文摘
Brevilin (BA)、倍半萜烯内酯隔绝石胡荽属最小值确定了草,表现出强大的抗癌活性。然而,英航的潜在药理效应和机制在调节内皮细胞(EC)血管生成,肿瘤生长的一个关键事件,了解甚少。在这项研究中,英航是显示显著防止血管内皮生长因子(VEGF)诱导EC血管生成能力在体外,体外,和在活的有机体内。后续功能化验显示,英航剂量依赖性抑制VEGF-stimulated生存、增殖,迁移,并引发细胞凋亡活动在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs),以及抑制凋亡bcl - 2蛋白的表达,增加caspase-3 proapoptotic蛋白质的表达和伯灵顿,和抑制PI3K / AKT通路。与此同时,英国航空公司也能够去偏光线粒体membranal渗透率(MMP),线粒体超氧化物累积加速,诱导细胞内活性氧(ROS)生产、和HUVECs减少细胞内谷胱甘肽(GSH)。此外,mitochondria-specific超氧化物清道夫Mito-TEMPOL和广谱抗氧化剂N-acetyl-cysteine (NAC)戏剧性地废除BA-induced线粒体功能障碍和线粒体ROS生产,造成PI3K / AKT途径的降级和抑制细胞凋亡,最终纠正受损内皮行为生存,生长、迁移和血管生成。总的来说,我们的数据首次发现了一个新的血管生成的机制影响血管EC英航的一个基于mitochondrial-dependent ROS的规定生产过剩。
1。介绍
植物的天然产品已经公认显示强大的治疗效果在各种人类疾病(1]。其中,抗肿瘤活性的天然产物(目前已经收到了越来越多的关注2]。Brevilin (BA),一个自然的倍半萜烯内酯,是净化石胡荽属最小值草,中药(TCM)最初用来缓解鼻塞,哮喘,咳嗽3]。最近的研究揭示了英航在抗肿瘤的功效活动,尤其是乳腺癌的3,4),胃癌5)、结肠癌癌(6),肺癌7,8),胶质母细胞瘤(9],黑色素瘤[10),多发性骨髓瘤(11),而鼻咽癌(12]。具体地说,英航抑制增殖、迁移和入侵,在某种程度上,通过抑制信号通路,包括JAK2 / STAT3和PI3K / AKT / mTOR [3,4,6,7,13]。此外,英国航空公司也通过增加NOX2和NOX3-mediated细胞凋亡的线粒体活性氧(ROS)生成(3,7]。
血管(血管萌芽),新毛细血管的萌芽在先前存在的血管内皮细胞(EC),在胚胎血管发育和分化中扮演着关键角色,伤口愈合、器官再生(14,15]。它还有助于肿瘤的生长和转移的进展取决于新血管形成,这是由化学信号从细胞癌在一个快速增长的阶段16]。事实上,这种信号激活特定基因在正常宿主组织周围,导致蛋白质,如proangiogenic因素,鼓励新血管的生长实体肿瘤(17]。血管内皮生长因子(VEGF)、一个proangiogenic因素,适当的肿瘤血管发展是一个关键的中介,由癌基因表达的调节,生长因子,和缺氧18- - - - - -20.]。VEGF介导血管EC生存,渗透、扩散和迁移的绑定和激活自身磷酸化酪氨酸激酶受体(VEGFR-2) [21- - - - - -23]。由于这一事实,可以模仿肿瘤相关血管生成诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs) VEGF (24]。一系列的抗血管新生药物被发明和批准用于临床应用不同的癌症,如抗体(初,贝伐单抗和ramucirumab),小激酶抑制剂(lenvatinib pazopanib,索拉非尼),和融合蛋白(aflibercept) [25- - - - - -28]。然而,临床观察表明,这些试剂可能会导致广泛的有毒副作用和不满意的药代动力学行为,并最终产生耐药性,限制治疗结果(29日,30.]。因此,较高的新型药物疗效和轻微毒性副作用对肿瘤血管生成是迫切的。
考虑到天然产物,尤其是来自植物,是有价值的资源对人类疾病寻找先导化合物;我们注意到大量研究表明天然产物的重要角色在调节肿瘤血管生成24,31日,32]。大量临床研究表明BA的优势对异种移植肿瘤的生长在动物模型,及其药理作用主要在肿瘤细胞中发现,同时,它仍然是未知的英航能否抑制肿瘤相关血管生成固体肿瘤进展的关键流程和特点(33]。因此,当前的研究调查了英航的潜在影响在体外,体外,和在活的有机体内内皮细胞血管生成和发现可能的机制。
