文摘
粪食性增长具有重要意义,发展和繁殖性能的兔子。本研究旨在探索粪食性的影响繁殖性能的新西兰白兔通过粪食性预防(CP)。结果表明,CP治疗显著降低的增长和发展表现女性兔子和胚胎的活产率。血液生化指标的结果表明,CP治疗明显增加血清铝青铜的内容,高山,血清MDA, SOD活性明显下降。转录组分析显示,条款主要是浓缩在运输CP治疗后功能和生殖功能。此外,KEGG结果表明,相关信号通路被激活和炎症基因的表达水平与紧密连接相关蛋白表达下调了CP治疗。同时,免疫印迹进一步证实KEGG的结果。简而言之,粪便喂养是一个重要的生存策略对于一些小型啮齿动物,粪食性预防会影响身体的炎症水平,改变身体的氧化应激水平,然后激活NOX4-ROS-NF -κB途径,增加粘附蛋白的表达水平ICAM-1 VCAM-1,导致子宫上皮屏障的破坏,然后影响到兔子的繁殖性能。
1。介绍
粪食性指捕食动物粪便的行为,这是非常常见的中小型非人灵长类动物(1,2]。粪食性行为是一种营养的适应策略对中小食草动物低质量食物。一方面,粪食性有助于恢复和建立动物肠道微生物群,另一方面,它可以为主机提供生长发育所需的能量和营养。(2- - - - - -5]。肠道菌群是主机和互利增长和发展中发挥着重要作用,繁殖,免疫调节等生理功能的主机(6- - - - - -8]。肠道微生物群,粘液屏障、上皮屏障、免疫屏障构成肠道屏障保持肠道内稳态(9]。肠道内稳态的破坏会导致炎症性肠病(IBD),肠易激综合症(IBS),结肠直肠炎症、癌症和其他疾病(10- - - - - -13]。因此,肠道微生物群已被视为必要的“免疫器官”对人类和动物生存和保持健康14]。此外,肠道可以与各种器官通过一个复杂的神经内分泌免疫网络,形成一个类似于“轴”的关系,也就是说,内脏器官轴(15]。
肝脏是第一个收件人的肠道代谢产物,接受小膳食营养代谢物(如氨基酸和短链脂肪酸)和其它小分子代谢物被肠粘膜吸收(16- - - - - -18]。同时,肝脏可以分泌胆汁酸肠。大多数这些胆汁酸回肠的吸收,通过门静脉回到肝脏,然后分泌胆管。这个过程称为肝肠循环(19,20.]。这些之间的双向连接小肠和肝脏是肠道微生物群和肝脏轴之间的桥梁,是重要的结构性基础肠肝轴调节动物的营养代谢和免疫(21- - - - - -24]。胆汁酸的肠肝循环是一个关键因素之间的交互小肠和肝脏(25,26]。胆汁酸调节身体的代谢途径和炎症反应通过Farnesoid X受体(FXR)和G蛋白耦合胆汁酸受体1 (Gpbar1或TGR5) [27]。肠道菌群与胆汁酸在两个方向26]。胆汁酸影响肠道菌群的组成,形成肠道免疫和一些内源性抗菌特性(28]。肠道菌群可以胆汁酸代谢成次级胆汁酸,所以肠道菌群组成的变化会打破平衡初级胆汁酸和次级胆汁酸在体内,从而促进肝病的进展(29日,30.]。此外,肠道屏障能有效地防止肠道微生物和新陈代谢所产生的有害物质进入肝脏。当肠道屏障受损,肠道中的有害物质侵入肝脏和参与肝脏及相关器官疾病的发生和发展(18,31日- - - - - -34]。而肝脏的功能对孕产妇繁殖性能也有重要影响。雌鸟的排卵过程将伴随着生产大量的活性氧ROS。随着年龄的增加,SOD活性会逐渐减少,这将导致活性氧的不断积累,进一步导致卵泡闭锁,直接导致卵巢功能的下降35- - - - - -37]。因此,氧化应激是女性生殖性能的下降的一个重要原因(38,39]。
我们研究小组的先前的研究结果表明,CP引起微生物群在兔子的盲肠的内容的变化,减少脂质在肝脏代谢,影响生长性能(40- - - - - -42]。歌等人证明了兔子的繁殖不利影响预防粪食性的主要角色扮演的这种反应CTSB卵巢颗粒细胞的(43]。此外,有研究报道,CP能引起胎儿发育不良在怀孕的老鼠44]。的频率和摄入排泄物怀孕和哺乳喂养老鼠的显著增加,表明粪食性行为在怀孕期间营养意义(45]。然而,粪便摄食行为的影响机制对宿主生殖性能尚不清楚。当在转录组测序水平时,一个物种会有显著差异在不同处理条件下在一个特定的特征。与患者显著差异控制,通常可以使用它作为一个很好的发现和研究材料的监管因素相关的具体特征(46,47]。因此,本研究利用高通量测序技术序列的转录组子宫内膜上皮细胞的新西兰白兔CP,旨在揭示粪食性行为的调控机制对新西兰白兔的繁殖性能。
