文摘
顺铂耐药性是一个关键因素影响卵巢癌患者的生存率,但卵巢癌顺铂耐药性的主要机制仍不清楚,这可以防止最优使用顺铂治疗。蛆提取(我)是用于中药患者昏迷和胃癌患者当结合其他药物治疗。在这项研究中,我们调查是否我增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。两个卵巢癌cells-A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP-were体外接受顺铂和我。SKOV3 / CDDP细胞稳定表达荧光素酶是皮下注射或腹腔内注入BALB / c裸小鼠建立异种移植模型,其次是我/顺铂治疗。在顺铂的存在,我治疗有效地抑制的生长和转移在体内和体外有顺铂耐药性卵巢癌。RNA-sequencing数据显示HSP90AB1和IGF1R A2780 / CDDP细胞明显增加。我治疗显著降低HSP90AB1和IGF1R的表达,从而增加p-p53 proapoptotic蛋白质的表达,伯灵顿,和p-H2AX,而相反的凋亡蛋白BCL2效果观察。一半寿命抑制腺苷三磷酸酶是有益的对卵巢癌治疗在我面前。反过来,HSP90AB1超表达有效抑制的效果我在促进凋亡蛋白的表达增加蛋白质和DNA损伤反应SKOV3 / CDDP细胞。 Inhibition of cisplatin-induced apoptosis and DNA damage by HSP90AB1 overexpression confers chemoresistance in ovarian cancer. ME can enhance the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin toxicity by inhibiting HSP90AB1/IGF1R interactions, and this might represent a novel target for overcoming cisplatin resistance in ovarian cancer chemotherapy.
1。介绍
卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最致命的癌症之一,复发率高1,2]。越来越多的证据表明,卵巢癌患者的存活率很低,部分原因是后期诊断在一个高级的阶段,缺乏治疗的一线治疗,和耐药性3]。卵巢癌的标准治疗方案是积极的手术切除的组合,以铂为基础的化疗4]。顺铂是一种广泛使用的铂化合物,是卵巢癌的一线化学治疗剂,导致肿瘤细胞死亡主要是通过诱导细胞DNA损伤(5,6]。然而,内在或顺铂耐药性的获得是一个重要因素导致化疗的疗效下降(7,这仍然是一个重大的挑战由于贫穷的理解负责肿瘤转移的分子机制和药物抗性8]。近年来,大量研究表明,药物抗性涉及不同的免疫耐受等机制,药物靶点的突变和异常DNA损伤和修复系统9- - - - - -11]。的相关问题顺铂治疗,中医已经成为广泛接受作为替代治疗癌症(12,13,本研究旨在确定中药能有效提高卵巢癌顺铂化疗的敏感性。
蛆虫,在中医称为“吴顾庄”的幼虫Lucilia sericata在中国,一种绿头苍蝇发现(14]。先前的研究在蛆虫表明他们的排泄物、分泌物能有效抑制多种炎症反应介导的中性粒细胞,包括趋化作用、脱粒、呼吸爆发,和增强的整合素表达(15]。越来越多的证据表明,蛆疗法优于常规治疗,特别是治疗伤口感染的耐药细菌(16,17]。此外,蛆提取(我)结合其他药物已被证明是有利于患者昏迷和胃癌患者18]。然而,我的机制抑制肿瘤和癌细胞的凋亡尚未完全阐明。
热休克蛋白90(一半)是一种高度保守的分子伴侣蛋白稳定和激活各种蛋白质(19),最近的研究表明,atp酶活性的一半对一半的女伴周期至关重要机械(20.]。一半一半寿命α和β一半寿命是两个主要的亚型出现在胞质中,他们都支持蛋白质的正确折叠,稳定蛋白质结构,并参与细胞信号转导和转录调控21,22]。一半α,B类,成员1 (HSP90AB1)是一种癌基因激活的关键推动者和癌细胞生存,因为HSP90AB1女伴机械在癌细胞可以防止大量的突变和过表达致癌蛋白错误折叠和降解23]。然而,抑制癌细胞会导致广泛的退化的HSP90AB1致癌蛋白(24,25]。增加HSP90AB1强烈的表达与肿瘤转移相关的由于其能力来维持一个integrin-linked激酶的活性,伴侣粘着斑激酶,受体酪氨酸激酶ErbB2 C-met(肝细胞生长因子受体)26,27]。此外,HSP90AB1超表达的过程中发挥着不可或缺的作用在增加胃癌细胞对化疗药物的耐受性,其负面影响病人的预后(24]。
