文摘

芒柄花黄素(FN),一种异黄酮化合物主要从大豆分离和红三叶草,显示其抗炎、抗氧化作用在某些退行性疾病和胆汁淤积。然而,FN的作用在保护缺血/再灌注(I / R)诱导肝损伤和可能机制不清楚。在这项研究中,FN对肝损伤的影响研究在大鼠肝脏I / R模型;此外,mitophagy-related蛋白质免疫印迹和免疫荧光测定。PHB2可能的角色和在调节mitophagy PINK1 FN验证使用腺相关病毒击倒。结果表明,FN对肝脏I / R损伤有保护效应通过调节PINK1 / Parkin-regulated mitophagy。进一步,我们发现FN抑制PARL表达和阻止PGAM5剪裁通过增加PHB2的表达。PINK1击倒或PHB2都废除了FN的保护作用。综上所述,我们的研究结果表明,大豆异黄酮化合物FN提升PHB2 / PINK1 Parkin-mediated mitophagy通路保护肝脏免受I / R-induced受伤。这些结果为FN的潜在预防策略提供新的见解和它的底层机制。

1。介绍

在肝脏手术像肝切除,肝移植和一些创伤修复,血液补充肝脏总是会暂时切断和恢复操作后,从而导致缺血/再灌注(I / R) (1]。例如,肝移植是一个标准的手术治疗终末期肝脏疾病;然而,临时血管阻塞将启动肝损伤和严重时再灌注(2]。甚至手术技术大大提高,肝脏I / R约占10%急性移植物功能障碍导致肝移植和移植在第一年的失败,需要重复移植和导致肝脏捐助者的进一步短缺(3]。在肝脏疾病的大量世界各地需要肝切除和/或移植,肝I / R仍然是一个迫切需要解决的临床问题(4]。尽管有这些迫切需要,很少有可用的策略被证明是有效的治疗肝I / R。因此,预防和治疗肝I / R损伤,部分临床药物或本地化合物应该筛选和开发挖掘潜在的生物活性成分。

肝脏是人体最大的器官,调节人体代谢中发挥了重要的作用。这些过程需要消耗大量的能源,由线粒体氧和糖脂(5]。当肝脏受到缺血和缺氧,线粒体功能遭到破坏,肝脏功能受损(6]。在I / R,线粒体的结构受损,伴随着三磷酸腺苷(ATP)的减少产量,mitochondria-related凋亡和线粒体分裂7]。线粒体功能障碍产生多余的活性氧(ROS)诱导损伤DNA,蛋白质和脂质,也释放有关的分子模式分子加剧炎症(8]。因此,有必要明确线粒体功能障碍来维持细胞内稳态。Mitophagy选择性线粒体自噬,起着非常重要的作用在移除受损的线粒体9]。许多研究已经表明,mitophagy I / R,期间受损导致的能力不足移除受损的线粒体reperfused肝细胞(10]。最重要的是,恢复的能力mitophagy对I / R-induced肝损伤有保护作用。

PTEN-induced假定的激酶蛋白1 - (PINK1) Parkin-mediated mitophagy一直最好的描述之前的研究(11,12]。基础条件,PINK1进口在线粒体外膜(石)和退化PARL [13]。刺激,PINK1不能处理PARL和新兵帕金导致某些蛋白质的polyubiquitination石对自噬具有重要影响[14]。几项研究已经发现激活PINK1 / Parkin-dependent mitophagy具有保护作用对I / R-induced肝损伤(15]。全面,考虑到mitophagy-mediated线粒体清除障碍抑制肝脏I / R损伤,激活PINK1 /帕金通路是一个潜在的策略治疗缺血肝脏损伤。

