文摘

通过不同的病理细胞雌激素缺乏导致骨质流失事件。参与骨形成的脉管系统已被广泛研究,和H型脉管系统已经发现骨愈合密切相关。卵巢切除术(OVX)诱导雌激素缺乏降低H型血管密度和促进骨密度降低。OVX后早期事件的分析表明,雌激素缺乏优先诱发氧化应激,这可能会引起内皮功能障碍和减少血管生成因素系统和本地。血管潜在的不稳定性将促进骨质流失在雌激素缺乏症。P物质(SP)是一种内源性神经肽,在病理条件下控制炎症和防止细胞死亡。SP可以提高内皮细胞一氧化氮产量和抑制内皮功能障碍。本研究旨在调查系统的预防效果注射SP OVX-induced血管流失和骨质疏松症发作。SP是系统管理OVX大鼠4周,每周两次后立即OVX归纳。OVX条件可以减少抗氧化酶活性,H型血管,血管生成生长因子在骨髓,其次是炎症和骨质流失。 However, pretreatment with SP could block type H vessel loss, accompanied by the enrichment of nitric oxide and sustained angiogenic factors. SP-mediated early vascular protection inhibits bone density reduction. Altogether, this study suggests that early administration of SP can block osteoporosis development by modulating oxidative stress and protecting the bone vasculature and angiogenic paracrine potential at the initial stage of estrogen deficiency.

1。介绍

骨质疏松症是最常见的一种与年龄相关的代谢性骨病和一种多因子的紊乱,最终导致骨质流失。三分之一的女性和五分之一的男性50岁以上的将遭受由于骨质疏松骨折。女性更年期是骨质疏松症的主要原因。多达20%的骨质疏松发生在更年期。在这个区间的相对快速的骨质流失,骨质密度每年减少约0.5%。到80岁,女人失去了,平均大约30%的峰值骨量(1,2]。因为雌激素预防骨削弱通过减缓骨的自然分解,减少其在绝经期被认为有助于骨质疏松(3]。

有很多治疗方法可以防止骨质流失,包括磷酸盐、denosumab,与荷尔蒙相关的治疗。这些治疗方法主要是针对抑制破骨细胞激活和促进成骨细胞增殖。然而,他们并不理想治疗阻止疾病的发展和有严重的副作用,如背痛和海拔的血压。因此,治疗骨质疏松症的管理不断控制,根据病人的病情。

血管作为一个支持性的来源的间充质干细胞分化为成骨细胞(4- - - - - -6]。在骨骼发育和再生,移植骨的成骨前体细胞缺陷区域入侵血管[密切相关7]。老年性血管内皮功能下降已经清楚地观察到estrogen-deficient条件下(8,9]。因此,一个关键的角色在骨再生血管年龄人口普遍预计,对骨内稳态和angiogenic-osteogenic耦合被认为是至关重要的。

Angiogenic-osteogenic耦合是严格监管的特定的毛细管骨,称为一种H与高表达CD31 endomucin船(6,10]。众所周知,这些H型血管调节骨血管的生长,维持血管周围osteoprogenitors,提高骨(10,11]。H型血管周围的成骨的祖细胞表达转录因子osterix Runx2,促进骨形成(7]。H型血管内皮分泌生长因子密切相关的骨祖细胞的增殖和生存12]。因此,H型船只预计作为重要的推动者骨再生骨缺损处(7]。H型血管的密度是最丰富的年轻/生物和随年龄增长。的确,骨质疏松性条件显示缺乏H型船只的骨髓(BM)骨质疏松症的早期阶段。这表明,H型血管可以作为敏感的生物标志物骨量(6]。

血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长factor-BB (PDGF-BB)和狭缝指导配体3广泛调查在骨形成促进血管化的能力。他们大多是在血管细胞,以自分泌或旁分泌的方式发挥他们的作用。这些生长因子可以刺激内皮细胞,内皮祖细胞(EPC)和间充质干细胞迁移到血管新生和骨生成,导致H型船舶数量的增加和增强骨形成(11,13,14]。在骨质疏松动物模型与卵巢切除术(OVX)浓度的血清和BM PDGF-BB, VEGF和CD31嗨Endomucin嗨H型血管明显减少(15- - - - - -17]。在本地维护PDGF-BB在高浓度或者系统可以提高CD31嗨Endomucin嗨H型血管,导致骨体积的增加(11]。中断estrogen-regulated PDGF-BB信号在OVX报道导致微脉管扰动,毛细管稀疏,增加血管通透性,和异常的血管构造(18]。即雌激素缺乏可变态血管生成信号导致内皮功能障碍,伴有血管生成可溶性因子的缺乏。因此,保护可溶性factor-mediated血管生成信号是猜测通过提供血管稳定和促进骨生成干细胞参与下雌激素缺乏症。维护血管生成因素预计将需要保护的雌激素deficiency-induced应力下细胞来源。

