文摘
背景。S100A4属于S100钙结合蛋白家族和增加患者的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。Sphingosine-1-phosphate (S1P)是一种天然的生物活性鞘脂类,调节细胞和细胞外基质之间的附着力和影响细胞迁移和分化。本研究的目的是分析S100A4之间的相关性,S1P, COPD患者肺功能。方法。所有139份血清样本和15肺标本被收集在慢性阻塞性肺病患者和对照组。S100A4和S1P发现在两组。标记的纤维化和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)测定在慢性阻塞性肺病患者和对照组的肺。结果。S100A4的蛋白表达在慢性阻塞性肺病患者的肺部和血清高于控制情况。此外,血清S100A4与COPD患者肺功能呈负相关。与此同时,胶原沉积和EMT核转录因子在COPD患者的肺升高。此外,S1P的蛋白表达在慢性阻塞性肺病患者的血清中含量增加。血清S1P逐渐增加与COPD患者肺功能下降。进一步相关分析显示血清S1P消极与COPD患者的肺功能有关。此外,有一个积极的S1P之间的相关性和S100A4在慢性阻塞性肺病患者。结论。这些结果提供的证据表明,海拔S100A4和S1P可能参与了COPD的发病和进展。
1。介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是不可逆气流限制和慢性气道炎症,唤起一个沉重的负担在整个社会和个人1]。随着老龄化社会的临近,越来越多的人患有慢性阻塞性肺病,全球每年约有300万人死于慢性阻塞性肺病(1]。慢性阻塞性肺病每年造成的死亡人数排名第三的世界各地的所有疾病(2]。由吸烟导致的慢性炎症、有害颗粒是慢性阻塞性肺疾病的一个重要原因3]。然而,慢性阻塞性肺病的确切发病机理尚不清楚。增加的证据已经证实肺纤维化和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)参与气道的发展限制和肺气肿(4,5]。然而,确切的EMT在慢性阻塞性肺病的发生和发展中的作用还有待进一步阐明。
S100A4 (fibroblast-specific蛋白1)属于S100钙结合蛋白家族。通常知道S100A4发挥核心作用在肿瘤转移的病理生理学,纤维化疾病,自身免疫性疾病(6- - - - - -8]。最近,这是表明S100A4从成纤维细胞促进肺纤维化9,10]。最近的研究表明,S100A4促进肿瘤转移和EMT (11]。一些研究已经证实S100A4-mediated EMT起着重要的作用在肿瘤和非肿瘤的疾病的发生12- - - - - -14]。临床流行病学研究表明,S100A4高架在特发性肺纤维化患者的血清15]。Sphingosine-1-phosphate (S1P)是一种天然的生物活性鞘脂类,负责监管之间的粘附细胞和细胞外基质通过G蛋白耦合S1P受体,从而影响细胞迁移和分化16]。S1P由鞘氨醇激酶磷酸化(SphK1和SphK2),利用鞘氨醇降解过程中等离子体膜鞘糖脂和鞘磷脂17]。此外,S1P证明函数作为结构部件和第二信使[18]。先前的研究已经表明,鞘脂类信号平衡发挥核心作用在维持身体的内稳态19,20.]。一项研究表明,S1P障碍与炎症反应和致癌作用在不同组织(18]。动物实验表明,肺S1P高架在烟吸烟引起的小鼠慢性阻塞性肺病(21]。然而,S100A4之间的关联、S1P和COPD患者的肺纤维化是未知的。
本研究的目的是评估S100A4之间的关联,S1P, COPD患者的肺纤维化病例对照研究。目前的研究发现,S100A4和S1P增加肺组织和慢性阻塞性肺病患者的血清样本。S100A4和S1P的水平与COPD患者的肺功能呈负相关。这些结果表明,S1P呈正相关S100A4和COPD患者肺功能下降。
2。材料和方法
2.1。试剂
主要的抗体β肌动蛋白(8 h10d10)和S100A4 (ab197896)从Abcam购买(Cambridge, MA)。抗体(10 e4e6)和αsma (ab119952)从细胞信号技术(贝弗利,MA)。发射极耦合逻辑检测试剂盒都是从Advansta买(美国CA)。