胰岛素样生长因子(igf)是涉及肽激素的几种类型的癌症的发展(28,29日]。IGF信号系统由四个components-insulin, IGF1 IGF2和胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)。三个细胞membrane-spanning receptors-insulin受体IFG1受体(IGF1R)和IGF2受体(IGF2R) [30.)治疗IGF信号。IGF1R的表达和活动在许多肿瘤类型增加,包括卵巢癌和横纹肌肉瘤(31日]。最近的研究表明,IGF1R的发展与多种人类恶性肿瘤结肠直肠癌和胰腺癌等(32,33),和分子和临床证据表明,IGF1R增殖起着重要作用,肿瘤细胞的迁移、血管生成、细胞凋亡(34]。之前的研究表明,核IGF1R与其他重组DNA修复途径有关,和IGF1R抑制可以减少同源修复和延迟的分辨率γH2AX焦点(35]。此外,核IGF1R的表达在肿瘤已被证明是在化疗和放疗抵抗36]。此外,最近的一项研究报道,含硫的亲核试剂谷胱甘肽(GSH)和核金属硫蛋白可以结合顺铂和灭活的药物,从而增加耐药性(37,38]。
最近的研究表明,血管生成和癌症转移与增加HSP90AB1和IGF1R表达在许多实体肿瘤(24,39,40),在这项研究中,我们探讨了潜在的相互作用HSP90AB1 IGF1R在卵巢癌组织和可能调解顺铂耐药性卵巢癌细胞系。此外,我们检查我是否可以调节HSP90AB1 / IGF1R交互,以克服顺铂耐药性和诱导卵巢癌细胞凋亡。因此我们的研究可能提供新的见解对卵巢癌的治疗策略。
2。方法
2.1。我准备
蛆粉获得江苏分子医学重点实验室,南京大学。我匀浆是由添加四卷的PBS然后离心法在15000 g×10分钟。上层清液的收集和孵化在70°C水浴30年代随后在15000 g×10分钟再次离心。上层清液收集,经过0.22μ美国米过滤器(微孔)(14]。
2.2。卵巢癌细胞培养
人类卵巢癌细胞株A2780 (RRID: CVCL_0134)从上海购买Pituo生物科技有限公司有限公司(中国)和细胞SKOV3 (RRID: CVCL_0532)从Solarbio购买科技有限公司有限公司(中国)。有顺铂耐药性卵巢癌细胞株A2780 / CDDP (RRID: CVCL_D619)和SKOV3 / CDDP (RRID: CVCL_D622)从希伯来文名字购买文化集合(BNCC)(中国)。A2780和A2780 / CDDP rpmi - 1640年培养基培养(美国Gibco)包含10%的边后卫(Gibco), 100 U /毫升的青霉素和链霉素的100 U /毫升(Gibco)。SKOV3和SKOV3 / CDDP在DMEM培养基培养(Gibco)包含10%的边后卫(Gibco), 100 U /毫升的青霉素和链霉素的100 U /毫升(Gibco)。顺铂(1μg / mL)添加到媒介有顺铂耐药性细胞系维持抵抗。所有与mycoplasma-free细胞实验研究。
2.3。RNA-Seq数据分析
从A2780和A2780 / CDDP细胞总RNA提取使用RNA Miniprep工具包(Beyotime,中国)根据制造商的指示。下一代测序分析进行bgiseq - 500由华大基因研究院基因组服务平台。原始数据包含低质量的读取,大量未知的基地,和适配器的顺序。减少数据噪声,我们进一步过滤这些下游分析之前读取。首先,RNA-seq图书馆质量评估使用快速v0.11.5质量控制软件。然后读取受到标准的质量控制标准。过滤后的阅读被认为是“干净”,存储在FASTQ格式。标准生物信息学基因差异表达分析包括火山情节,热量地图,和基因本体论(去)和KEGG通路分析,所有这些都是由华大基因研究院基因组服务。建立了差异表达肿瘤靶蛋白相互作用网络使用字符串数据库。所有的数据已经上传到GEO数据库(GSE206649)。
2.4。荧光素酶报告实验
细胞被播种在6-well盘子和慢病毒颗粒感染表达荧光素酶(GeneChem、上海、中国),和HitransG P细胞融合后添加到生长介质达到50%。72 h后,细胞表达荧光素酶被放大,然后播种在96 -孔板。最后,细胞治疗4μg / ml嘌呤霉素筛选细胞表达荧光素酶。
2.5。慢病毒载体制备和感染
HSP90AB1慢病毒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin在人类细胞中表达降低购买从GeneChem(上海,中国)。SKOV3 / CDDP细胞被播种在6-well盘子,当细胞融合达到50%,感染了慢病毒颗粒的细胞72 h。
2.6。细胞生存能力分析
所有的细胞系被播种在96孔板( 细胞/)。第二天,细胞治疗与不同浓度顺铂72 h或与我48 h。细胞生存能力是衡量使用细胞计数Kit-8 (CCK8、A311-02-AA Vazyme生物技术,中国)。孵化的试剂2 h后,吸光度在450 nm决心使用标。