血管潜在损失的确切机制由于雌激素缺乏是不清楚;然而,雌激素发挥抗氧化作用在内皮调节NADPH氧化酶(NOX)表达和过氧化物生产(19]。此外,雌激素诱导生成一氧化氮(NO)通过一种蛋白激酶的激活和内皮一氧化氮合酶(以挪士)20.]。不负责积极调节血管张力,血管生成,有丝分裂发生和内皮炎症的发生。因此,雌激素的缺乏可能导致失衡自由基或活性氧(ROS)和抗氧化剂通过过多的活性氧积累和没有的生物利用度低,导致细胞死亡和炎症。精益等人证实,OVX条件改变ROS的生成和抗氧化防御能力的细胞,导致活性氧的积累,刺激生产的肿瘤坏死因子(TNF)α在大英博物馆OVX诱导后的早期阶段(21,22]。综上所述,雌激素缺乏是引起氧化应激,导致细胞损伤和炎症,其次是骨质流失。

抑制氧化应激细胞损伤,ROS的产生应该限制从雌激素缺乏的早期阶段。然而,活性氧的来源不同,其生产是由复杂的细胞反应。因此,完全控制体内活性氧的生产是很困难的。很少有研究调查了直接行动的抗氧化剂在骨细胞的活动23]。此外,雌激素受体的表达是减少老年人/绝经状态,表明弱有效性补充外源性雌激素的24,25]。因此,激活细胞survival-related信号或没有浓缩的早期阶段后雌激素损失预计将是战略保护血管细胞和组织免受氧化应激。

尽管氧化应激和血管损伤的重要性在骨质流失,时间调查分析氧化应激的发生,血管功能障碍,和骨质流失目前稀缺。如果雌激素deficiency-mediated病理事件分析了随着时间的推移,治疗的目标可以发现,用来阻止骨质疏松症的发展。

P物质(SP)是一种内源性神经肽能够刺激干细胞动员、增殖,和保护内皮细胞氧化应激和炎症,伴随着生产(26- - - - - -31日]。在先前的研究中,SP管理OVX动物过度炎症和降低骨质密度评价SP的抑制作用在额外的骨质流失。SP可以减轻骨质密度降低,调节调节性T细胞和抑制炎症的发展OVX动物(17]。此外,SP治疗升高VEGF的生产和PDGF-BB干细胞在体外和体内在糖尿病和非糖尿病患者伤口模型(26,27,32,33]。因此,SP OVX-induced后的早期应用雌激素损失是推断,以防止骨质疏松的发病可能通过丰富NO /血管生成因子和保护OVX大鼠的血管构造。

本研究探索的发展发生氧化应激,血管损伤,炎症,使用OVX和骨质疏松动物模型和评价SP的预防效果,神经肽,血管潜在损失和骨量OVX动物通过分析血清/ BM吸入生化标记,体内组织的组织学、骨密度和评价SP的保护作用BM-derived内皮祖细胞在体外对氧化应激。

2。材料和方法

2.1。诱导的骨质疏松症

六个雌性的雄性SD (SD)大鼠中(160 - 170克)是购自双(Daehan生物链接,首尔,韩国)。所有的动物都被安置在一个动物圈养的房间在普通光/暗周期。所有的动物喂养一个标准的食物的饮食。本研究的实验动物伦理委员会批准的庆熙大学医院(批准文号:khmc - iacuc e18 - 009, khmc - iacuc - 22 - 011)。

1周后适应时期,骨质疏松症是诱导如前所述17]。简单地说,雌性SD大鼠使用腹腔注射氯胺酮麻醉(100毫克/公斤,女士,首尔,韩国)和Rompun(1.2毫克/公斤,拜耳医疗、Kyunggi-do、韩国)。在手术部位的头发被和一个2厘米的皮肤切口两边的腹部。periovarian脂肪组织和卵巢后退出,卵巢的结扎,以丝绸和删除。两边的肌肉和皮肤缝合3 - 0丝绸。老鼠被随机分成三组:(1)虚假的,(2)OVX +生理盐水,(3)OVX + SP。