异黄酮是一组植物雌激素与几个健康福利,包括抗氧化、凋亡,抗炎,以及其他一些生物功能,并且他们有营养领域的研究人员的注意,医药,和其他健康产品(16]。芒柄花黄素(FN),一种异黄酮,大豆主要是隔绝,红三叶草,它执行其生物效应在一些退化性疾病,如高血压、糖尿病、骨质疏松症和大脑退行性疾病(17]。最近,研究表明,FN对药物引起的肝毒性保护作用,肝脏炎症病变,胆汁淤积、肝脂肪变性(17- - - - - -19),表明其好处在治疗肝脏疾病的影响。在伴刀豆球蛋白A-induced肝炎模型,FN显示抑制影响炎症通过抑制核转录因子(NF -κBκB)和nod样受体蛋白3 (NLRP3) inflammasome通路(18]。在脑I / R动物模型,FN显示其对细胞凋亡的抑制影响通过激活PI3K / Akt信号通路的差别,对这些基因的伯灵顿/ bcl - 2配给[20.,21]。同时,FN抑制心肌细胞I / R-induced通过促进细胞凋亡在衰老细胞自噬(21,22]。然而,FN对肝脏I / R的影响在很大程度上是未知的。在这项研究中,FN的保护作用是评估在肝脏I / R大鼠模型中,并进一步,可能的机制。

2。材料和方法

2.1。试剂和化合物

芒柄花黄素(FN) 确定从草HPLC测定生物技术有限公司有限公司ALT, AST, TNF -α,il - 1β测量工具是从Beyotime生物技术获得的。TUNEL细胞凋亡检测设备是来自YEASEN生物技术。MDA、活性氧、谷胱甘肽、猫和氧化酶测定包被Beyotime生物技术提供。LC3 II, P62 Beclin1、COX2和COX4主要是从Abcam获得的抗体。帕金,TOM20 PINK1、PHB2 PGAM5, PARL主要抗体是由细胞信号技术。3-Methyladenine从Sigma-Aldrich获得。其他试剂用于研究可以从当地商业供应商。

2.2。动物和组

雄性老鼠(200 - 220克)是获得第四军医大学实验动物中心(西安,中国)。所有老鼠都与自由水和食物温度控制和特定的无菌室。的所有操作的基础上,综述了动物实验伦理委员会批准的动物保健和使用委员会第四军医大学。诱导的I / R损伤模型中,老鼠被戊巴比妥麻醉(40毫克/公斤)腹腔内。肝动脉和门静脉插入无创动脉夹阻断血液供应据报道的方法(23]。缺血后1 h,夹子和reperfused删除。再灌注后6 h,药物或缓冲是老鼠。在治疗期间,老鼠是免费的食物和水。

研究FN对I / R-induced肝损伤,50大鼠随机分为5组:对照组( ,老鼠laparotomized和腹部手术关闭没有I / R)、模型组( ,老鼠受到I / R手术和管理与生理盐水intragastrically I / R)后,FN-L集团( ,老鼠受到I / R手术和管理intragastrically 30毫克/公斤FN), FN-M集团( ,老鼠受到I / R手术和管理intragastrically 60毫克/公斤FN),和FN-H集团( ,老鼠受到I / R手术和管理intragastrically FN 90毫克/公斤)。溶剂的缓冲和FN对再灌注后6 h,每天两次一个星期。这些后,肝组织和血液样本被收集并存储在-80°C到使用。FN报道了它的保护作用与对乙酰氨基酚- (APAP即)诱导肝损伤(100毫克/公斤24),考虑到这一点,我们的初步实验结果,30岁,60岁,90毫克/公斤决心被用于进一步的研究。

2.3。等离子体生化测量

对于生化测试,不同组血清收集血样离心机后3000克,持续15分钟。丙氨酸转氨酶(ALT)催化氨基丙氨酸和转换反应α酮戊二酸和结果在一个比色标仪可以测量产品。天冬氨酸转氨酶(AST)催化与天冬氨酸氨基转换α酮戊二酸和结果在比色的产品25]。肿瘤坏死因子-α和il - 1β在血清中特定的酶联immune-absorbent试验测量的工具。所有的操作都是按照包的手稿。

2.4。组织化学分析和马森染色

不同的治疗后,肝组织收集并存储在10%的福尔马林。肝脏组织和石蜡样本嵌入,减少到5μ米部分,并与hematoxylin-eosin染色。幻灯片进行评估的标准铃木的分数。

嵌入的肝组织被削减至5μ米部分,沾着朱红色后细胞核与苏木精染色,然后用苯胺重染蓝色的液体。图像被使用显微镜(日本奥林巴斯公司)。

2.5。TUNEL染色

TUNEL分析,组织幻灯片是permeabilized 10分钟37°C,然后由TdT孵化酶和fluorescein-12-dUTP 2 h在37°C,停止和洗涤后,用荧光显微镜观察TUNEL-stained组织是。