2。材料和方法
2.1。抗体和试剂
兔子anti-NOX2(猫没有:AF7596)和anti-NOX4(猫没有:AF1498)抗体购自Beyotime生物技术。兔子anti-p-PI3K(猫没有:4228年代)和anti-PI3K(猫没有:4292)抗体购自细胞信号技术。兔子anticleaved caspase-3(猫没有:19677 - 1 - ap), anti-p-AKT(猫没有:28731 - 1 - ap)和anti-AKT(猫没有:60203 - 2 - ig)抗体,和鼠标anti-Bax(猫没有:60267 - 1 - ig)单克隆抗体是从Proteintech购买的。兔子anti-Bcl-2(猫没有:CAS7511)抗体从Bioworld购买。鼠标反β肌动蛋白(猫没有:A01010)从Abbkine获得的抗体。鼠标anti-BrdU(猫没有:66241 - 1 - ig)单克隆抗体购自BD生物科学,和FITC-Lectin(猫没有:L9381)购买的σ。
Brevilin(猫没有:CFN99694)最高的纯度> 98%等级从ChemFaces购买。的边后卫(猫没有:10099141 c)是获得Gibco(热费希尔)。胰蛋白酶(猫没有:C0201)与EDTA获得Beyotime生物技术。青霉素和链霉素(猫没有:P1400)和二甲亚砜(DMSO)(猫没有:D8371)从Solarbio购买生物技术。MTT(猫没有:CM7461)从Coolabor购买,和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(猫没有:P8465)从σ。线粒体膜电位测定工具包(JC-1)(猫没有:M8650)从Solarbio购买生物技术。H2DCFDA(猫没有:C400)和MitoSOX(猫没有:M36008)从英杰公司购买。膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(猫没有:E-CK-A211),结晶紫染色,N-Acetyl-L-cysteine (NAC)(猫没有:ST2524)从Beyotime购买生物技术。Mito-TEMPOL(猫没有:MX4808)从Maokang购买生物技术。VEGF(猫没有:100 - 20)从PeproTech获得。
2.2。动物和伦理语句
C57BL / 6雄性小鼠(8 - 10周大)被用于这项研究。动物是维持在大连医科大学实验动物中心在特定的无菌条件下,和所有动物实验伦理委员会批准了生物学和医学科学的大连医科大学。
2.3。基底膜基质堵塞试验
基底膜基质堵塞试验修改从我们以前的报告34]。短暂,我们0.5毫升注射人工基底膜含有100 ng小鼠VEGF和20与BA(100单位的肝素μ米)或溶剂(0.1% DMSO)背侧皮下的老鼠。基底膜基质插头被植入后7天。冻结部分插头(10μ米)准备确定新血管形成,血管密度被FITC-Lectin可视化积极的区域。
2.4。细胞培养
主要人类脐静脉内皮细胞分离(通过传代形成细胞(如前所述)(34,35]。简而言之,HUVECs ECM系统中补充了5%的边后卫,内皮细胞生长补充(ecg) 1%, 1%青霉素、链霉素和增长在37°C湿润5%股份有限公司2的气氛。
2.5。管形成分析
管的形成进行分析如我们之前所述研究[35]。英航预培养后表示浓度,HUVECs悬浮液(50μl 包含VEGF /毫升)0.1% BSA / ECM (30 ng / mL)被播种在ibiTreat血管生成幻灯片(Ibidi)预镀10μL基底膜基质(REF354248康宁),形成管状结构是由一个倒置显微镜观察6 h。血管生成能力进行评估的累计总管道的长度,该地区被管,和分支点的数量。
2.6。球体发芽试验
一个球体发芽试验进行按照我们之前发表(34]。细胞悬液( /毫升)准备在ECM中含有5%的边后卫和0.24%高粘度羧甲基纤维素(σ,9004-32-4)。每个球体由hung-drop文化25μL细胞悬液24 h。包含5%的收集与PBS球状体的边后卫和收获5分钟在1000转离心。进一步工作嵌入到胶原蛋白球状体解决方案包含鼠尾胶原蛋白我(2毫克/毫升,354236,康宁)缓冲与10×中199 (M650σ),和0.5 M氢氧化钠用于调整pH值为7.4,这是允许聚合在37°C为30分钟。同等体积的ECM的边后卫,表示5%的化合物(如两个折叠最终浓度)被添加到聚合胶原凝胶。内皮球体萌芽被倒置显微镜24 h后的可视化。血管生成能力被积累量化发芽从每个内皮球体长度。