2.2。招聘的主题
所有139名慢性阻塞性肺病患者被随机从安徽COPD组(AHCC)的研究是一个医院前瞻性队列研究(22- - - - - -24]。慢性阻塞性肺病患者的诊断标准的黄金准则。肺功能测试是确认在所有科目。慢性阻塞性肺病诊断根据标准的美国胸科学会和慢性阻塞性肺病(黄金)的全球倡议。健康正常的人肺功能被随机招募从体检中心作为对照组。排除标准如下:(1) 岁的;(2)存在其他呼吸道疾病,如支气管哮喘、支气管扩张、肺结核、肺癌;(3)结合实体肿瘤、血液系统疾病、免疫缺陷、自身免疫系统疾病,怀孕,主要创伤、休克、等;(4)化疗和放疗的历史在过去1个月;和(5)使用免疫抑制药物,类固醇,等等,在过去的两周。慢性阻塞性肺病病人都与一个控制主题的基础上,性别和年龄。所有控制例体检中心在安徽医科大学第二附属医院。慢性阻塞性肺病患者的血液样本收集住院后第二天上午。血清样本存储在冰箱里在-87°C离心后25,26]。手术期间所有人类的肺组织标本收集。我们获得15 COPD患者肺组织和15 paracancerous组织于肺癌病人没有其他肺部疾病。肺组织移除超过5厘米的范围从肺的焦点27,28]。这项研究符合医学伦理标准和已经认可了安徽医科大学的伦理委员会(LLSC20210822)。
2.3。西方墨点法
•瑞帕缓冲区以及PMSF被添加到肺组织肺匀浆做准备。所有蛋白质样品分离15% sds - page凝胶,然后样品都被转移到PVDF膜。膜被三次磷酸盐被屏蔽后5%脱脂牛奶在室温下为1.5 h。膜与不同的孵化主要抗体在一夜之间在4°C在冰箱里过夜。与磷酸盐被洗了三次后,二级抗体的来源来自主要的抗体继续孵化为2 h 37°C。一种ECL工具包用于化学发光检测如前所述[29日,30.]。光密度通过ImageJ软件进行了分析。
2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)
S1P ELISA试剂盒从武汉购买彩色基因生物科技有限公司有限公司S100A4 ELISA试剂盒从Cusabio购买,武汉,中国https://www.cusabio.com/)。S100A4和S1P的水平测量使用ELISA根据制造商的协议(31日,32]。
2.5。免疫组织化学(包含IHC)
后肺组织脱蜡、水化、抗原检索和血清阻断,幻灯片是孵化主要抗体αsma(1: 300)和捻(1:300)36 h在4°C和2 h在室温下。然后,在磷酸盐三次洗肺幻灯片。接下来,肺幻灯片孵化了45分钟在室温下的二级抗体。肺幻灯片与PBS复染色染色后轻拍和苏木精。最后,α-SMA-positive细胞和Twist-positive核光学显微镜下观察和计算后脱水和密封(33,34]。
2.6。马森的染色
石蜡切片dip-stained在媒介解决方案,然后沾天青石蓝色和迈耶的苏木精。肺幻灯片与朱红色洋红染色染料后分化与酸醇差异化的解决方案。幻灯片是用自来水和蒸馏水洗净,然后用磷钼酸治疗方案和苯胺蓝。最后,幻灯片是清洗、脱水和观察(35]。
2.7。统计分析
使用SPSS 19.0软件进行统计分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有连续变量与均值和中位数表示。显示所有分类变量是使用频率和百分比。连续变量的差异是通过评估 - - - - - -测试或Mann-Whitney两组之间的测试。所有分类变量比较两组之间使用卡方测试。相关分析是通过线性回归在慢性阻塞性肺病患者。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。人口统计数据和临床特点
人口数据展示在表和临床特征1。一百三十九名慢性阻塞性肺病患者(男性74.1%)和139名对照组(71.9%的男性)在本研究招募了。平均年龄为73.84岁和72.35岁在COPD患者和对照组,分别。烟民数量更多的是慢性阻塞性肺病患者(75.3%)比在控制的情况下(30.2%)。白细胞的数量(白细胞)和中性粒细胞增加,淋巴细胞的计数是减少慢性阻塞性肺病患者。此外,c反应蛋白(CRP)的水平和白细胞介素- 6 (il - 6)在慢性阻塞性肺病患者与对照组相比明显更高。此外,人口统计数据和临床特点进行了进一步分析慢性阻塞性肺病患者之间基于性别和控制情况。如补充表所示1,抽过烟的数量比女性更多的男性病例情况。此外,没有差别在白细胞,中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。肺功能分析显示,FEV1%和FEV1 / FVC %增加COPD女性患者比男性患者。相反,FVC男性COPD患者的高。