2.2。SP管理

SP (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在生理盐水稀释(JW制药,首尔,韩国)立即使用前和管理为4周每周两次静脉注射剂量的5 nmol /公斤。盐被用作控制车辆。

2.3。测量骨密度使用来自体内的微型电脑断层扫描(μ- ct)

SD大鼠的股骨收获扫描使用μ- ct扫描仪(Skyscan 1173 x射线microtomography;美国力量,Billerica的)的分辨率13.85μm评估骨质疏松的程度,如前所述[17]。总之,三维重建后,骨密度、骨体积分数,和骨小梁空间干骨后端地区使用CT分析软件进行了计算。

2.4。组织学分析

股骨是孤立和固定在3.7%甲醛(Sigma-Aldrich)。样本脱钙除去石灰质的解决方案(Sigma-Aldrich)和处理TP1020组织处理器(徕卡生物系统,位于德国)准备石蜡块,和5.0μ米厚的部分做好准备的话。三色的染色,NovaUltraTM马森三色的染色工具(包含IHC世界,伍德斯托克,医学博士,美国)使用。免疫组织化学染色,VECTASTAIN ABC工具包或ABC-AP装备(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)是使用。简单,制成冻干样本煮0.01 M柠檬酸钠(Sigma-Aldrich)抗原检索。阻断内源性活性氢过氧化物酶,样品处理0.5% H2O2。接下来,样本permeabilized Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)为0.3%。阻止非特异性结合的抗体,样本2%正常孵化马血清1 h在室温下(RT),然后处理主要抗体CD31, endomucin。样本孵化与生物素化的二次抗体1 h RT,其次是孵化avidin-biotin复杂的解决方案。蓝色底物溶液,ImmPACT束射功率管或向量(矢量实验室),用于可视化反应区域组织。最后,样本与快速复染色红(向量实验室)。

2.5。蛋白质的提取和免疫印迹分析做准备

股骨活检刷新了磷酸盐(PBS;WELGENE、大邱、韩国)三次,离心机在1500 rpm(362克)为5米。上层清液被隔离为细胞因子分析和细胞颗粒(骨髓吸入物、BMA)裂解处理缓冲区(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)和2毫米PMSF(罗氏、巴塞尔、瑞士)。细胞溶解样品在12000 rpm离心机为10米(13572克),和上层的收集。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸蛋白质分析工具包(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。蛋白溶解产物分离使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝基(通用电气医疗集团,Amersham,英国)或聚乙二烯二氟化物(美国纽约笼罩公司)膜。膜被5%的脱脂牛奶(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)包含牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)然后孵化主要抗体CD31, 3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH;Abcam,剑桥,英国),以挪士,p-eNOS(细胞信号技术),其次是anti-immunoglobulin G辣根peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。膜是用EZ-Western光民Pico (DoGenBio,首尔,韩国)或西星埃塔超2.0加元(Cyanagen、博洛尼亚、意大利)。

的表达水平进行了分析和量化使用ImageJ软件(版本1.52)。

2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)

VEGF浓度、PDGF-BB白介素- 10 (IL)(研发系统,明尼阿波利斯,美国),和TNF -α(美国圣地亚哥BioLegend Inc . CA)在血清和BM用ELISA测定根据制造商的指示。光密度测量在450 nm使用EMax端点ELISA标(分子器件、桑尼维尔,美国)。

2.7。测定超氧化物歧化酶(SOD)活性

骨髓吸入物(BMA)和PBS由冲洗大英博物馆,和总蛋白质是孤立的。SOD活性BMA的老鼠决心用SOD活性测定工具包(Abcam)。BMA的蛋白质溶解产物混合WST和酶工作的解决方案。在37°C 20 m,孵化后吸光度测量在450 nm使用EMax端点标(分子设备)。

2.8。测量的浓度

没有在BMA的数量测量使用格里斯试剂系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。样本添加到井和孵化与磺胺解决方案10 m rt,接下来,N-1-napthylethylenediamine盐酸盐的解决方案是添加到井和孵化10 m rt,光密度测量在540 nm使用EMax端点标(分子设备)。没有被量化的浓度。

2.9。BM-EPC文化

人类BM单核细胞(BM-MNCs)获得干细胞技术(加拿大温哥华)。BM-derived跨国公司被播种在培养皿中涂有人类纤连蛋白(Sigma-Aldrich)和培养的内皮生长媒体2 (Lonza、巴塞尔、瑞士)。媒介改变了一次交替的一天。BM-derived内皮祖细胞融合亚文化在80%。检查SP在EPC氧化应激的保护作用,SP(最终浓度:100海里)被添加到EPC两次每隔30分钟,然后处理300μ过氧化氢(H2O28小时)。使用SP在EPC氧化应激的影响测定。