2.7。主动脉瓣环试验
一个主动脉环试验进行按照我们以前的报告(34]。主动脉瓣环(1毫米宽)准备从C57BL / 6雄性小鼠和嵌入在25μL胶原球体发芽试验中描述的工作方案。聚合后30分钟37°C, ECM 2.5%小鼠血清和小鼠VEGF (30 ng / mL)申请体外主动脉瓣环的文化。BA单独或与其他试剂组合培养基中。7天后文化在37°C湿润有限公司5%2大气,内皮细胞芽从戒指被使用可视化FITC-Lectin (L2895σ),进一步评价积累了豆芽的长度。
2.8。MTT和BrdU公司化验
HUVECs被播种到96孔板(5000个细胞/)与BA浓度表示。对于一些实验,Mito-TEMPOL (2μ米)和南汽(3毫米)preincubated英航治疗前30分钟。MTT检测进行如我们之前所述研究[35]。简单,试剂最终浓度为0.5毫克/毫升是应用于细胞培养2小时,其次是与100年更换培养基μ介绍过o。d。邓肯L DMSO溶液,测定值在490 nm通过使用热科学Varioskan勒克斯。
BrdU公司化验,HUVECs孵化了BrdU (30μ米,猫。19 - 160,在黑暗中σ)2 h。后固定的4% PFA和透化作用的0.1% BSA / 0.5% Triton x - 100 / PBS,主要抗体BrdU (66241 - 1 - ig Proteintech)和Alex594-IgG二级抗体(8890年,细胞信号)按顺序应用可视化BrdU掺入荧光显微镜下(BX53,奥林巴斯)和评估BrdU-positive细胞人口的百分比。
2.9。细胞迁移试验
细胞治疗与BA或结合Mito-TEMPO和南汽与扩散试验相同。刮伤愈合和Transwell迁移进行了化验如前所述[35,36]。刮伤愈合试验,使用无菌200 HUVECs层被刮花了μL吸管,和细胞迁移的图像分别记录相同的字段在最初的12小时后。12小时内迁移净面积计算通过使用图像J。
Transwell迁移试验,在500年5%的边后卫ECM (HUVECs悬挂μL, 10000 /毫升)被播种到参议院8μm-pore大小(康宁REF363097)形成完整的单层和保持在37°C湿润5%股份有限公司2大气存在后12小时30 ng / mL VEGF / 5%的边后卫ECM在众议院。上层细胞从Transwell室,与PBS洗两次,固定在4% PFA 15分钟,然后沾0.1%结晶紫溶液和显微镜下观察移植细胞的数量。
2.10。细胞凋亡检测
细胞凋亡是衡量膜联蛋白V-FITC凋亡分析工具包(E-CK-A211 Elabscience)根据制造商的指示。简单地说,HUVECs被播种 细胞每在6-well板和表示的浓度BA处理Mito-TEMPOL(2的存在与否μ米)和南汽(3毫米)6-well板12 h。细胞被沾FITC-labeled膜联蛋白V和π在室温20分钟的黑暗和分析利用BD Accuri C6 +流式细胞术。
2.11。免疫印迹
免疫印迹进行如前所述[37]。简而言之,HUVECs受到sds - page和转移到硝化纤维膜。与特定的抗体和二次孵化后的抗体antimouse Dylight 680 (C90219-05 LI-COR)或antirabbit Dylight 800(90220年,LI-COR),膜被扫描使用《奥德赛》CLx成像系统(LI-COR),并采用图像工作室软件生成的图像。
2.12。线粒体膜电位的测量(MMP)
MMP的测量通过线粒体膜电位测定装备JC-1 (M8650 Solarbio)根据制造商的指示。短暂,HUVECs表示浓度BA处理Mito-TEMPOL(2的存在与否μ米)和南汽(3毫米)6-well板12 h。之后,这些细胞被收获,用PBS洗净、孵化与JC-1荧光探针为在黑暗中20分钟37°C。孵化后,细胞荧光强度检测使用BD Accuri C6 +流式细胞术。
2.13。测定线粒体超氧化物的生成