细胞表达荧光素酶,我们把细胞为3.2μg / ml顺铂或不同浓度的我48 h。细胞生存能力是衡量GloMax®96微型板块光度计(美国E6521)使用生活图像软件(983磅NC100,德国)。
2.7。愈合试验
A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞( 细胞/)被播种到12-well盘子。80%的融合,这些细胞被刮10μl无菌吸管,然后用PBS洗。挠细胞进一步培养与顺铂或顺铂和我另一个48 h。图像被抓获的48 h在倒置显微镜下(Mshot,中国),和伤口闭合率测量和分析图像J。
2.8。Transwell入侵检测
细胞入侵检测进行了使用24-well transwell板(8.0μ米孔隙大小;美国默克密理博)。A2780和A2780 / CDDP细胞被播种的上院24-well transwell板块在200年μL rpmi - 1640中含有2%的边后卫和室底部充满了500μL完整的rpmi - 1640中含有10%的边后卫。细胞被分为四个groups-blank,顺铂,我,顺铂+我。顺铂和我添加到参议院,和细胞迁移48 h。细胞被洗,用甲醇固定,沾10%吉姆沙染色剂(Solarbio,中国)10分钟。入侵细胞在膜的底部拍摄使用一个倒置显微镜(Mshot,中国)。所有的实验进行了一式三份。
2.9。膜联蛋白V-FITC /π化验
A2780 / CDDP被播种在24-well板的密度 细胞/好,在完全培养基培养24小时。接下来,用顺铂治疗细胞,我,或者对72 h。双膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯/ propidium碘(FITC / PI)绑定试验是用于检测细胞凋亡(Beyotime C1062L,中国),并使用一个细胞拍摄奥林巴斯激光扫描共焦显微镜(FV3000)。
2.10。流式细胞术分析
A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞被播种在6-well板的密度 细胞/ 24小时,然后处理3.2μg / ml顺铂或6毫升/ mg或8毫克/毫升的我或者对72 h。所有的细胞都收集在一个流管和双膜联蛋白染色V-FITC /π。凋亡细胞的比例不同群体使用流式细胞仪分析仪器(流式细胞仪石中剑,双相障碍,美国)。
2.11。谷胱甘肽(GSH)测定
所有的细胞被播种在12-well盘子和3.2处理μg / ml顺铂,6毫克/毫升我,或为48 h。收集细胞,然后用PBS两次洗净用200 W的3 s 10共30年代间隔周期。离心后,上清液收集和储存在4°C。与谷胱甘肽细胞谷胱甘肽含量检测分析设备根据制造商的指示(Solarbio生命科学,中国)。
2.12。体内异种移植模型
六个雌性BALB / c裸小鼠( )从南京Junke获得重16 g是生物技术公司。老鼠被安置在一个温度和湿度特定的无菌环境(江苏分子医学重点实验室),12 h光/暗周期。
一半的老鼠皮下注射 SKOV3 / CDDP细胞(100μL(生理盐水)到侧面,而另一半的小白鼠腹腔注射 SKOV3 / CDDP细胞(100μL(生理盐水)。注射后七天,小鼠麻醉和腹腔内注射D-luciferin(150毫克/公斤体重),然后10分钟后成像数据与生活图像获取和分析软件(磅983 NC100,德国)。老鼠被随机分为四组(con,独联体,我,独联体+我, 为每个组)。顺铂组的小鼠腹腔注射5毫克/公斤顺铂每周4周;老鼠在我组有1克/公斤我口头为4周每周3次;和老鼠在独联体+我组。5周的细胞接种后,小鼠麻醉和腹腔内注射D-luciferin(150毫克/公斤体重),10分钟后,成像数据被生活图像获取和分析软件(磅983 NC100,德国)。然后老鼠安乐死评估肿瘤负荷,收集和肿瘤分子分析。
2.13。免疫荧光
A2780 / CDDP细胞被播种到12-well板与圆玻璃。用顺铂治疗后,我,或者两者兼有,这些细胞被固定,permeabilized Triton x - 100, 0.3%和3% BSA阻塞。细胞培养与抗体p-p53(英国Abcam)一夜之间在4°C。荧光的细胞被孵化二级抗体室温为1.5 h,和核与DAPI复染色(Beyotime,中国)30分钟。使用一个奥林巴斯激光扫描共焦显微镜图像拍摄(FV3000)。
2.14。免疫组织化学
肿瘤是固定的,嵌在石蜡,免疫组织化学染色法对幻灯片进行处理。肿瘤部分与特定的抗体染色Ki67(1: 250稀释,Abcam,英国)和CD31(1: 100稀释,Abclonal,中国)。部分随后被孵化的HRP-conjugated二级山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L),使用光学显微镜和图像捕获(德国徕卡微系统)。