2.10。统计分析

所有数据了 偏差。 被认为是具有统计学意义。统计分析的数据进行了使用未配对,双尾学生的 - - - - - -测试。

3所示。结果

3.1。雌激素缺乏导致血管丧失,其次是骨质流失

检查血管损伤和骨质疏松的发生OVX感应后,OVX诱导和骨密度的变化和H型船在大英博物馆是8周postinduction监控。OVX-induced雌激素缺乏促进体重的增加,和一个明显的区别是观察到4周post-OVX感应(图1(a))。分析骨密度的微ct显示骨质密度降低在8周,4周和没有明显变化(数据1(b)和1(c))。矿渣MTC染色显示,骨结构减少,脂肪组织增加,明显在8周(数字1(d)和1(e))。这是与ct机的数据一致。

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图1
卵巢切除术(OVX)造成债券损失和H型船的缺乏。(a)大鼠体重的变化在0、4、8周post-OVX归纳。(b, c) ct机的骨密度测定分析量化0,4,8周postinduction。(d)原理图的骨头干骨后端地区的微环境。马森(e)代表图像的三色的(MTC)。表达CD31 (f)和endomucin股干骨后端地区(g)是由包含IHC染色。虚线表示生长板和干骨后端之间的界限。酒吧规模:100μm。(h i)量化CD31强度和endomucin染色。(j, k)免疫印迹分析CD31表达在BMA 0, 4, 8周postinduction。GAPDH是用作定量分析内部加载控制和规范化。值是 偏差(SD), ,和 。BV:骨小梁体积;电视:组织体积;BS:骨表面;n。:不重要。

检查在OVX大鼠血管损伤,H型血管检查。H型血管被确定在特定的位置,主要是在附近的干骨后端生长板(图1(d))。

H型血管内皮的强烈endomucin和内皮细胞表面标记CD31阳性。组织学分析显示,CD31的损失+或endomucin+附近的血管生长板(黑色虚线)显然是发现在4周,相对应的条件正常骨密度(数字1(f)和1(g),补充图1)。CD31染色强度或endomucin量化(数字1(h)和1(我))。Endomucin表达血管内皮和造血干细胞。因此,蛋白质水平的检测与整个BM endomucin送气不适合推断H型血管密度。因此,为表达CD31免疫印迹分析BM吸入物,表现出过度的减少从4周post-OVX感应(数字1(j)和1(k))。

这个结果表明,OVX原因CD31的不足+和endomucin+H型船在4周post-OVX感应,然后从8周postinduction引起骨密度降低。

3.2。雌激素缺乏导致血清中血管生成生长因子的减少和BM,然后创建系统性炎症升降TNF -α和减少il - 10

血管损失预计将发生因为血管成分不稳定的细胞由于血管生成生长因子不足或过度的炎症。如图1观察,减少H型船在4周post-OVX归纳。接下来,炎症和血管生成因素分析系统和本地。检查炎症条件、il - 10、抗炎细胞因子,tnf,血清中促炎细胞因子、量化使用ELISA。改变在il - 10的水平和TNF -α血清中很少发现在4周,但变化显然是观察8周,降低il - 10和TNF -增加α(数据2(一个)和2 (b))。IL-17骨质流失的一个至关重要的炎症因素,在8周也升高,但不是在4周后OVX感应(补充图2)。这些数据表明系统性炎症的发生条件,这可能与骨质流失的起始8周post-OVX归纳。相比之下,VEGF浓度和PDGF-BB代表血管生成生长因子,4周后明显降低,这种差异在8周(数字增加2 (c)和2 (d))。考虑到8周post-OVX感应的特征明显骨质流失和炎症,血管生成因素的系统性损失估计之前发生炎症和降低骨质密度。

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图2
OVX创建缺乏血管生成潜力和促炎的条件。大量的il - 10()、肿瘤坏死因子-α(b)、VEGF (c)和PDGF-BB (d)在血清0,4,8周postinduction用ELISA测定。VEGF (e)的数量,PDGF-BB (f)在BM 0, 4, 8周post-OVX感应使用ELISA测定。值是 , ,和 。n。:不重要。

确定血管生成因素的水平在大英博物馆的环境中,大英博物馆的VEGF和PDGF-BB检查使用ELISA(数字2 (e)和2 (f))。降低VEGF和PDGF-BB水平被发现在4周post-OVX感应,与血清水平一致。