线粒体超氧化物含量测定用MitoSOX工具包(英杰公司)根据制造商的指示。短暂,HUVECs表示浓度BA处理Mito-TEMPOL(2的存在与否μ米),NAC(3毫米)12 h。之后,这些细胞被收获和孵化5μM MitoSOX试剂在黑暗中培养细胞10分钟在37°C。细胞的平均荧光强度(MFI)然后使用双相障碍检测Accuri C6 +流式细胞术。
2.14。测量细胞内活性氧(ROS)生成
细胞内ROS生成测量2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(H2DCFDA)工具包(英杰公司)根据制造商的指示。简单地说,HUVECs被播种和表示的浓度BA处理Mito-TEMPOL(2的存在与否μ米)和南汽(3毫米)6-well板12 h。之后,这些细胞被洗PBS和孵化H2DCFDA 15分钟在黑暗中。孵化后,发现细胞的小额信贷机构使用BD Accuri C6 +流式细胞术。
2.15。测量细胞内谷胱甘肽(GSH)
细胞内谷胱甘肽是衡量microreduced谷胱甘肽测定工具包(Solarbio)根据制造商的指示。简单地说,HUVECs被播种和表示的浓度BA处理Mito-TEMPOL(2的存在与否μ米)和南汽(3毫米)6-well板12 h。药物治疗后,细胞收获和发现使用热科学Varioskan勒克斯405海里。谷胱甘肽的内容表示为μ普罗特克/毫克。
2.16。统计分析
数据了 至少有三个独立的实验。使用GraphPad棱镜8执行统计分析软件与单向方差分析后跟Bonferroni因果检验。的值 或更少的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Brevilin抑制内皮细胞血管生成
检查英航的影响(化学结构如图S1)内皮血管生成,主要HUVECs首先对待英航表示剂量(清廉μ米),并进一步进行在体外血管生成化验。我们发现,英航将剂量依赖性防止HUVECs VEGF-stimulated基底膜基质表面的成型能力(数据1(一)- - - - - -1 (d))。此外,尽管VEGF促进人类内皮球状体嵌在胶原基质的结果,效果在很大程度上扰乱了BA-treated细胞(数字1 (e)和1 (f))。此外,血管生成能力的本地电子商务由主动脉环发芽试验,测定中VEGF增加内皮从孤立的主动脉环在数量和累积长度(凝集素B4+EC);然而,响应被英航治疗(数据大大减少1 (g)- - - - - -1(我))。进一步证实了我们的结论在活的有机体内,我们评估的新血管形成基底膜基质包含溶剂或BA的插头,皮下植入到老鼠后7天,发现插头与英航浸渍展出更isolectin B4-positive细胞控制权插头(数字1 (j)和1 (k)),表明形成血管受损。在此,我们的数据表明BA与EC血管生成在体外,体外,和在活的有机体内。
(一)
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3.2。Brevilin减少初级HUVECs的增殖和迁移
血管生成是一个微妙的细胞过程,要求内皮细胞进行活跃的增殖和迁移38,39]。BA-impaired血管生成与电子商务的联系能力扩散和运动性分别检查。如图2(一个),英航显著抑制HUVECs扩散浓度的方式在48 h。一贯的剂量依赖性降低BrdU公司观察与英航HUVECs治疗24 h(数字2 (b)和2 (c))。此外,分段核是经常出现在高剂量BA (10μ米)治疗细胞(箭头示图2 (b)),这表明BA影响电子商务生存的潜力。
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(g)
从生长抑制,避免干扰的影响BA对HUVEC能动性决定在一个短的时间间隔(12小时)。因此,英航显示剂量依赖性抑制影响EC运动性分别刮伤愈合试验(数据验证2 (d)和2 (e)通过一个过滤器(数据)和轮回2 (f)和2 (g))。这些数据表明,缺陷扩散和迁移功能可能导致BA-impaired EC血管再生。
3.3。Brevilin诱导细胞凋亡和抑制PI3K / AKT信号通路在初级HUVECs