3.2。S100A4的水平在慢性阻塞性肺病患者和控制情况
S100A4蛋白表达的检测在慢性阻塞性肺病患者的肺组织和控制情况。如数据所示1(一)和1 (b)肺S100A4的水平在慢性阻塞性肺病患者相比显著增加控制情况。此外,S100A4的蛋白表达之间的血清检测慢性阻塞性肺病患者和控制情况。如图1 (c),S100A4在慢性阻塞性肺病患者的血清中含量增加。此外,血清S100A4的水平在慢性阻塞性肺病患者进一步比较不同的肺功能指标。结果显示,血清水平S100A4在4年级COPD患者高于(图1 - 2年级和三年级课程1 (d))。与此同时,血清S100A4的水平进一步比较不同性别患者慢性阻塞性肺病。血清中没有区别S100A4在慢性阻塞性肺病患者不同性别(补充图1(a))。同样,没有区别在慢性阻塞性肺病患者男女之间的不同等级(补充图1(b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。相关性的COPD患者的肺功能和血清S100A4
肺功能和血清S100A4之间的相关性进行了分析。如图1 (e)在第一第二,用力呼气容积(FEV1)与慢性阻塞性肺病患者的血清S100A4负相关( , )。此外,用力肺活量(FVC)与慢性阻塞性肺病患者的血清S100A4呈负相关( , )(图1 (f))。此外,血清S100A4与FEV1 / FVC %的负相关( , )和FEV1% ( , )在慢性阻塞性肺病患者(数字1 (g)和1 (h))。此外,血清S100A4和肺功能的指标之间的关系进行评估通过线性回归分析慢性阻塞性肺病患者。如表所示2一元线性回归表明,血清S100A4与FEV1%负相关( ,95% CI: -2.079 ~ -1.044)、FEV1 / FVC % ( ,95% CI: -0.810 ~ 0.156)、FEV1 ( ,95% CI: -0.041 ~ -0.018), FVC ( ,慢性阻塞性肺病患者的95% CI: -0.048 ~ -0.017)。为了控制混杂因素,年龄,性别,吸烟被调整。多元线性回归发现,血清S100A4与FEV1%负相关( ,95% CI: -1.962 ~ -0.939)、FEV1 / FVC % ( ,95% CI: -0.729 ~ 0.090)、FEV1 ( ,95% CI: -0.865 ~ -0.046), FVC ( ,95% CI: -0.041 ~ -0.018)在慢性阻塞性肺病患者(表2)。
3.4。纤维化和EMT COPD患者之间的水平和控制情况
肺纤维化的水平被发现使用马森的COPD患者和控制之间的染色情况。马森的染色表明,肺组织的胶原面积显著增加慢性阻塞性肺病患者比对照组(数字2(一个)和2 (b))。然后,α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma), myofibroblasts成熟的标志,是通过包含IHC COPD患者之间测量和控制情况。如数据所示2 (c)和2 (d)结果表明,α-SMA-positive细胞在慢性阻塞性肺病患者的肺组织明显升高。此外,肺Twist-positive原子核,EMT转录因子之一,在慢性阻塞性肺病患者高于对照组(数字2 (e)和2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。水平之间的S1P COPD患者和控制情况