2.6。免疫荧光

肝冷冻组织切片permeabilized 0.2% Triton 100 5分钟和屏蔽2% BSA 30分钟的解决方案。洗后,幻灯片是孵化主要抗体TOM20(细胞信号技术,1:100),COX2 (Abcam, 1: 50),和COX4 (Abcam, 1: 50)在4°C一夜之间,其次是二级抗体的孵化1 h在室温下。4的,核染色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)使用。可视化了荧光共焦显微镜(日本奥林巴斯公司)。

2.7。氧化应激相关测量标记

肝组织样本均质在寒冷的磷酸盐缓冲剂和离心机3000克15分钟,测量和收集上清液的氧化应激相关指标与相关商业工具和执行根据生产的方向。组织匀浆中总蛋白浓度测定采用BCA法。

减少谷胱甘肽(GSH)水平评估是基于减少5、5 dithiobis (2-nitrobenzoic酸)与谷胱甘肽(DTNB)生成黄色化合物,可以被标以450海里(26]。

谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)催化氧化的谷胱甘肽过氧化氢生产GSSG。谷胱甘肽还原酶(GR)催化还原反应的GSSG NADPH减少谷胱甘肽与氧化再生NADPH NADP +NADPH在340海里有特征吸收峰。氧化酶活力计算通过测量吸收减少的速度在340纳米27]。

肝脂质过氧化(MDA)水平评估是基于与MDA N-methyl-2-phenylindole 45°C的反应产生一个稳定的发色团,可以以586海里(26]。

过氧化氢酶(CAT)能催化过氧化氢转化为水和氧气;残留过氧化氢氧化显色底物,可以产生红色的产品(N - (4-antipyryl) 3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)可以以520海里(28]。

2 ,7 - - - - - -二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)是用来确定ROS水平在肝脏组织。简而言之,肝脏组织匀浆与10孵化μM DCFH-DA 30分钟在黑暗的37°C,荧光强度是衡量一个微型板块读者与波长的488和525海里,分别为(29日]。

2.8。检测活性氧的她在肝脏切片

snap-frozen肝脏组织切成5μ10 M切片和染色μ她30分钟的黑暗。与PBS洗后,切片观察激光扫描共焦显微镜(奥林巴斯公司)。

2.9。线粒体隔离

在鼠肝线粒体分离之前据报道的方法(30.]。总之,肝组织切片在寒冷的隔离缓冲和均质自动高速搅拌器。匀浆在5分钟600克、离心机和上层清液收集在11000 g离心10分钟。托盘收集和resuspended冷隔离缓冲B然后在11000 g离心10分钟。托盘在冷介质和resuspended离心机在3500克15分钟。托盘收集,最后线粒体被悬浮在存储缓冲区(4°C, pH值7.4,与250毫米蔗糖,和10毫米HEPES-KOH)和立即使用。缓冲区包含蔗糖(250毫米),EGTA(0.1%)、脱脂BSA (0.1%)、HEPES-KOH(10毫米),4°C, pH值7.4。缓冲B是一个没有BSA缓冲区。

2.10。线粒体呼吸测量

线粒体呼吸测量方法报道之前(31日]。简单,1毫克孤立线粒体在2毫升resuspended缓冲区包含蔗糖(125毫米),EGTA(1毫米),脱脂BSA (0.1%)、MgCl2(1毫米),氯化钾(100毫米),HEPES-KOH(10毫米),KH₂阿宝₄(5毫米),鱼藤酮(2.5μ7.4 M)和pH值。5毫米琥珀酸被用来启动线粒体呼吸30°C,和国家3呼吸测定ADP(0.5毫米)后补充道。后状态4呼吸测定ADP筋疲力尽。呼吸控制比(RCR)和ADP / O比率在不同的组织也被记录下来。

2.11。线粒体膜电位(MMP)测量

MMP以罗丹明123 (Rh123)。简单,1毫克孤立线粒体被孵化2毫升缓冲区(pH值7.4)包含鱼藤酮(2.5μ米)、蔗糖(125毫米)、氯化钾(65毫米),HEPES-KOH(10毫米),和Rh123 (0.2μ米),30°C 10分钟。这些后,不同群体的荧光测量的荧光酶标(Fluoroskan FL、热)。结果显示对照组的褶皱。