2.15。免疫印迹
细胞溶解产物在12% sds - page凝胶电泳分离,和蛋白质转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国默克密理博IPVH00010)然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C。接下来,探讨了膜与适当的二次抗体1.5 h。这些墨迹可视化使用化学发光检测(Vazyme生物技术,中国)和J软件分析图像。加载与GAPDH规范化。
2.16。实时定量PCR(存在)
从组织和细胞总RNA提取使用RNA Miniprep工具包(Beyotime,中国)根据指令,和互补脱氧核糖核酸合成逆转录工具包(Vazyme生物技术,中国)。SYBR绿色PCR反应混合液(Vazyme,中国)是用于分析相对基因表达和执行中存在ABI Viia 7实时PCR系统(美国ABI)。β肌动蛋白作为内部控制,引物如表所示1。临界阈值周期(Ct)值确定为每个反应,这是使用2转换为相对量化数据-ΔΔCt方法。
2.17。Coimmunoprecipitation
SKOV3 / CDDP细胞溶解产物第一次免疫沉淀反应和抗体HSP90AB1, IGF1R,或isoform-matched免疫球蛋白(免疫球蛋白),然后是immunoprecipitants被西方墨点法化验IGF1R抗体和HSP90AB1。
2.18。统计数据
所有统计分析GraphPad棱镜7。比较两组统计学意义的评估使用的小动物——一张长有学生的学习任务。多个组之间的差异使用单向方差分析计算图基的事后测试紧随其后。一个值< 0.05被认为是统计学意义,所提出的所有数据都从至少三个独立的实验。
3所示。结果
3.1。我增强卵巢癌细胞的敏感性与顺铂药物抗性
A2780 A2780 / CDDP、SKOV3和SKOV3 / CDDP细胞与不同浓度的顺铂治疗验证卵巢癌细胞的耐药性。结果表明,顺铂浓度对应于50%的细胞生存能力A2780和SKOV3细胞4.0μ和3.1克/毫升μ分别g / ml。正如所料,顺铂浓度对应于50%的细胞生存能力A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞7.8μg / ml和16μg / ml,分别为(数字1(一)和1 (b))。此外,我们对待A2780 / CDPP和SKOV3 / CDDP细胞与我调查是否我顺铂卵巢癌细胞处于敏感状态。相对应的顺铂浓度50%的细胞生存能力A2780 / CDPP和SKOV3 / CDDP细胞2.0μ和6.5克/毫升μg / ml,分别与我相结合治疗(数字1(一)和1 (b))。我们的研究结果表明,我治疗可以显著提高chemoresistant卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.2。我结合顺铂治疗促进细胞凋亡和抑制Chemoresistant卵巢癌细胞的迁移
肿瘤药物抗性是卵巢癌治疗的一个主要问题。进一步调查是否我可以克服卵巢癌治疗药物抗性,我们治疗卵巢癌细胞与我和/或顺铂。SKOV3 / CDDP细胞与慢病毒转染表达荧光素酶和分析使用生活图像软件和GloMax®96微型板块光度计。我们第一次筛查luciferase-expressing细胞使用嘌呤霉素(补充图1)。结果表明,细胞生存能力明显减少我和联合顺铂组相比,顺铂治疗仅在有顺铂耐药性和非耐药结核杆菌细胞(图1 (c))。我们下一个分析细胞凋亡率使用膜联蛋白V /π化验。流式细胞术分析A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞与顺铂治疗显示细胞凋亡与空白组相比增加了1/2。正如所料,A2780 / CDDP细胞凋亡率和SKOV3 / DDP我和顺铂治疗5倍和10倍大,分别比空白组(图1 (d))。荧光共焦显微镜的结果与流式细胞术结果一致(补充图2)。
进一步确认我可以增强顺铂敏感性chemoresistant卵巢癌细胞的表达p-p53 A2780 / CDDP细胞分析使用immunofluorescent染色,显示与我和显著增加顺铂和高于我独自或顺铂治疗(图1 (e))。伤口愈合试验表明,顺铂对迁移的影响很小A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞(图1 (f))。然而,我单独或结合顺铂治疗显著抑制移植A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞。我治疗的抑制作用结合顺铂对细胞迁移更明显(图1 (f))。transwell试验表明,我结合顺铂有效抑制入侵A2780细胞。此外,我结合顺铂治疗显著地抑制入侵A2780 / CDDP细胞更有效地比顺铂或我独自处理(图1 (g))。总的来说,这些结果表明,我结合顺铂可以克服药物抗性,诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞的迁移。