这些数据暗示OVX感应创建一个血管生成factor-deficient环境分别在4周内局部和全身,引起炎症条件的8周内OVX归纳。血清中血管生成因素和BM不足被认为是参与H型血管在大英博物馆的损失。这个早期阶段预计将促进骨质疏松症的发展。

3.3。SP块治疗血管生成潜在的损失由保护血管因素和H型血管后早期OVX归纳

探讨保护性SP对血管生成的影响潜力和骨量,SP是静脉注射OVX大鼠4周,然后,血清和血管生成/炎症因素分析了BM, H型血管和骨质量(图3(一个))。早期治疗与SP减轻体重的增加(图4周3 (b))。在这个时候,没有发生明显的骨质流失,随之而来的SP治疗对骨密度的影响很少观察到(数字3 (c)和3 (d))。这是通过组织学分析(图确认3 (e))。血管生成因子,VEGF和PDGF-BB减少OVX感应,但SP治疗明显抑制他们的降低血清和BM(数字3 (f)- - - - - -3(我))。四个星期post-OVX感应,系统性炎症没有被激怒,和周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗并不影响它的条件(数据3 (j)和3 (k))。评估H型密度BM、CD31或endomucin表达评估(图4)。正如预测的那样,OVX感应CD31的密度降低+或endomucin+H船只类型(数据4(一)- - - - - -4 (c))。SP治疗阻止H型船只消失在大英博物馆4周post-OVX归纳。SP-mediated内皮保护被确认使用CD31表达的免疫印迹(数字4 (d)和4 (e))。

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图3
系统性SP管理防止血管生成生长因子的损失由于OVX在4周内。(一)实验方案OVX和周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗。SP是静脉注射4周每周两次。盐被用作车辆控制。(b)大鼠体重的变化在4周评估。(c, d)的骨密度ct机分析量化4周post-OVX感应。(e)的代表图片马森股骨的三色的染色。酒吧规模:100μm。VEGF (f)的数量,PDGF-BB (g)、肿瘤坏死因子-α(j),用ELISA检测血清中il - 10 (k)。VEGF的含量(h)和PDGF-BB (BM i)由ELISA测定。值是 SD, , ,和 。BV:骨小梁体积;电视:组织体积;BS:骨表面;n。:不重要。
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SP治疗块H型船的缺乏OVX-induced障碍。(一)代表的图像包含IHC染色CD31和endomucin股干骨后端区域。虚线表示生长板和干骨后端之间的界限。酒吧规模:100μm。(b, c)量化endomucin和CD31染色强度。(d, e)免疫印迹分析CD31表达使用BMA 4周进行。GAPDH是用作定量分析内部加载控制和规范化。值是 , , 。

共同管理的SP 4周减轻OVX-mediated血管损失由丰富血管生成生长因子和H型脉管系统。

3.4。SP救援H型船然后块骨质流失

系统性管理SP能维持血管生成可能通过阻断血管生长因子和H型的损失在雌激素缺乏症。接下来,我们检查是否SP-enhanced血管生成骨量的潜在抑制有关。

SP是注入OVX动物为4周,然后,OVX动物没有额外的维持治疗,直到8周。八周post-OVX感应,生长因子,血管和骨质量检查(图5(一个))。

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SP的早期治疗可以抑制血管生成生长因子的损失和改善全身炎症8周post-OVX归纳。(一)实验方案OVX和周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗。SP 4周每周两次静脉注射,并停止直到8周post-OVX归纳。盐被用作车辆控制。(b)在8周大鼠体重的变化post-OVX归纳。肿瘤坏死因子的数量α(c), il - 10 (d), VEGF (e), PDGF-BB (f)血清ELISA测定。大量VEGF (g)和PDGF-BB (h) BM ELISA测定。值是 , , ,和 。

在8周OVX增加了体重,这是高于4周。然而,早期治疗与SP缓解这种变化在8周post-OVX感应(图5 (b))。符合之前的数据,8周后OVX感应全身炎症造成提升TNF -α和降低il - 10(数据5 (c)和5 (d))。OVX-induced炎症是逆转通过SP治疗4周后立即OVX归纳。血管生成因子,VEGF和PDGF-BB拒绝过度在8周post-OVX感应(数字5 (e)- - - - - -5 (h))。