考虑到核结构中观察到的异常BA-treated HUVECs(图2 (b)),我们认为这可能会影响电子商务生存。事实上,短12 h,英航经常使细胞发生收缩在形状、超然和漂浮在单层培养HUVECs(箭头示图3(一个))。进一步评估BA对EC的生存状态的影响,流式细胞仪分析显示,BA-enforced HUVECs接受早期细胞凋亡明显AV浓度增加+细胞群( %控制与 % 2μ英国航空公司, % 5μM英航, % 10μM英航,如图3 (b)和3 (c))。在英航似乎无法触发EC坏死,类似的AV+/π+细胞群中确定控制和BA-treated HUVECs(数字3 (b)和3 (d))。caspase-3的活动来确认我们的发现,细胞凋亡早期的一项指标,测定。本着积极乳沟caspase-3增加(数据3 (e)和3 (f)),它的活动是剂量依赖性升高BA-challenged HUVECs(图3 (g))。因此,BA-induced穷人生存分子支持的增加表达的伯灵顿和bcl - 2表达的减少(数据3 (e)和3 (f))以及失活的PI3K / AKT通路(数字3 (h)和3(我))。
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3.4。Brevilin破坏线粒体膜电位和诱导活性氧积累
伯灵顿和bcl - 2被定位在线粒体膜和蛋白表达的失调通常反映了线粒体功能的变化。因此,英航的影响线粒体琥珀酸脱氢酶的异常进行评判,活动,我们发现他们将极大地禁止英航在12 h(图4(一)),表明合成破坏线粒体功能。验证,MMP HUVECs被JC-1试剂进行评估,我们发现BA将非常去偏光MMP在JC-1单体人群的增加存在剂量依赖的相关性(FITC+/聚乙烯- - - - - -,数据4 (b)和4 (c))。能够很好的证明,MMP受伤禁用线粒体氧化磷酸化过程,产生过多的活性氧,并进一步引发细胞凋亡(40]。在下一步中,MitoSOX和H2DCFDA染色结果表明BA显著增强线粒体超氧化物(积累数据4 (d)和4 (e))和细胞内ROS(图4 (f)HUVECs)水平,而谷胱甘肽含量相对地下降(图4 (g))。考虑到线粒体呼吸链和活跃NADPH氧化酶类(nox)是细胞内活性氧的主要来源(41,42),我们试图确定是否受到NOX2和NOX4英航ES。有趣的是,NOX2的表达和NOX4 BA-treated组相比没有变化控制(图S2 (a))。综上所述,我们的数据显示,英国航空公司可能会干扰细胞内氧化还原平衡,尤其是在线粒体超氧化物生成,可能占内皮功能受损的生存,发展,和迁移,进一步收缩血管生成能力。
(一)
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3.5。Mito-TEMPOL和N-Acetyl-Cysteine显著逆转Brevilin A-Induced氧化还原失衡,线粒体功能障碍,细胞凋亡主要HUVECs
解决在BA-mediated线粒体ROS障碍的决定性作用,Mito-TEMPOL,线粒体特定超氧化物清除剂,和N-acetyl-cysteine (NAC),传统的氧化剂,受雇于BA-treated HUVECs,和功能分析相应的评估。首先,我们发现,氧化还原平衡很容易逆转Mito-TEMPOL和发生的NAC BA-treated HUVECs,规范化水平的线粒体超氧化物(如图所示的数据5(一个)和5 (b)),细胞内ROS(图5 (c))、谷胱甘肽(图5 (d)在控制细胞)。此外,Mito-TEMPOL和NAC治疗也可以显著逆转BA-induced琥珀酸脱氢酶失活和线粒体MMP的下降(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。完全令人信服,Mito-TEMPOL和南汽都发现救援BA-induced内皮凋亡表型(数字6(一)- - - - - -6 (c)),进一步支持规范化伯灵顿,bcl - 2和caspase-3表达式(数字6 (e)和6 (f)(图),caspase-3活动6 (d))。
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3.6。Mito-TEMPOL和N-Acetyl-Cysteine缓解Brevilin的抑制作用在血管内皮细胞增殖,迁移和血管生成