2。材料和方法
2.1。实验设计、动物和管理
六十14周雌性新西兰白兔济源阳光提供的类似的重量是兔子科技有限公司有限公司所有新西兰白兔随机分为两组,每组30新西兰白兔。其中,新西兰白兔CP组穿着一件衣领9厘米宽的禁止他们吃粪便(图1(一)Con组)和新西兰白兔戴着项圈上3厘米的宽度允许他们吃粪便(图1(一))。十二个人(CP1-6和Con1-6)是从60新西兰白兔随机选择的。CP组和Con组包含六个独立的生物复制,避免极端的个体差异对实验数据的影响。这些新西兰白兔独自被关在笼子里,有免费的饲料和水。使用相同的兔品种(兔子一样的年龄和性别(女性),基本膳食成分,喂养方法,和环境,20%的采样率可以保证数据的高可靠性。所有的兔子都是根据适当的指导方针,提高养兔子。兔子的饮食成分补充表所示S1。
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2.2。测定生长和发育、生殖性能和血清指标
在实验过程中,生长发育指标的两组新西兰白兔进行测量,包括初始体重,平均每日摄入量,每日平均增益,premortem活体重和饲料转化率。实验动物是有文化的22周后,进行人工授精繁殖,繁殖性能新西兰白兔的两组测量分娩后(后26周)(实验设计如图1(一))。然后组织进行取样。首先,戊巴比妥钠是用于麻醉、静脉出血被执行安乐死。收集血液样本的一部分来确定两组的血清生化指标新西兰白兔。两组的屠宰性能新西兰白兔决心。
2.3。样本收集子宫组织和子宫内膜上皮细胞
收集新鲜的子宫组织和子宫内膜上皮细胞,用新准备DEPC洗水,收集上述样本在无菌EP管无核糖核酸酶- / DNAse,并将它们存储在-80°C RNA-seq (RNA-seq,我们随机抽取3个样本欺诈和CP组,分别)。
2.4。总RNA的提取和质量评估子宫内膜上皮细胞和图书馆建设
从子宫内膜上皮细胞总RNA提取的新西兰白兔试剂盒方法,然后提取RNA的浓度和质量是衡量NanoDrop分光光度计(热科学),并分析了RNA的完整性安捷伦2100生物分析仪。测序库生成使用truseq RNA样品制备设备(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。经过质量检验,图书馆在HiSeq测序平台(Illumina公司)Bioyigene生物技术有限公司有限公司(武汉,中国)。
2.5。排序、过滤和转录组测序数据的生物信息学分析
测序后,分别计算每个样本的原始数据。此外,测序数据通常包含一些低质量的读取与连接器。这些序列将造成很大的干扰后续的信息分析,因此有必要进一步过滤测序数据。数据过滤的标准主要包括:(1)使用cutadapt去除连接器3结束,删除部分至少有10个基点重叠(AGATCGGAAG)与已知的连接器,允许20%基础不匹配。(2)把读取的平均质量分数低于Q20。然后,HISAT2软件(48)是用来比较过滤后的数据与参考基因组(OryCun2.0)。根据比较结果,HTseq(0.11.3)软件(49)是用来计算每个基因的表达。在此基础上,分析的样本表达量分析,表达差异分析和聚类分析,相关的照片是由R编程语言(3.6.1)和Python(2.1)和其他分析软件。
2.6。子宫内膜上皮细胞的氧化应激水平
首先,线粒体氧化应激相关基因的表达水平在转录组分析,mitogenomic地图描绘了CG视图服务器(http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/)[50]。然后NADPHt的内容、NADPH和辅酶ii NAD +子宫内膜上皮细胞中检测到+/ NADH检测设备(WST-8方法、Beyotime # S0175)和子宫内膜上皮细胞的活性氧水平检测活性氧检测BBoxiProbe®她工具包(Bestbio # bb - 470515)。