3.3。我治疗抑制体内有顺铂耐药性卵巢肿瘤的生长
因为我们观察到,我对有顺铂耐药性细胞有显著的抑制作用,我们进一步建立了异种移植模型通过皮下或腹腔内注射SKOV3 / CDDP细胞BALB / c裸小鼠,然后跟我把老鼠,顺铂,或两者兼而有之(图2(一个))。SKOV3 / CDDP细胞稳定表达荧光素酶被用于检测小鼠肿瘤生物荧光成像。肿瘤细胞接种后一周,分析生物荧光成像,然后治疗组腹腔注射顺铂,intragastrically管理我,或者治疗(数字2 (b)和(c))。luciferase-positive地区治疗5周后,治疗后明显减少和我结合顺铂,但不是与顺铂或我独自处理(数据2 (b)和2 (c))。此外,从皮下异种移植肿瘤模型的大小和重量明显减少和我结合顺铂(数字2 (d)- - - - - -2 (f)和补充图3),我的肿瘤生长速度结合顺铂治疗组明显低于其他群体(图2 (g))。腹腔内注射肿瘤细胞主要是殖民小肠,脾,胃(图2 (h)和补充图3B)。我们接下来分析Ki67和CD31表达在有顺铂耐药性肿瘤使用免疫组织化学染色,而这些在我孤单,我明显下调与顺铂治疗组(图相结合2(我))。这些发现表明我治疗可以提高卵巢癌对顺铂的敏感性,可以抑制肿瘤的生长和转移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.4。相关性和富集分析HSP90AB1 IGF1R的卵巢癌细胞的RNA序列
揭示背后的分子机制在卵巢癌药物抗性的发展,差异表达基因(度)分析确定之间的基因表达差异A2780和A2780 / CDDP细胞。通过RNA序列(RNA-seq),总共45573892生读取自A2780和A2780 / CDDP细胞。清洁和质量控制后,清洁读取次数减少为进一步分析44482827年和44710年.501读取,分别。6166度(| |褶皱变化> 2 )发现A2780和A2780 / CDDP cDNA库,其中3037基因调节(A2780 / CDDP细胞高表达),3129个基因表达下调(A2780 / CDDP细胞低表达)(图3(一个))。这个结果表明A2780细胞之间的巨大差异基因表达和chemoresistant A2780 / CDDP细胞。我们进一步探讨潜在的分子功能基于前1038度使用phyper函数R软件执行富集分析。我们执行度的细胞成分分析。我们发现度明显在细胞质丰富,膜,细胞骨架(图3 (b))。此外,KEGG路径分析表明浓缩和相声的47个基因在癌症通路(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
识别小说调节基因与顺铂耐药性有关,十小说显著调节的基因被确定A2780 / CDDP细胞相比A2780细胞(图3 (d))。特别是,的表达IGF1R和CDKN2A在A2780 / CDDP细胞超过20倍高于A2780细胞,和存在的结果分析与这个发现(图一致3 (d)和补充图4)。IGF1R和CDKN2A蛋白与细胞生长和死亡有关。值得注意的是,HSP90AB1卵巢癌的预后标志物,高度表达A2780和A2780 / CDDP细胞(图3 (d))。识别潜在的互动伙伴HSP90AB1,人类蛋白质相互作用网络分析使用字符串执行数据库(图3 (e))。HSP90AB1可能与IGF1R的数据显示,这也与癌症细胞生长和死亡(图3 (e))。此外,IGF1R也可能与MYC交互。与此一致的是,的mRNA水平MYC和HSP90AB1作为分析QPCR显著增加(数据3 (f)和3 (g))。这些研究结果强烈支持的假设卵巢癌药物抗性与HSP90AB1和IGF1R的过度。
3.5。我治疗变弱HSP90AB1 / IGF1R通路,抑制DNA损伤修复有顺铂耐药性细胞