然而,SP治疗持续相当水平的血清VEGF和PDGF-BB和BM。SP的这种影响血管生成/炎症水平的可溶性因子在8周是归因于SP治疗4周后OVX归纳。八周post-OVX感应是4周,第二天最后注入SP。因此,这种效应的SP可能是级联反应的结果影响的细胞/组织SP OVX感应后4周。

H型血管的分布分析了大英博物馆(图6)。CD31+或endomucin+H型血管迅速消失在4周的OVX条件,及其在8周趋势加剧。然而,SP注射保护H船只OVX-induced压力(数据类型6(一)- - - - - -6 (c))。BMA CD31表达的分析也证实了SP在大英博物馆内皮的影响(数据6 (d)和6 (e))。更重要的是,SP-mediated早期血管保护抑制骨质疏松(图发展7)。组织学分析证实SP-mediated抑制骨质疏松(图7(一))。ct机分析显示,SP-treated OVX大鼠骨体积和数量显示高于saline-treated OVX大鼠(数字7 (b)- - - - - -7 (f))。这个结果证实了发现系统性管理SP可以保留OVX受损的血管生成潜能,和保护血管早期能够阻止骨质流失维持骨质密度的发展类似于non-OVX控制。

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早期保护H型船的SP有助于保存在8周post-OVX H型船。(一)代表的图像包含IHC染色CD31和endomucin股干骨后端区域。虚线表示生长板和干骨后端之间的界限。酒吧规模:100μm。(b, c)量化endomucin和CD31染色强度。(d, e)免疫印迹分析CD31表达BMA的8周post-OVX归纳。GAPDH是用作定量分析内部加载控制和规范化。值是 , , 。
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SP-mediated血管保护降低骨密度降低。马森(a)代表图像的三色的染色(MTC)股干骨后端区域。酒吧规模:100μm。(b)代表股的图像μCT(氟)。定量分析股骨的骨小梁分数的8周post-OVX归纳。值是 , , ,和 。BV:骨小梁体积;电视:组织体积;BS:骨表面;结核病。N:小梁数;结核病。SP:小梁分离。
3.5。SP治疗调节氧化应激通过增强SOD活性,没有生产

本研究表明,SP治疗抑制血管生成因子的缺乏和H型OVX大鼠血管。然而,目前尚不清楚如何SP保护血管。氧化应激是ROS的生成条件超过了抗氧化防御系统的能力。氧化应激可能发生由于过剩的活性氧,抑郁的抗氧化能力,或这些因素的结合34- - - - - -37]。不受控制的ROS水平可以减少没有生物利用度诱导以挪士解偶联、促进过氧硝酸盐生成,导致细胞凋亡。相比之下,没有减少活性氧积累通过抑制SOD失活。因此,没有和ROS作为互惠的抑制剂。雌激素诱导活性氧积累,减少生产损失,导致氧化应激。

损失H型血管观察4周post-OVX归纳。研究氧化应激在大英博物馆的发展环境OVX感应后,SOD活性和浓度测定使用BMA 3和4周post-OVX归纳。

SOD活性和任何水平往往在一定程度上减少3周post-OVX感应,但是差异没有统计学意义(数字8(一个)和8 (c))。在4周post-OVX感应,这对应于H型血管密度减少,SOD活性和含量明显减少,表明氧化应激的发生(数字8 (b)和8 (d))。这个变化是更清楚地观察8周后OVX感应(补充图3)。SP OVX诱导治疗4周后导致没有水平,增强SOD活性升高,而参与OVX组(数字8 (e)- - - - - -8 (g))。治疗,SP NO-enriched创造条件和提高抗氧化活性在大英博物馆4周post-OVX归纳。

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周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗可以减少氧化应激在4周post-OVX由于雌激素缺乏。SOD活性在BMA测量3 (a)和4 (b)周post-OVX感应。没有测量浓度BMA的格里斯试剂系统3 (c)和4 (d)周。(e)实验方案OVX和周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗。SP是静脉注射4周每周两次。盐被用作车辆控制。没有浓度(f)和SOD活性(g)在BM 4星期post-OVX感应测定。

这些数据揭示氧化应激细胞的风险被认为超出了3周,实际上细胞损伤发生在4周后OVX归纳。考虑的关键作用在血管和炎症,SP-induced H型保护可能发生通过足够的一代没有和恢复SOD活性雌激素缺乏的早期阶段。

3.6。SP支持细胞生存与氧化应激,伴随着浓缩的体外

本研究证实了早期发生氧化应激OVX大鼠的大英博物馆。氧化应激可以影响不同细胞的生存,包括内皮细胞居住在大英博物馆。周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗将阻止氧化应激并保存在大英博物馆OVX小鼠H型血管,如图4和8。骨的血管似乎形成主要由血管生成和血管生成10,38]。