2.7。分析炎症水平和子宫内膜上皮细胞的屏障功能
总蛋白提取、里帕裂解缓冲(中国Epizyme PC101)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(中国Epizyme GRF101)和磷酸酶抑制剂混合物(中国Epizyme GRF101)是用来溶解组织。溶菌产物离心机在12000克,4°C 20分钟获得的总蛋白质。由BCA蛋白质测定蛋白质浓度检测设备(中国Epizyme ZJ101)和免疫印迹进行使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)方法。一夜之间转移膜是在4°C的环境中使用以下主要抗体:IL-17(# 13082 - 1 1: 500年,Proteintech), TNF-a(# 60291 - 1 1: 500年,Proteintech), NOX4(1: 1000年,GB11347 Servicebio) p-IkBa(1: 500年,BS4105 Bioworld) IkBa(1: 500年,MB0106 Bioworld)、NFκB(1: 1000年,GB12142 Servicebio), ICAM1 (1: 1000, # 4915, CST),和GAPDH (1: 1000, # 2118, CST)。膜被孵化与相应的二次抗体,包括合有关anti-mouse免疫球蛋白g (1: 2000, # 7076, CST),合与anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 2000, # 7074, CST)在室温下2小时。这些墨迹可视化使用LAS4000化学发光系统(富士胶片、东京、日本),分析了密度和ImageJ 1.8软件。
2.8。RT-qPCR RNA-Seq结果的验证
在这项研究中,RT-qPCR被用来验证转录组测序数据的准确性。首先,六个基因随机选择的重量差异表达基因,包括三个调节基因,两个表达下调的基因,一个基因没有表达的差异。上述五个基因的RNA被用作模板RT-qPCR分析,和这六个基因的引物设计在NCBI上。看到补充表S2引物信息。利用逆转录工具包扭转上述RNA转录到互补脱氧核糖核酸rt - pcr仪器,然后进行qPCR。补充表S3是放大系统和放大qPCR条件,和所有的反应都是一式三份。基因表达数据标准化2 -∆∆CT方法,参照基因,并进行统计分析。
2.9。统计分析
使用一个完全随机试验设计。数据分析学生 - - - - - -独立样本在SPSS 24.0进行测试。意味着显著差异,值< 0.05,意味着极其显著差异,值< 0.01,NS意味着数据之间没有显著差异,也就是说,值> 0.05。
3所示。结果
3.1。增长和发展的结果,繁殖性能和血清索引
的增长绩效指标两组新西兰白兔如表所示1。CP后,平均日采食量,平均每日身体体重增加,和最终的重量CP组明显低于那些诈骗集团,但采食量和体重的比例是CP组升高。(值< 0.05)。两组之间没有显著差异在初始体重和平均每日摄入量(值> 0.05)。粪食性预防兔屠宰性能的影响如表所示2。all-eviscerated重量,一半去内脏的重量,和兔子在CP组子宫重量明显低于对照组(值< 0.05),而oophoron重量和胎盘重量的新西兰白兔两组没有显著差异(值> 0.05)(表2)。CP的繁殖性能的影响新西兰白兔表所示3。繁殖率、活产率、死产率,和出生窝重的兔子CP组明显低于对照组(值< 0.05),而出生的总数,活出生,出生体重和新西兰白兔的两组没有显著差异(值> 0.05)(表3)。血清生化指标的影响结果的新西兰白兔CP组CP后如图2。铝青铜的内容、高山和MDA的新西兰白兔CP组明显高于对照组的新西兰白兔,而SOD活性的内容,氧化酶活力,Glu, GSP显著低于对照组的新西兰白兔。
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3.2。质量控制和表达转录测序数据的分析