进一步探索我的机制提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,免疫印迹,存在进行化验检查癌症通路的表达上面的因素进行了分析。结果表明,HSP90AB1的表达,IGF1R, IGFBP2 A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞显著大于A2780和SKOV3细胞(数字4(一)- - - - - -4 (d))。与此一致的是,在有顺铂耐药性细胞中谷胱甘肽水平也显著增加(数据4 (e)和4 (f))。此外,我们与顺铂治疗的细胞,我,或者两者兼有,和癌症通路的表达因素评估,包括HSP90AB1 IGF1R, p-H2AX, MYC和PTEN。的mRNA水平MYC,HSP90AB1,IGF1R明显减少了我治疗A2780 / CDDP细胞(数据吗4 (g)- - - - - -4(我)),我和治疗结合顺铂的mRNA水平进一步降低MYC,HSP90AB1,IGF1R(数据4 (g)- - - - - -4(我))。,与此同时,原癌基因的蛋白表达BCL2 IGF1R, HSP90AB1大大减少了我结合顺铂A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞。正如预期的那样,我治疗显著增加PTEN蛋白表达和p-H2AX A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞(数字4 (j)- - - - - -4(米))。此外,我治疗减少谷胱甘肽的含量A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞,和我结合顺铂(数据有更强的影响4 (n)- - - - - -4 (o))。在一起,这些结果说明我治疗压抑的卵巢癌细胞的药物抗性衰减HSP90AB1 / IGF1R信号通路和允许顺铂诱导的DNA损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
(n)
(o)
3.6。一半寿命抑制atp酶活性增强的抑制效率我Chemoresistant细胞
调查是否HSP90AB1 / IGF1R轴的途径我改善顺铂耐药性卵巢癌细胞,我们一半寿命与geldanamycin细胞预处理抑制腺苷三磷酸酶活性与顺铂治疗之前和我。我们测量细胞凋亡率使用的膜联蛋白V /π化验,和流式细胞仪分析显示,细胞凋亡率geldanamycin A2780 / CDDP细胞治疗组与顺铂治疗组相比明显增加。然而,geldanamycin治疗本身没有对SKOV3 / CDDP细胞的细胞凋亡率的影响,但它的细胞凋亡率显著增加A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞的存在我顺铂,流式细胞术分析(图做了演示5(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
进一步确认我可以通过针对HSP90AB1增强顺铂敏感性,细胞表达荧光素酶用geldanamycin预处理,其次是顺铂和我的治疗方法,然后分析了细胞使用生活图像软件和GloMax®96微型板块光度计。后一半寿命抑制腺苷三磷酸酶活动geldanamycin A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞,细胞生存能力大幅减少,这是进一步减少我和顺铂治疗(数字5 (b)和5 (c))。伤口愈合试验表明,geldanamycin治疗抑制A2780的迁移/ CDDP和SKOV3 / CDDP细胞。此外,后一半atp酶活性,抑制伤口闭合率跟踪我结合顺铂是显著降低SKOV3 / CDDP细胞(数字5 (d)和5 (e))。此外,免疫印迹分析表明,HSP90AB1和IGF1R的表达明显减少一半寿命后抑制腺苷三磷酸酶活动A2780 / CDDP和SKOV3 / CDDP细胞。一半寿命后抑制atp酶的活动,我和顺铂治疗有顺铂耐药性细胞进一步抑制HSP90AB1的蛋白表达,IGF1R、BCL2。相反,p-H2AX的蛋白表达,p-p53和伯灵顿显著增加(数据5 (f)- - - - - -5(我))。此外,我们进行免疫沉淀反应化验,发现HSP90AB1身体与IGF1R有关。此外,一半寿命抑制atp酶活性下降HSP90AB1 IGF1R协会(数据5 (j)- - - - - -5(米))。这些发现表明,与IGF1R HSP90AB1形式复杂,顺铂耐药性的原因一半寿命,抑制腺苷三磷酸酶活动增强了我治疗的效果在增加chemoresistant卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。
3.7。HSP90AB1过度抑制ME-Enhanced在卵巢癌细胞对顺铂的敏感性