血清S1P与ELISA检测慢性阻塞性肺病患者和对照组。如图3(一个)慢性阻塞性肺病患者,血清S1P显著增加。此外,血清水平S1P进一步分析慢性阻塞性肺病患者不同的成绩。结果表明,血清S1P水平低1 - 2年级COPD患者比(图3和4级年级慢性阻塞性肺病患者3 (b))。接下来,相比血清S1P进一步的表达在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。补充图2所示(一个),血清S1P的表达女性COPD患者和男性COPD例之间的相似。此外,没有性别差异的影响在COPD患者血清S1P不同等级(补充图2 (b))。此外,血清S1P的相关性不同指数COPD患者肺功能的访问。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (f)、血清S1P与FEV1(负相关 , ),FVC ( , ),FEV1 / FVC % ( , ),和FEV1% ( , )在慢性阻塞性肺病患者。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。协会S1P S100A4在COPD患者和控制情况
S100A4的S1P协会所有参与者的血清进行了分析。结果显示,没有S1P和S100A4在所有参与者之间的联系(图4(一))。然后,S1P协会和S100A4在COPD患者和控制情况下进行分层分析。尽管没有S100A4和S1P协会在对照组(图4 (c)),S100A4在慢性阻塞性肺病患者(S1P呈正相关 , )(图4 (b))。然后,S100A4的相关性和S1P进一步通过线性回归分析在所有科目。一元线性回归发现,S100A4 S1P呈正相关,在所有情况下( ,95% CI: 0.352 ~ 2.726)和慢性阻塞性肺病患者( ,95% CI: 4.311 ~ 14.518)(表3)。调整了年龄、性别、吸烟、多变量线性回归显示,S100A4在慢性阻塞性肺病患者(S1P呈正相关, ,95% CI: 1.112 ~ 12.365)(表3)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在目前的研究中,S100A4的水平,S1P和相关肺纤维化标志物检测慢性阻塞性肺病患者和对照组之间。S100A4之间的相关性、S1P和COPD患者的肺功能进行了分析。本研究主要发现以下。(1)肺S100A4和血清S100A4在COPD患者增加。(2)血清S1P在COPD患者升高。(3)肺纤维化的程度在COPD患者增加。(4)血清S100A4与S1P呈正相关,与COPD患者肺功能成负相关。
慢性阻塞性肺病的发病率高,严重影响患者的生活质量和社会带来了沉重的负担36]。吸烟、空气污染、遗传学和炎症的慢性阻塞性肺病的发展是重要原因,但COPD的发病机制和病理是模糊的。越来越多的研究证实,EMT和纤维化扮演中心角色的开发和进展慢性阻塞性肺病(37,38]。S100A4属于S100钙结合蛋白家族。S100A4最近被发现的潜在因素与纤维化疾病和间充质EMT的标志。体内和体外实验显示,S100A4从成纤维细胞促进肺纤维化9,10]。基于医院的病例对照研究人口证明血清S100A4高架在特发性肺纤维化患者15]。与此同时,S100A4的水平和肺纤维化在COPD患者中发现。目前的研究发现,S100A4的表达式是慢性阻塞性肺病患者升高。此外,慢性阻塞性肺病患者的年级越高,血清中S100A4越高。虽然没有差别在血清S100A4在COPD患者中,血清S100A4与COPD患者肺功能呈负相关。这些结果表明,S100A4的表达升高在慢性阻塞性肺病患者的血清和肺。
几项研究从我们的团队和其他研究人员已经证明,EMT是参与了COPD的过程(27,28]。上皮细胞标记物的减少在间充质标记增加COPD患者的肺。EMT的过程可以由EMT转录因子如麻花,蜗牛和蛞蝓。EMT的激活转录因子能抑制钙上皮标记,通过绑定粘附促进剂,能促进EMT (39]。在目前的研究中,Twist-positive细胞核明显增加慢性阻塞性肺病患者的肺组织。汇集一起的证据已经确定,捻施加某些角色发展的疤痕和纤维化。肺泡上皮细胞(aec)接受EMT和导致肺纤维化40]。我们的研究结果发现,胶原沉积增加,myofibroblasts在COPD患者的肺被激活。这些结果发现EMT和炎症在肺组织纤维化是慢性阻塞性肺病的患者。此外,S100A4在EMT的角色已经涉及到许多研究[41,42]。最近,人们已经发现,S100A4通过纤维母细胞可促进肺纤维化激活(43]。因此,这些数据表明S100A4-mediated EMT和纤维化可能参与了慢性阻塞性肺病的发生和发展。