2.12。ATP测定

0.5毫克分离线粒体ATP释放缓冲区是均质冷,和离心后的上层清液收集在12000 g为5分钟。ATP水平测量使用ATP测量工具(ab83355 Abcam)根据设备的指令。

2.13。免疫印迹分析

免疫印迹分析,线粒体蛋白质提取使用线粒体蛋白质提取工具包(KGP8100 Keygentec)。30μg蛋白被加载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物膜(PDVF)。膜是孵化与主抗体(LC3 II, P62、Beclin1 TOM20,帕金,PINK1, PHB2, PGAM5,和PARL(1: 1000)在一夜之间在4°C。然后,膜与贴切地孵化二级抗体结合辣根过氧化物酶和可视化使用增强化学发光检测系统(微孔)。结果显示褶皱的控制。

2.14。定量聚合酶链反应

肝组织的总RNA提取使用试剂盒,和互补脱氧核糖核酸合成低聚糖(dT) '和PrimeScript RT试剂(豆类、日本)。互补脱氧核糖核酸是放大使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类、日本)一个应用生物系统公司ABI 7500系统(美国CA)。褶皱改变基因表达决心与循环阈值( )价值观和规范化GAPDH表达式(32]。本研究显示的引物序列表1。

2.15。mtDNA拷贝数

在肝组织提取总DNA phenol-chloroform方法。实时PCR使用ABI 7500系统应用于量化线粒体DNA拷贝数(mtDNA)。mtDNA的引物是正向(CGAAAGGACAAGAGAAATAAGG)和反向(CTGTAAAGTTTTAAGTTTTATGCG)。β球蛋白作为基因组DNA控制,引物β-glubin是正向(CAACTTCATCCACGTTCACC)和反向(GAAGAGCCAAGGACAGGTAC)。

2.16。透射电子显微镜(TEM)

TEM分析,肝组织(1毫米³)与2.5%戊二醛固定,然后用1%的四氧化锇后缀1 h,在分级丙酮脱水,嵌入Epon-Araldite树脂。接下来,稀释(80海里)被超微切片机切工具(德国徕卡)。然后,片与2%水醋酸双氧铀和雷诺氏poststained柠檬酸铅。准备在HT7700电镜成像(日立、日本)。

2.17。统计分析

结果由GraphPad Prism 5.0软件进行了分析。数据显示, 从至少三个实验。学生的 - - - - - -测试(双尾)是用于比较两组。方差分析其次是事后Bonferroni测试是用于多个比较。值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。FN I / R-Induced保护肝脏免受伤害

肝脏组织病理学改变1(一)表明,I / R-induced广泛坏死为特征的正弦拥堵和细胞肿胀。大面积的囊增厚和大量淋巴细胞浸润模型中观察组。铃木损害程度计算使用标准分数,这表明,模型组有较高的得分与对照组相比 ,图1 (c))。FN治疗明显改善肝脏组织病理学损伤较模型组( )。TUNEL染色显示I / R-induced在肝脏出现细胞凋亡模型组TUNEL阳性染色(数字1 (b)和1 (d))。FN治疗组,TUNEL阳性染色显著降低以剂量依赖的方式( )。血清AST水平(图1 (e)),ALT(图1 (f))、肿瘤坏死因子-α(图1 (g)),il - 1β(图1 (h))测量。结果表明,水平的AST、ALT、TNF -α和il - 1β在大鼠血清都显著增加受I / R操作( ,与对照组相比)。FN治疗后,水平的AST、ALT、TNF -α,il - 1β下降,显示明显差异,在模型组( )。这些结果表明,FN有保护作用对I / R-induced肝脏损伤。

3.2。从I / R-Induced FN保护肝脏线粒体功能障碍

评估的影响FN在I / R-induced线粒体功能障碍,mitochondria-related制造商被测量。结果显示在图2(一)和2(b), I / R诱导减少COX2的表达和COX4线粒体呼吸链的主要组件。我们也观察到线粒体数量减少I / R后治疗的特点是TOM20染色(图2(c))。FN治疗显著恢复COX2 COX4阳性染色和线粒体的数量增加。