进一步评估HSP90AB1的影响对我的影响增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,我们过表达HSP90AB1使用慢病毒SKOV3 / CDDP细胞。HSP90AB1过度后,细胞的生存能力明显大于负控制与我结合顺铂治疗后(图6(一))。同样,流式细胞术分析细胞SKOV3 / CDDP overexpressing HSP90AB1显示下降的速度相比凋亡晚期负控制跟踪我治疗(数字6 (b)和6 (c))。揭示了免疫荧光试验,我治疗可以显著负控制细胞中表达下调IGF1R的表达而不是HSP90AB1 overexpressing细胞(图6 (d))。HSP90AB1超表达谷胱甘肽的量明显增加,这没有明显减少了我或者我和联合顺铂治疗(图6 (e))。此外,HSP90AB1超表达的抑制作用显著降低我的表达IGF1R BCL2,而相反的影响观察的抗癌蛋白p-p53,伯灵顿,p-H2AX(数字6 (f)和6 (g))。总的来说,这些数据表明我治疗卵巢癌细胞对顺铂的敏感性增加通过抑制HSP90AB1表达,从而抑制增殖,入侵和卵巢癌细胞的迁移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4所示。讨论
卵巢癌是妇科癌症死亡率高,和大多数卵巢癌患者体验传统治疗后复发伴随着化学抗性(41]。抵抗化疗是治疗失败的主要原因在卵巢癌。在这项研究中,我们发现,我是一个有效的辅助治疗,增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性和耐药性。的我被证明有良好的效果在卵巢癌的逆转药物抗性,这也可能是在其他癌症。测序分析显示,HSP90AB1和IGF1R异常调节在耐药卵巢癌细胞。作为一个中医,我可以防止卵巢肿瘤,导致DNA损伤诱导卵巢癌细胞凋亡抑制HSP90AB1 / IGF1R。一半的抑制腺苷三磷酸酶活性与geldanamycin进一步增强我有顺铂耐药性卵巢癌细胞的抑制作用。反过来,HSP90AB1超表达的慢病毒有效抑制增强顺铂敏感性卵巢癌细胞的我。因此,抑制HSP90AB1 cisplatin-induced DNA损伤的超表达的是一个重要的原因抗卵巢癌化疗,和我可以通过抑制HSP90AB1逆顺铂耐药性。
大多数化疗药物通过破坏肿瘤细胞的基因组DNA。然而,耐药癌细胞可以克服这种DNA损伤通过激活替代修复机制(42]。RNA序列结合生物信息学分析显示HSP90AB1和IGF1R两种已知耐药性基因,在A2780 / CDDP细胞(图3),我们发现HSP90AB1促进IGF1R表达式在卵巢癌细胞(图6 (f))。一半的超表达家庭成员一直在与疾病进展相关的许多人类恶性肿瘤,一半家庭的一员,HSP90AB1在人类疾病中扮演多个角色由于它与各种各样的蛋白质43,44]。最近,一半α和一半β已经被证明是由肿瘤细胞分泌受到各种应力条件如缺氧、DNA损伤,和生长因子刺激45- - - - - -47]。此外,HSP90AB1被报道参与肿瘤发生,和超表达HSP90AB1已经被证明可以促进血管生成,转移,癌细胞的分化48,49]。因此,减少HSP90AB1耐药卵巢癌细胞的表达可能促进这些细胞凋亡中发挥有效的作用。
我是防止细菌感染和癌症(50]。蛆疗法提供了各种蛋白水解酶降解的坏死组织在伤口愈合51),越来越多的证据表明,蛆虫治疗优于传统方法,特别是用于治疗伤口感染耐药细菌(16,17]。我们先前的研究报道,我减轻炎症,氧化应激,激活Nrf2和纤维化,减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎——[14,52]。然而,我生物疗法在癌症的机理仍然不太为人所知。我们目前的研究表明,抑制HSP90AB1我提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,这表明抑制HSP90AB1我贡献在卵巢癌细胞DNA损伤和细胞凋亡。因为这项研究是第一个探索我的效果和机制增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,可能存在一定的局限性。因为我是一个不适合的粗提取液静脉或皮内注射,为便于量化,我们交付MEs intragastrically老鼠。本研究中使用的我是幼虫可溶性混合物的蛆虫,这是本研究的一个限制。未来的研究与净化我组件应该为我们提供精确的生物活性元素,赋予对卵巢癌顺铂耐药性的治疗效果。
先前的研究已经报道,耐药性相关的潜在机制的抑制细胞凋亡,肿瘤干细胞的失调,表观遗传修饰,以及自噬的诱导,缺氧,DNA损伤和修复(4,53]。许多癌症细胞,如卵巢癌细胞、抗凋亡、DNA损伤,导致药物抗性(54]。p-H2AX是DNA双链损伤的标记蛋白(55),我们评估的表达p-H2AX调查是否引起的DNA损伤抑制HSP90AB1过度顺铂耐药性。DNA损伤标记蛋白p-H2AX展出进一步提升表达式HSP90AB1-inhibited在存在顺铂和我。最近的研究表明,化疗可以激活DNA损伤,激活的细胞DNA损伤和修复可能有助于抵抗药物毒性和产生耐药性56,57]。我们发现HSP90AB1抑制增加cisplatin-induced DNA损伤。反过来,HSP90AB1过度SKOV3 / CDDP细胞中谷胱甘肽的量增加,导致顺铂的失活。这些结果表明,HSP90AB1减少表达的增加cisplatin-induced DNA损伤,从而提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性毒性。