接下来,我们进一步研究了ROS的因果关系BA-induced内皮功能障碍Mito-TEMPOL和南汽。正如所料,Mito-TEMPOL和南汽都表现出强大的能力扭转BA-suppressed扩散(图7(一))和BrdU公司(数字7 (b)和7 (c)在HUVECs)。同时,刮伤愈合试验和Transwell迁移试验都证明更好的恢复运动性BA-treated HUVECs Mito-TEMPOL和NAC(数字7 (d)- - - - - -7 (g))。此外,我们发现Mito-TEMPOL和南汽将大大缓解VEGF-triggered英航的抑制内皮产物在人类EC(数字球状体8(一个)和8 (b))和小鼠主动脉环(数字8 (c)和8 (d))。在分子水平,BA-inactivated PI3K / AKT信号也会被Mito-TEMPOL和NAC(数据恢复8 (e)和8 (f))。我们的数据表明,不规则的线粒体ROS overgeneration可能在血管生成主要占BA-mediated EC缺陷。
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(b)
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因此,我们想提出一个可能解释英航对抗血管生成的机制。如图9,VEGF信号生成正确的ROS源自氮氧化物和线粒体,激活内皮细胞生存、增殖、迁移,并最终促进血管生成。然而,英航将以一位身份不明的方式破坏线粒体膜电位,引起overgenerated线粒体超氧化物。这种过多的过氧化物引发mitochondria-dependent凋亡或可能传播在细胞和破坏氧化还原平衡和削弱生存信号转导(PI3K / AKT)。BA-induced过多活性氧导致细胞凋亡,增长逮捕,运动性内皮细胞中观察到的缺陷,从而导致损伤的血管生成。
4所示。讨论
血管生成在固体肿瘤发生中起着举足轻重的作用,促进养分供应和减少代谢废物(33]。癌的细胞坏死或凋亡细胞死亡在缺乏循环,因此,使其抗肿瘤血管生成的主要目标代理(43]。解开抗血管导致的潜在治疗新方法针对肿瘤。英国航空公司,一个活跃的组成部分石胡荽属最小值草药,牵连了理想的抗肿瘤功效在抑制多种肿瘤细胞的能动性,通过抑制各种生存和增殖信号通路和/或诱导ROS-dependent在多个肿瘤细胞凋亡(3,4]。它对我们建议英航是一个有前途的抗肿瘤化合物。然而,它的抗血管新生的潜力,肿瘤生长的另一个重要方面,已经完全未知的。
在这项研究中,我们已经表明,英国航空公司可以有效地抑制VEGF-induced管形成和豆芽初级HUVECs产物。此外,我们发现,英航也有效地废除VEGF-stimulated内皮发芽体外培养小鼠主动脉环和抑制新血管形成VEGF-containing基底膜基质插头植入老鼠。鉴于现有的脉管系统的新血管的形成主要是由VEGF-stimulated茎细胞增殖,提示细胞迁移在血管生成的第一步33,39),英航的增殖和迁移的影响血管EC进行调查。不意外,英航剂量依赖性抑制VEGF-induced HUVECs增殖活动在48 h。此外,英航还concentration-dependently拒绝运动性HUVECs在12 h,较短的观测时间间隔,是为了被受损扩散的影响较小。因此,我们的数据提供了确凿的证据证明英航首次通过抑制VEGF-mediated极大的抗血管新生能力的内皮细胞增殖和迁移。
Neovasculature曾被报道是由不同的机制,主要包括EC细胞凋亡的诱导44),抑制电子商务改造(38),或chemorepulsion EC (45]。观察异常核结构和apoptotic-like形态学HUVECs接受高剂量的BA (10μ米)提醒我们,BA可能通过激活凋亡信号通路诱导EC死亡。利用膜联蛋白V / PI染色法、流式细胞仪分析证实,确实BA诱导细胞凋亡早期人口的增加而不影响坏死细胞百分比。分子水平的结果就会进一步支持英航增加活跃caspase-3和伯灵顿bcl - 2表达和抑制的表达式。一致,以前的研究也表明,获得增强的细胞凋亡在多种肿瘤细胞,造成antitumoral英航的行为(3,4,6,7,10,12]。