S1P是一种生物活性脂质合成细胞鞘氨醇激酶和退化S1P裂合酶和各种磷酸酶。主要生成S1P在哺乳动物细胞和内皮细胞释放的,血红细胞,单核细胞(44]。S1P在多种生理和病理条件下有不同的功能。bleomycin-induced肺纤维化小鼠模型,S1P的水平是升高的血清和肺组织(43,45]。此外,S1P的表达调节肺标本和血清的肺动脉高血压大鼠(46,47]。同时,一些研究人员发现,S1P增加在肺癌患者的血清和肺(48,49]。然而,S100A4之间的相关性和S1P掩盖在慢性阻塞性肺病患者。在这项研究中,血清S1P提高COPD患者与对照组相比。此外,血清S1P逐渐升高与COPD患者肺功能下降。这些结果表明S1P高度参与了COPD的过程。机械的研究表明,细胞外S100A4上调αsma表达和胶原沉积和激活肺成纤维细胞S1P [43]。此外,S1P可以直接促进EMT在肺上皮细胞50]。在当前的研究中,相关分析表明,血清S1P与COPD患者肺功能呈负相关。尽管没有明显相关性S100A4和S1P对照组,S100A4与COPD患者的S1P呈正相关。线性回归分析进一步表明,S100A4与COPD患者的S1P呈正相关。这些结果提供的证据表明,S100A4高程与S1P upregulation COPD患者,表明S100A4海拔可能唤起EMT和通过S1P在COPD患者的肺纤维化。
这项研究有一些局限性。首先,这是一个单中心研究小样本大小,和一项多中心研究更大的样本容量将进一步证明这些结果。第二,这只是一个病例对照研究,海拔S100A4和S1P之间的因果关系和肺功能的下降还不清楚。进一步的动物实验可能澄清这个问题。第三,机制S1P-mediated EMT还不清楚在这个病例对照研究,只有体内实验和体外能解决这个困惑。
5。结论
总之,本研究主要是评估S100A4之间的关联,S1P, COPD患者肺功能基于一个病例对照研究。我们的研究结果显示,S100A4增加COPD患者的肺和血清。与此同时,标记的纤维化和EMT升高COPD患者的肺。此外,慢性阻塞性肺病患者的血清S1P上升了。相关分析显示,肺功能与S1P呈负相关和S100A4在慢性阻塞性肺病患者。此外,血清S1P S100A4在慢性阻塞性肺病患者呈正相关。这些结果提供的证据表明,海拔S100A4和S1P可能参与了慢性阻塞性肺病患者的发病和进展。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
低频、赫兹和DXX设计研究。HYQ MDL承担大部分的工作。HYQ、MDL GFX, WC参与数据收集和分析。如果导致资金支持和起草的手稿。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。Hou-Ying秦和李Meng-Die贡献同样这项工作。
确认
我们应感谢全体员工体检中心和部门的呼吸和危重病医学的帮助。这项研究得到了国家自然科学基金(82100078和82100078),安徽省自然科学基金(2008085 j38),国家自然科学基金孵化项目的安徽医科大学第二附属医院(2020 gqfy05),安徽省卫生和科学研究委员会(AHWJ2021b091)。
补充材料
补充1。补充图1:血清S100A4的水平在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。通过ELISA检测血清S100A4的水平在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。(a)的血清水平S100A4中检测出男性和女性慢性阻塞性肺病患者。(b)的血清水平S100A4在女性和男性COPD患者中发现不同的成绩。补充图2:血清S1P的水平在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。通过ELISA检测血清S1P的水平在慢性阻塞性肺病患者不同的性别。(a)的血清水平S1P中检测出男性和女性慢性阻塞性肺病患者。(b)的血清水平S1P中检测出女性和男性COPD患者不同的成绩。
补充2。补充表1:人口统计信息和临床特点。