转录组比较结果表明,每个样本的过滤读取率大于89%,与Q30值大于92%(补充表S4)。HTSeq是用来计算的原始表达基因和FPKM被用来规范表达式。样本中所有基因的表达模式是由小提琴图。基因表达的六个样本的分布是补充图所示S1A。基因表达的分布范围从-2.5到2.5,而基因表达的中值是1。皮尔森相关系数是用来表示样本之间的基因表达水平的相关性。相关系数越接近1,较高的样本之间的相似的表达模式。结果表明,相似度越高的社会团体内部的表达模式的两组样品,降低组间表达模式的相似性(补充图印地)。更重要的是,利用R语言的DESeq软件包,PCA进行主成分分析每个样本根据表达式体积。主成分分析结果表明,三个样品在对照组接近,而这三个样品在CP组远,两组之间的距离也更远。距离显示样本之间的相似性(补充图就是S1C)。上述结果表明,这个转录组测序质量可靠,测量精度高,满足转录组分析的要求。
3.3。由RT-qPCR转录组测序结果的验证
的相对表达结果FPKM和RT-qPCR转录组数据补充图所示S2。六个基因的表达被RT-qPCR符合FPKM的转录组数据,和折叠的变化基本上是相同的。RT-qPCR与转录组数据是一致的,表明转录组测序结果的准确性。
3.4。差异表达基因分析
通过比较所有基因的表达水平在CP组和诈骗集团共有439个差异表达基因筛选(度),其中包括260调节基因和179个表达下调基因(图3(一个)补充表S5)。图3 (b)显示集群模式分析之间的度CP和诈骗集团。结果表明,每个样本的度CP组或对照组的选择显示类似的表达模式。
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3.5。差异表达基因功能富集的结果
去指出439度分为三类:生物过程(BP),细胞组件(CC)和分子功能(MF)。前三个去与获得的最重要的浓缩度注释的细胞外域(:0005576),电子传递链(去:0022900)和NADH脱氢酶(辅酶q)活动(去:0008137)(图3 (c))。进一步分析表明,去条款相关的运输功能和生殖功能明显丰富640年条款(值< 0.05或值< 0.01)(补充表S6)。
3.6。KEGG通路富集度的结果
度的KEGG分类注释结果补充表所示S7。439度标记在五个初级水平的KEGG:新陈代谢,环境信息处理、组织系统、细胞过程和人类疾病。如散点图,如图所示3 (d),进一步KEGG富集分析确定了前20名KEGG通路。根据图表,主要丰富KEGG通路是吗啡成瘾,细胞粘附分子,ECM受体相互作用,Rap1信号通路,杀菌作用,IL-17信号通路和NF -κB信号通路。
3.7。子宫内膜上皮细胞的氧化应激状态
线粒体与CGView绘制的地图软件,然后线粒体的基因标记根据转录组测序的结果。这些基因都是调节,红色代表显著(值< 0.05)和灰色代表无显著(值> 0.05)。结果表明,CP后,环氧酶的表达COX1, COX2、和COX3调节,和NADH脱氢酶家族如ND1-6基因的表达是调节(图4(一))。此外,CP治疗显著增加辅酶ii +内容,辅酶ii + / NADPH比和活性氧(ROS)水平在子宫内膜上皮细胞(数字4 (b),4 (c),4 (d))。
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3.8。炎症水平和屏障功能的结果
免疫印迹结果表明TNF的表达水平α、IL-17和NF -κB在子宫内膜上皮细胞炎症信号通路相关显著增加(值< 0.05或值< 0.01)(数据5(一个)和5 (b))。RT-qPCR结果证明的相对表达水平ZO-1,Occlaudin和Claudin-1有关子宫内膜上皮屏障降低(值< 0.05或值< 0.01)(图5 (c))。更重要的是,血管细胞粘附molecule-1的表达水平(VCAM-1)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)在子宫内膜上皮细胞的CP组显著增加(数据5(一个),5 (b)和5 (c))。