ROS水平也是衡量评价氧化负担由I / R。图2(d)是染色的结果是一个荧光探针检测活性氧的生成和特定的过氧化物。结果表明,I / R诱导增加红色的荧光强度也表示过氧化物的生产。FN治疗(FN-M和FN-H)组,红色荧光的强度既减少表示FN抑制过氧化物生产由I / R。和活性氧水平也定量衡量DCFH-DA工具包。与虚假的ROS水平组相比,ROS水平增加约控制在模型组的7.5倍。FN治疗组,ROS水平三倍和1.9倍下降约控制在FN-M和FM-H集团(图2(e))。

结果显示在图2(f),与虚假的组相比,模型组MDA水平 / mg prot,明显高于在虚假的集团( ROS prot),表明脂质过氧化。FN治疗后,尤其是剂量越高,MDA含量明显降低( 普罗特FN-H vs。 在模型组, )。

抗氧化蛋白(谷胱甘肽,猫,和氧化酶)也被测量。结果显示在图2(g)、谷胱甘肽水平明显降低模型组( prot vs。 普罗特, ),和FN治疗明显恢复了谷胱甘肽水平( 普罗特FN-H vs。 普罗特在模型组, )。猫的活动也抑制模型组( prot vs。 普罗特, )获救的FN治疗( 普罗特FN-H vs。 普罗特在模型组, )。同样的变化也在氧化酶的活动,显示在图2(我)。这些结果表明,FN恢复线粒体功能障碍和抑制氧化应激引起的肝脏i / R。

3.3。FN抑制能量代谢衰竭引起的I / R

线粒体功能障碍会引起能量代谢衰竭;因此,孤立的能量代谢相关指标测定肝脏线粒体。结果显示在图3,I / R诱导ATP合成障碍(图3(一个)(图),MMP的消费3 (b)),和呼吸功能障碍,RCR(图所示3 (c)3(图),状态3 (d)4(图),状态3 (e)),ADP / O(图3 (f))。FN治疗组,MMP和ATP水平的下降是增加,和线粒体呼吸提高剂量治疗组。这些结果表明,FN改善能量代谢衰竭引起的I / R。

3.4。FN诱导帕金/ PINK1-Dependent Mitophagy在肝脏

Mitophagy起着重要的作用在调节线粒体功能;因此,我们观察到mitophagy-related蛋白质和基因。结果显示在图4(一)的蛋白表达帕金和PINK1既减少模型组,以及mitophagy水平的标记(LC3 II和Beclin1),和P62的蛋白表达增加,表明I / R抑制帕金/ PINK1-mediated mitophagy途径。在FN治疗组(FN-M和FN-H),帕金的蛋白表达,PINK1, LC3 II, Beclin1模型组相比显著增加。的mRNA表达帕金,PINK1 LC3 II, P62, Beclin1结果还显示,FN治疗规范mitophagy-related基因表达(图4 (b))。这些结果表明,FN监管中的mitophagy肝脏I / R模型。

接下来,我们使用3-methyladenine (3-MA),一种广泛使用的自噬抑制剂,评估FN的保护作用是否调节mitophagy。正如所料,3-MA废除FN在抑制肝纤维化的影响来衡量马森染色(图4 (c))。进一步探索的角色帕金/ PINK1 mitophagy FN的调节影响,转化为一个腺相关病毒hepatocyte-specifically击倒PINK1在肝脏。结果显示在图4 (d),AAV-PINK1显著抑制的调节影响FN在mitophagy-related标记(LC3 II, P62, Beclin1)。探索的影响PINK1基因数自噬在肝脏I / R,电子显微镜(图4 (e))。值得注意的是,AAV-PINK1显著减少肝脏I / R的自溶酶体组织(10 FN组与3 FN + AAV-PINK1集团)。这些结果表明,FN诱导mitophagy通过帕金/ PINK1途径。

3.5。FN的线粒体的保护作用是依赖PINK1

此外,我们评估FN无论是通过PINK1的保护作用。结果显示在图5(一个),FN的表达的升高作用TOM20 COX4被废除,PINK1击倒(FN + AAV-PINK1 vs . FN)。作为与FN治疗组相比,FN在ATP合成障碍的改善作用(图5 (b)(图),mtDNA表达水平5 (c)(图),MMP的消费5 (d)(图)和呼吸障碍5 (e))也被PINK1击倒。这些结果表明,线粒体依赖PINK1 FN的调节效应。