接下来,我们检查了SP是否能保护BM内皮祖细胞在血管形成中发挥作用在体外氧化应激。SP是对待EPC,过氧化氢加入产生过多的活性氧积累8 h(图9(一个))。SP治疗的时间指的是由体内SP。正如预测的那样,过氧化氢治疗8 h减少细胞生存方式存在剂量依赖的相关性,最后浓度是确定为300年μ米,大约80%的细胞生存能力(补充图4)。ROS-induced减少细胞生存能力与SP(图被预处理9 (b))。此时,以挪士磷酸化并没有减少过氧化氢生产治疗,但SP-pretreated细胞保持以挪士磷酸化和浓度高于参与细胞(数字9 (c)- - - - - -9 (e))。换句话说,与SP预处理可以减轻损失的不存在氧化应激,这可能有助于提高EPC生存。

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图9
SP块细胞氧化应激损伤的丰富。(一)实验方案SP和H2O2治疗人类骨髓(BM)中内皮祖细胞(epc)。盐被用作车辆控制。为了研究SP在EPC对氧化应激的保护作用,SP了EPC两次每隔30米,然后,H2O2治疗8 h。(b)细胞的可行性BM-EPCs被WST试验测量。(c)没有浓度BM-EPC条件培养基被格里斯试剂测量系统。(d, e)免疫印迹分析p-eNOS和t-eNOS BM-EPCs。GAPDH是用作内部加载控制。值是 , , ,和 。

4所示。讨论

雌激素缺乏导致氧化应激和炎症。大多数研究雌激素deficiency-induced骨质疏松症主要集中在改善炎症促进破骨细胞活化在大英博物馆,评估治疗的疗效的骨质密度(39- - - - - -42]。考虑到需要几周或几个月观察系统性炎症和骨丢失在一个动物OVX模型中,这些可能涉及骨相关细胞/组织事件发生2或3个月后OVX归纳。然而,找到一个时间窗口,以防止疾病的发作,初始事件后雌激素不足,必须进行分析。

与年龄相关的早期控制免疫/生理反应可以预防许多疾病的进展。血管功能的维护的关键可能是降低绝经后骨质疏松症和心血管老化的风险。值得注意的是,osteoprogenitors优先相关H型毛细血管的干骨后端由于内皮细胞产生的各种生长因子(43- - - - - -45]。血管生成/旁分泌潜能和H型血管受损的早期阶段后骨质疏松归纳。因此,H型容器管理的诱导促进增加H型血管的骨缺损部位可能是一个有前途的治疗方法以防止骨质疏松症的早期发病(7,44]。

改善H型船只在雌激素的缺乏意味着增强活动/血管内皮细胞的生存estrogen-mediated细胞保护的缺失。雌激素可以抑制活性氧的生产通过调制氮氧化物和升降没有生成增加以挪士的表达和活性。因此,氧化应激可以被认为是细胞功能受损的主要原因和生存在雌激素缺乏症。换句话说,雌激素损失废除细胞抗氧化防御,这可能加剧损失的H型脉管系统通过创建过多的活性氧。因此,保护H型血管对氧化应激有望必不可少的后续骨(46,47]。

目前的研究显示,在OVX条件下,血管生成潜在损失发生前炎症和骨密度降低。H型血管不足和缺乏血管生成生长因子明显观察到4周post-OVX感应,这对应于完整的骨骼结构没有系统性炎症。此时,观察抗氧化剂体系的崩溃,合理降低SOD活性和浓度在大英博物馆的环境中。这证实,雌激素缺乏引发氧化应激的发生在4周内,和这种情况可能影响血管内皮细胞的生存和功能在大英博物馆。

全身治疗与SP 4周保持血管可能通过维持血管生成生长因子,VEGF和PDGF-BB和H型血管密度,导致抑制骨质流失。因此,SP-mediated血管保护调节骨缺损的程度。这强调的作用在骨骼结构的维护血管的潜力。

SP保护细胞免受氧化应激在体外细胞死亡(29日,30.]。在这项研究中,SOD活性,没有水平的改变由于OVX感应显然是由SP治疗逆转。足够的生物利用度的有利影响内皮功能和抑制SOD失活(48,49]。因此,SP-induced浓缩不得明显有助于维护H型脉管系统由于雌激素缺乏在氧化应激。恢复SOD活性在8周观察SP post-OVX感应,但其效果是猜测不能归因于SP(补充图的直接行动5)。