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4所示。讨论
我们研究小组的先前的研究结果表明,CP引起微生物的变化在兔子的盲肠的内容,减少脂质在肝脏代谢,影响生长性能(40]。本研究的结果表明,CP显著降低繁殖率,活产率,和出生窝重的新西兰白兔。此外,CP显著降低孕酮的含量(7 d和21 d)在新西兰白兔。孕酮是由卵巢的黄体分泌的,它有一个显著的形态学影响子宫内膜刺激体内雌激素和怀孕是必要的维护51,52]。研究表明,增加孕酮的含量在兔子可以显著增加兔子的怀孕率(53,54]。在这项研究中,CP显著降低新西兰白兔的孕酮含量,这可能是繁殖率低的原因。另一方面,CP的影响在新西兰白兔的血清参数显著增加铝青铜的内容,高山,血清MDA。血清铝青铜和MDA的异常增加表明炎症因素被激活,和高山的异常增加可能与血液中营养物质的减少,而SOD活性的增加可能导致活性氧的不断积累和氧化应激(图4)。此外,已经有相关报告家禽,所以推测CP组的繁殖性能下降是由于炎症和内质网压力(55]。
中差异表达基因的转录组,禁食软凳显著降低FGF18和制药业基因的表达水平。纤维母细胞生长因子18 (FGF18)是一种多肽分子绑定到特定的受体发挥作用的细胞膜(56]。FGF18胚胎研究的基因敲除小鼠,所有FGF18基因敲除小鼠在新生儿期去世,和骨骼发育异常(57]。白血病抑制因子(生活)是一种多效性的糖蛋白的细胞因子白细胞介素- 6 (il - 6)细胞因子家族。白血病抑制因子(生活)是一种多功能细胞因子,它扮演着一个重要的角色在早期胚胎发育和着床。生活发挥其生物作用通过白血病抑制因子受体(LIFR)。LIFR基因的靶向破坏导致胎盘、骨骼、神经、代谢缺陷和围产期死亡(58]。上述结果表明,禁食软粪便可能影响兔子的繁殖性能破坏FGF18和制药业基因的表达水平。
去浓缩函数结果表明,条件相关传输函数,如跨膜运输(去:0055085);运输活动(:0005215),substrate-specific跨膜转运体活动(:0022891),有机离子跨膜运输活动(去:0008514)羧酸(:0046943)跨膜转运活动,跨膜转运体活动(去:0022857)和脂肪酸运输(去:0015908)大大丰富。研究表明动物可以获得更多的营养物质通过粪食性,延长时间的饲料通过消化道(1,59]。此外,它提高了饲料的消化和吸收速率和扮演着一个重要的角色在促进胚胎的生长和发育60]。然而,在CP,怀孕兔子,营养物质的运输能力的子宫是衰减,影响胚胎的生长和发育。此外,生殖功能相关条款,如生殖结构发展(去:0048608),生殖系统开发(去:0061458)、生殖发育过程(去:0003006),生殖(去:0000003),生殖过程(去:0022414),调节上皮细胞促进(去:0050678),促进上皮细胞(去:0050673),胚胎生殖器官形态发生(去:0030538)和luteolysis(去:0001554)证实CP可能产生重大影响后代的生殖功能。
KEGG代谢途径的研究结果表明,与炎症相关的代谢途径是丰富,如NF -κB信号通路(OCU04064)、炎性介质监管的渠道(OCU04750),人数像接收机信号通路(OCU04620)、肿瘤坏死因子信号通路(OCU04668)、转化生长因子β信号通路(OCU04350) IL-17信号通路(OCU04657) et al。作为主要炎症调节器,NF -κB信号通路不仅可以控制一系列炎症反应相关基因的转录,而且调节紧密连接蛋白渗透性密切相关(61年- - - - - -64年]。更重要的是,免疫印迹结果还证实了高表达水平的NOX4和NF -κB蛋白在CP组。王等人表明,卵巢切除术触发NOX4过度,其次是ROS生产过剩和NF -κB激活以及线粒体功能障碍,证明通过激活函数NOX4 / ROS / NF -κB通路(65年]。CP导致的相对丰度的增加一些病原微生物在肠道,并进一步导致炎症因子和毒性因素的浓缩在主机66年]。它可能带来损害子宫内膜上皮细胞通过激活NOX4-ROS-NF -κB通路。