3.6。通过PHB2 FN监管帕金/ PINK1-Dependent Mitophagy

接下来,我们探讨蛋白在调节帕金FN的目标/ PINK1-dependent mitophagy。根据稳定和聚合的影响PHB2帕金/ PINK1在线粒体,PHB2及其下游测量。结果显示在图6(一)FN PHB2蛋白质表达水平的增加,减少了I / R治疗( )。PARL水平和拍摄PGAM5蛋白水平增加I / R后,与对照组相比。FN治疗组,PARL射杀PGAM5蛋白表达水平较模型组下降( )。进一步清晰和明确的角色在FN调节mitophagy PHB2,一个腺相关病毒转化为hepatocyte-specifically击倒PHB2在肝脏被使用。结果显示在图6 (b)与FN组相比,FN的增加影响帕金和PINK1蛋白表达受到抑制PHB2击倒( ),通过PHB2暗示FN监管帕金/ PINK1。此外,PHB2击倒废除P62 FN的调节效应,Beclin1, LC3II蛋白表达( ),建议通过PHB2 FN mitophagy监管。在PARL FN表达的降低效果也废除了PHB2击倒( )。这些结果表明,FN监管帕金/ PINK1-dependent mitophagy PHB2。

3.7。FN的线粒体的保护作用是依赖PHB2

mitochondria-related指标测量评估PHB2 FN的保护作用的影响。如图7(一),PHB2击倒显著增加了FN + AAV-PHB2组肝纤维化水平,这与FN组(图7(一))。PHB2击倒也抑制了蛋白表达水平的COX4 TOM20肝脏组织中都增加了FN治疗(图7 (b))。FN在ATP合成障碍的改善作用(图7 (b)(图),MMP的消费7 (c)),和呼吸功能障碍,RCR(图所示7 (d))也被PHB2击倒。这些结果表明,FN执行其保护作用对I / R通过PHB2通路。

4所示。讨论

在先前的研究中,FN已经部分肝细胞保护的影响研究。FN抑制FFA-stimulated脂质积累通过denosine monophosphate-activated蛋白激酶(AMPK) /转录因子EB - (TFEB)溶酶体介导的生物起源(33]。在一个碳tetrachloride-induced肝损伤模型,通过降低TNF FN进行了肝细胞的保护作用,NF -κB, Toll-mediated炎症(19]。ritonavir-induced肝损伤模型,FN显示其保护作用通过抑制氧化应激,炎症和细胞凋亡34]。另外,FN也对上皮细胞损伤的保护作用,内皮功能障碍和脑损伤(21,35,36]。这些研究开明的FN具有多种生物效应,值得进一步值得深入研究。考虑到肝细胞保护FN在其他模型中,我们假设FN有保护作用对I / R-induced肝损伤。在这项研究中,从I / R-induced FN保护肝脏组织病理学损伤,改善了肝功能显示减少AST和ALT水平,抑制细胞凋亡,减少了炎症。这些结果证实了FN对I / R-induced肝损伤的保护作用。此外,可能机制研究来解释这些影响。

肝缺血诱发无氧糖酵解和酸性代谢产物堆积,因此线粒体内稳态失衡,导致线粒体损伤(37]。ROS是能量代谢的主要副产品,通过抗氧化蛋白在线粒体ROS过度繁殖,在再灌注和抗氧化剂被破坏,从而使线粒体损害(38]。在我们的研究中,我们观察到,ROS和I / R组MDA含量增加,减少谷胱甘肽,猫,和氧化酶的活动。结果还表明,I / R诱导线粒体代谢功能障碍的减少程度的ATP和呼吸功能障碍,这表明在肝脏I / R诱导线粒体功能障碍。FN治疗改善线粒体功能通过逆转这些变化。

Mitophagy,线粒体自噬的类型,可以清除线粒体功能失调和防止线粒体副产物的积累。长期缺血和随后的再灌注后,线粒体损伤的程度上抑制自噬的清除活动目标I / R-damaged线粒体(10]。受损或不足mitophagy诱导控制ROS生产、线粒体DNA突变,代谢障碍,最终细胞死亡(39]。根据这些,拯救mitophagy活动后再灌注或缺血期间可以保护我/ R-induced肝损伤。在这项研究中,我们发现I / R-induced mitophagy-related蛋白质(LC3 II, P62和Beclin1)基因数获救的FN治疗,表明FN保护肝脏I / R损伤可能通过增加mitophagy线粒体。