5。结论
我们的数据表明,HSP90AB1超表达的过程中中扮演着重要的角色在卵巢癌顺铂耐药性。顺铂的存在,我抑制了HSP90AB1-IGF1R互动,从而促进DNA损伤和细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。因此我们的研究结果表明小说对我的作用机制。HSP90AB1是一种新的分子标记和可能作为一种新的药物化疗耐药性卵巢癌化疗的目标。
缩写
| 我: | 蛆提取 |
| CCK8: | 细胞计数kit-8 |
| HSP90AB1: | 热休克蛋白90 kDaα,B类,成员1 |
| IGF1R: | 胰岛素样生长因子1受体 |
| IGFBP2: | 胰岛素样生长因子结合蛋白2 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| PI: | Propidium碘化 |
| DAPI: | 4 ,6-diamidino-2-phenylindole |
| sds - page: | 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| p-p53: | 磷酸化p53 |
| 度: | 差异表达基因 |
| RNA-seq: | RNA序列 |
| 走: | 基因本体论 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| CDKN2A: | 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2 a |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| PTEN: | 磷酸酶和tensin同系物。 |
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
伦理批准
所有动物实验按照机构的指导方针的动物保健和南京大学的制度研究动物委员会批准。
的利益冲突
作者宣称没有利益存在竞争。
作者的贡献
DJW导致实验设计、文献研究、调查方法,实验性能、数据采集、统计分析,起草了手稿。XT导致实验设计、文献研究、调查方法,实验性能、数据采集、统计分析,并提供资金。JGR导致实验设计、文献研究、调查方法,实验性能,数据采集和统计分析。RW, ZQZ YJW、YLZ TYW参与动物实验,文献研究,调查方法和数据分析。YH、HWW和zz参与实验设计的指导和文学研究。XKW有助于怀孕和协调研究和审查的手稿。GJT YW导致怀孕和协调研究,提供资金,和回顾手稿。所有的作者阅读和批准最终的手稿。Daojuan王荀唐,建国阮贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(81971346)和(82003077),中国的博士后研究基金会(2021 M701676),江苏融资项目优秀博士后人才(2022 zb684),江苏委员会的计划卫生部门(H2019070),南京的关键程序委员会的卫生部门(ZKX20023)。作者欣然承认BGI RNA-sequencing基因组服务服务。
补充材料
补充1。补充图1:卵巢癌细胞稳定表达荧光素酶。这些细胞被感染了慢病毒颗粒来表达荧光素酶。A2780 / CDDP (A)和SKOV3 / CDDP细胞(B)与不同浓度的嘌呤霉素治疗验证荧光素酶的转染效率。细胞的生存能力是化验使用CCK8包。
补充2。补充图2:我结合顺铂治疗促进A2780 / CDDP细胞的凋亡。A2780 / CDDP细胞接受顺铂(3.2μ我和g / ml)(6毫克/毫升)48 h。A2780 / CDDP细胞双沾膜联蛋白V-FITC和π。细胞凋亡的细胞成像检测使用一个FV3000奥林巴斯显微镜。
补充3。补充图3:我结合顺铂治疗有效地抑制卵巢脾脏肿瘤的生长和转移。(一)裸小鼠皮下注射SKOV3 / CDDP细胞接种皮下肿瘤。从每个治疗组小鼠的照片所示。(B)从每组腹腔内肿瘤的小鼠脾脏拍照观察脾脏肿瘤大小。
补充4。补充图4:IGF1R的mRNA水平和CDKN2A A2780 / CDDP细胞高于A2780细胞。IGF1R的mRNA水平(A)和CDKN2A (B)在A2780和A2780 / CDDP细胞中存在试验进行了分析。三个独立的实验也得到了类似的结果。数据显示为 。 。