此外,代谢途径相关的繁殖和发展,如紧密连接(OCU04530),雌激素信号通路(OCU04915)和瓦里安类固醇生成(OCU04913)紧密连接是最典型的上皮细胞的结构,也是一个重要的结构对上皮细胞的屏障功能,维持细胞极性,附近的小分子的渗透性和调节细胞,它是由各种各样的膜穿透蛋白(67年,68年]。相对于Con组兔子,治疗CP破坏子宫内膜上皮细胞的紧密连接结构,和紧密连接的相对表达水平因素ZO-1, OCLN, CLDN1也显著降低(图5)。VCAM-1的表达水平和子宫内膜上皮细胞的ICAM-1 CP组显著增加(数据5(一个),5 (b),5 (c))。Dehbi等人表明,促炎因子的刺激会导致增加ICAM-1的表达式和VCAM-1质膜,与VLA4调解的快速转移,促进白细胞炎症网站和参与炎症和其下游反应(69年]。这些结果证实子宫内膜上皮细胞的通透性增加,紧密连接结构和功能异常,以及子宫内膜在CP屏障受损。这些紧密连接因素的表达在子宫内膜上皮细胞的维护是非常重要的胚胎着床和发育功能(70年,71年]。减少子宫内膜上皮细胞紧密连接因素可能导致子宫的功能障碍,导致增加大分子溶质通过子宫障碍,加重胎盘功能损伤或导致不良结果在新生的兔子72年,73年]。
5。结论
粪食性是兔子的本能行为维持生长和繁殖性能。CP可以影响炎症和氧化应激水平,激活NOX4-ROS-NF -κB通路怀孕子宫内膜上皮细胞的新西兰白兔,导致解体子宫内膜上皮细胞紧密连接蛋白的新西兰白兔,增加子宫内膜粘连蛋白的表达水平ICAM-1 VCAM-1和导致子宫组织的破坏形态,最后导致胚胎着床率的降低和新生儿的不良结果兔子。
数据可用性
原始序列文件存入国家生物技术信息中心序列读取存档与加入PRJNA885444数量。
伦理批准
动物实验伦理委员会批准学院动物科学和技术,在中国郑州,河南农业大学(号码:2021037)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
ZL, RL,杰,DY, LY负责数据管理。ZL, RL、HH和ZW responsibl的方法。ZL负责可视化和原创作品。ZL和HX负责writing-reviewing和编辑。HX毫升负责监督、资源和资金收购。志超李和李ruit贡献同样这项工作。
确认
测序图书馆然后使用HiSeq测序平台(Illumina公司)(Bioyi生物技术有限公司,武汉,中国)。冷链运输服务为所有小王提供的样本Yuhao郑州YuZhiHao生物技术有限公司有限公司资助的这项研究是中国“国家重点研发项目(2018 yfd0502203)”,“河南农业研究系统专项基金(HARS-22-13-G1)”,和“特别基金的建设国家现代农业工业园区Biyang县”(NMAIP-BY-S01)。这些投资者没有参与研究设计、数据收集和解释,或决定提交出版。
补充材料
补充图S1:转录组测序数据的质量和精度分析。(一)样本的基因表达模式。(B)样本之间的基因表达水平的相关性。(C)主成分分析结果的样本。补充图S2:验证的转录组测序结果的准确性。(一)RT-qPCR结果。(B)差异基因表达在转录组测序的倍数。补充表S1:兔子的饮食成分。补充表S2: RT-qPCR的引物。补充表S3: RT-qPCR系统和程序。 Supplementary Table S4: transcriptome sequencing data output report. Supplementary Table S5: analysis of differentially expressed genes. Supplementary Table S6: enrichment analysis of GO Terms. Supplementary Table S7: enrichment analysis of KEGG metabolic pathway.(补充材料)