PINK1 / Parkin-mediated mitophagy是最重要的一个线粒体自噬途径和参与消除失调在肝I / R-induced损伤(40]。帕金,胞质RBR E3泛素连接酶(RING-between-RING),包含一个Ub1(氨基端ubiquitin-like)域。在稳态条件下,帕金采用一个autoinhibited构象,胞质连接酶灭活(41]。线粒体去极化,PINK1积累的石不正常的线粒体和细胞溶质的新兵帕金到石并激活其E3连接酶的活动,因此帕金ubiquitinates各种外膜蛋白和诱发的起始mitophagy [42]。然而,鲜为人知的角色PINK1 / Parkin-mediated mitophagy在FN-induced肝细胞保护。在这项研究中,我们发现PINK1帕金表达水平在线粒体中抑制肝脏I / R鼠模型,和FN的表达增加PINK1和帕金以剂量依赖的方式。此外,我们还发现PINK1击倒显著抑制的影响FN在调节mitophagy以及线粒体的保护作用。这些结果表明,FN诱导mitophagy虽然调节PINK1 / Parkin-dependent通路。

接下来,我们试图探讨FN监管PINK1 / Parkin-dependent mitophagy途径。在哺乳动物细胞,prohibitin 2 (PHB2)扮演的重要受体PINK1-mediated mitophagy [43]。PARL,一睹intramembrane线粒体内膜蛋白水解作用,已报负调节PINK1 / Parkin-mediated mitophagy。PARL可以打通多个基板包括PGAM5,这使可靠的PINK1长篇PINK1风格,从而诱发的起始mitophagy [44,45]。当PGAM5劈裂PARL生成短形式的PGAM5的PGAM5-mediated PINK1插入线粒体受损,导致PINK1退化,从而抑制mitophagy [46]。PHB2可以绑定和PARL PGAM5长形式的稳定PINK1在石受损的线粒体,从而诱发mitophagy [47]。根据FN在调节的影响PINK1 / Parkin-mediated mitophagy,我们进一步调查是否PHB2 / PARL PGAM5参与这个过程。作为我们的结果显示,I / R的表达减少PHB2 PARL的表达增加,增加表达的PGAM5一起拍摄形式,表明减少PHB2引起肝脏I / R可能导致mitophagy功能障碍。正如所料,FN治疗显著获救PHB2表达式和减少PARL shot-PGAM5表达,暗示PHB2可能参与调节效应FN PINK1 / Parkin-regulated mitophagy。确认PHB2之间的串扰和PINK1 /帕金在调节mitophagy FN,腺相关病毒用于击倒PHB2。有趣的是,PHB2击倒显著降低的影响FN PINK1 / Parkin-related mitophagy也废除了保护作用对I / R-induced线粒体功能障碍。这些结果表明,FN进行了影响PINK1 / Parkin-related mitophagy PHB2。

5。结论

总之,我们确认一个异黄酮化合物,FN,能够保护我/ R-induced肝损伤虽然调节PINK1 / Parkin-mediated mitophagy途径。此外,我们还发现,PHB2-PARL-PGAM5发挥了重要作用FN-mediated PINK1积累在线粒体。这些结果表明,PHB2-PINK1-related mitophagy可能是一个可能的目标I / R-induced肝损伤。瞄准这一途径可能是有益的化合物治疗ischemia-related肝脏疾病。此外,它还暴露,FN可能是线粒体防护剂或食品/营养补充肝脏I / R损伤的临床治疗。我们的研究结果提供了新的见解的潜在预防战略FN和它的底层机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

中影马,抵帐,金太阳的构思和设计实验;抵帐,金太阳,七张,彝族乔进行实验;中影马,Jing妞妞,钱学森任分析数据;中影马,Lun周、朱鑫和钱任了试剂/材料/分析工具;钟颖马写论文;中影马,抵帐,金太阳修改了手稿。这些作者同样导致了这项工作。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(排名81774190)。