用BM-EPC体外实验表明,SP的应用导致了持续的细胞生存ROS的存在。在这种情况下,SP-treated细胞没有更高的浓度比未经处理的细胞。这可能是一个SP的细胞机制是有效的。关键的干预是SP治疗进行了OVX感应后4周每周两次,然后停止,直到8周。氧化应激和保存的早期调制SP的脉管系统抑制骨质疏松的发病。这意味着SP的早期应用雌激素后立即授予OVX的功效。

此外,骨质疏松症是减少SP和提升NK-1R水平的表达在大英博物馆的环境中,但不是在血液中(50,51]。我们之前发现SP浓度下降和NK-1R表达升高在BM在8周后骨质疏松感应(17]。在这项研究中,我们发现了一个缺陷在NK-1R SP和增加表达4周post-OVX感应(补充数据6 - 8)。这个环境表明缺乏SP-NK-1R动态信号在大英博物馆的环境下骨质疏松性压力。体内注射SP可能达到BM和施加影响28,52]。因此,可以推断,SP管理可能会弥补OVX大鼠SP不足。总之,本研究揭示了SP的保护机制对骨质疏松的氧化应激控制和保护血管。SP调节氧化应激保护血管的潜力,导致堵塞严重的骨质流失。周效磺胺-乙胺嘧啶的治疗可能是一个可行的方法治疗骨缺损的针对H型血管,和治疗绝经后骨质疏松症应立即开始申请,可能改善数以百万计的妇女的生活。此外,雌激素损失导致许多与年龄相关的疾病涉及血管功能障碍。SP体内血管疾病的疗效为未来的研究是一个有趣的话题。为了使用SP作为药物,SP带来的意想不到的影响取决于其剂量应考虑和短半衰期也要检查的关键(28]。SP的毒性评价临床前完成(53,54),但政府SP前应考虑的时间管理。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前的研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

所有作者读了《华尔街日报》的作者协议和政策上的利益冲突。所有作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

DK,摩根大通、JSP、DYH, DHL, HSH执行所有实验和解释数据。DK, DHL, HSH起草和定稿的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Doyoung金姆和济源朴的贡献同样这项工作。

确认

本研究支持的技术创新项目(或工业战略技术开发计划- 1415179737)(20018551)资助的贸易、工业和能源(MOTIE、韩国)和研究基金公司从简单的星球。

补充材料

补充图1:CD31免疫染色的BM OVX大鼠。OVX在SD大鼠诱导。4和8周后,股骨固定和染色anti-CD31抗体检测H型船。白色虚线:生长板。补充图2:量化的IL-17 OVX大鼠的血清。OVX在SD大鼠诱导。4和8周后,血清分离,然后分析IL-17 ELISA。 小于0.05的值被认为是统计学意义( )。数据表示为 偏差(SD)的三个独立的实验。补充图3:检查血清中SOD、GPX OVX大鼠。OVX在SD大鼠诱导。4和8周后,血清分离,然后分析了SOD (A)和GPX (B)的活动。 小于0.05的值被认为是统计学意义( )。数据表示为 偏差(SD)的三个独立的实验。补充图4:测定H2O2浓度对氧化应激在EPC。BM-derived EPC与H培养2O28 h,然后,细胞生存能力由WST-1分析决定。 小于0.05的值被认为是具有统计学意义 。补充图5:检查血清中SOD、GPX OVX大鼠。OVX诱导SD大鼠中,SP的尾静脉注射4周。在8周后OVX感应、血清分离,然后分析了SOD (A)和GPX (B)的活动。 小于0.05的值被认为是统计学意义( )。数据表示为 偏差(SD)的三个独立的实验。补充图6:量化的SP OVX大鼠的血清和BM。OVX在SD大鼠诱导。在4和8周后OVX感应、血清和BMA被孤立。SP浓度由ELISA决定。 小于0.05的值被认为是统计学意义( )。数据表示为 偏差(SD)。BM:骨髓。补充图7:量化BM的SP OVX大鼠。OVX在SD大鼠诱导。在4和8周后OVX感应,股骨是孤立的,在福尔马林固定。一paraffin-sectioned BM示例是SP染色。棕色:活性区。补充图8:量化BM的NK-1R OVX大鼠。OVX在SD大鼠诱导。在4和8周后OVX感应,股骨是孤立的,在福尔马林固定。一个paraffin-sectioned BM NK-1R样本染色。 Brown color: reactive area.(补充材料)