 67细胞增殖也措施。Nagao等人发现,前列腺癌患者PSA > 4意味着ki - 6710.5±2.2%的15]。平均ki - 67在我们的研究中为6.18±4.27%。然而,我们没有发现任何BrdU和ki - 67之间显著相关。自取决于两个和(给出的公式,不可能建立直接联系和一个人。因此,单独的BrdU通过包含IHC或流式细胞术是不准确的预测因此肿瘤的生物潜能。我们的研究结果表明,BrdU的测量和计算通过流式细胞术使用formalin-fixed石蜡包埋前列腺可能是定量分析的潜在生物个体肿瘤。

施密德等人发现PSA-DT患者更快更高的阶段和等级(17,18]。他们发现20/28临床organ-confined癌症翻倍的利率超过4年,得出的结论是,前列腺肿瘤有一个常数(对数线性)增长速度非常缓慢。应该注意的是,男性与PSA水平4和10之间相对体积小临床局部肿瘤,PSA水平并不相关的肿瘤体积可能表明PSA水平在这些患者可能不是由肿瘤细胞本身,而是由其他良性过程等前列腺炎症和/或良性前列腺增生(19]。在我们的研究中,每个前列腺肿瘤总额为流式细胞术相对较大,因此选择PSA水平与肿瘤体积。为我们的患者PSA-DT 18.4 -32个月(552 - 960天)(16]。这种“明显”的缓慢增长PCa肿瘤间接评估从PSA倍增可能归因于伴随细胞死亡(凋亡)。因此,PSA-DT的细胞凋亡是一个重要的决定因素。尽管PCa细胞分裂速度,相对较高的凋亡率可能会导致净增长速度慢得多。然而,没有直接的方法来测量在活的有机体内凋亡率,PCa的细胞凋亡是从腺中删除。然而,明显的潜在的和激进的PCa之间生理上的差异可能是由于细胞死亡率的变化这些肿瘤多细胞增殖率。

5。结论

使用流仪测定在活的有机体内BrdU-infused, formalin-fixed石蜡包埋标本RRP是确定开发的前列腺肿瘤。4 PCa往往是相似的肿瘤体积或组织学分级无关。然而,肿瘤的速度比观察PSA-DT相应的病人。而缺乏对凋亡率的数据是本研究的限制,相对凋亡率的变化可能使潜在的和侵略性的PCa的区别,而不是。未来的研究需要关注肿瘤增殖以及凋亡率翻倍更好地理解潜在的生理差异与侵略性前列腺癌。

承认

作者想要恭敬地承认科学洞察力和对本文的贡献到加里·j·米勒博士在2001年去世。格兰特CA66161由美国公共卫生服务。提出了抽象的格式15^th国际前列腺癌更新维尔级联,科罗拉多州,2005年2月,AUA年会2005年5月,圣安东尼奥,德克萨斯州。