Caspase-3是一个著名的刽子手的内在(mitochondrial-dependent,涉及bcl - 2蛋白家族)和外部(表面受体介导)细胞凋亡通路46]。mitochondria-mediated细胞凋亡过程中,线粒体渗透性转换孔开放降低MMP的释放到细胞质中线粒体proapoptotic因素(47]。Proapoptotic因素可以激活半胱天冬酶级联,导致核凝结和诱导二次ROS生产,进而导致线粒体membranal去极化(40]。因此,我们的数据显示,英国航空公司减少bcl - 2抗凋亡和伯灵顿proapoptotic蛋白表达增加,导致中断外线粒体membranal渗透率和启动线粒体凋亡通路46]。符合之前的表型在癌症细胞系,我们还发现,英航显著诱导细胞内活性氧的生产,减少细胞内谷胱甘肽和去极化的MMP HUVECs [3,6,7,9]。此外,MitoSOX染色显示,BA可能大大增加mitochondrial-induced HUVECs超氧化物堆积,暗示BA-promoted总ROS内容可能是派生的,至少部分,从受损的线粒体氧化还原平衡。进一步验证想法,英航ROS升高导致mitochondrial-dependent凋亡通路,两个不同的anti-ROS试剂应用。在我们目前的研究中,NAC(广谱抗氧化剂,直接消除活性氧,如次氯酸、过氧化氢、过氧化物,和羟基自由基)可以在细胞内主要职责BA-induced氧化压力水平的总活性氧和线粒体超氧化物状态,这也与HUVECs恢复谷胱甘肽含量有关。重要的是,尽管完全抑制BA-generated过度线粒体超氧化物,Mito-TEMPOL(特定mitochondrial-targeted抗氧化剂和超氧化物歧化酶模拟)被发现几乎完全正确BA-induced细胞内氧化还原失衡可以被减少ROS和海拔的总内容谷胱甘肽的水平。这些发现表明BA-induced细胞凋亡的线粒体活性氧的重要性。过多的活性氧生成主要由ectopic-activated NADPH氧化酶类或释放控制线粒体超氧化物(41]。在EC, NADPH氧化酶类,尤其是NOX2 NOX4,产生超氧化物阴离子迅速转化为过氧化氢,从而促进二次线粒体活性氧的生产,进而进一步提高ROS-dependent VEGFR-2信号(48]。从以往的研究被称为肿瘤暴露,英航将刺激氮氧化物表达式,我们进一步怀疑NADPH氧化酶类参与英航先进ROS在EC地位造成的。然而,我们发现,英航无法改变NOX2的蛋白表达和HUVECs NOX4。这种不一致可以推断变量遗传背景的细胞类型中使用个人研究;至少HUVECs主要在我们的案例中是正常的内皮细胞,这当然是大大不同于癌细胞系如MCF-7细胞在前面研究[3]。另外,我们的数据进一步表明,Mito-TEMPOL和南汽几乎逆转BA-induced内皮细胞凋亡的正常化MMP upregulation的bcl - 2, downregulation伯灵顿,必然地防止caspase-3 overactivation。因此,我们建议BA-induced内皮细胞凋亡可能在很大程度上依赖于线粒体超氧化物的生产过剩。
先前的研究已经表明,英航有效抑制结肠癌细胞腺癌CT26通过促进自噬的增长由mTOR / PI3K / AKT信号(6]。与此同时,英航抑制细胞增殖和凋亡在鼻咽癌细胞抑制PI3K / AKT / mTOR途径[12]。英航也显著诱发氧化应激在U87胶质母细胞瘤细胞通过增加磷酸化的压力激发了物和p38蛋白(9]。许多最近的报告表明,英国航空公司有效地抑制肺癌、黑色素瘤、乳腺癌细胞生长抑制JAK2 / STAT3通路(3,4,7,10]。尤其是homocysteine-mediated EC凋亡,交互的mitochondrial-dependent凋亡信号通路和PI3K / AKT /以挪士信号通路已经建立(40]。因此,我们还研究了英航的影响在HUVECs这些信号通路的表达。值得注意的是,我们发现BA-suppressed PI3K / AKT通路,而JAK2 / STAT3和物/ p38通路没有影响(数据未显示)。期待地,Mito-TEMPOL和南汽都容易恢复BA-induced AKT和PI3K脱磷酸化,必然地纠正内皮受损的行为在生存,生长、迁移和血管生成。这些数据表明,抑制PI3K / AKT通路是次要的线粒体活性氧的生产过剩,可能导致BA-inhibited内皮血管再生。
考虑到我们的数据中获得初级HUVECs和野生型老鼠或主动脉组织时,英航的疗效和分子机制的再现性是否tumoral EC并不包括在当前研究中由于方法和材料的限制,需要在进一步的调查处理。
5。结论
总之,本研究首次确定了英航的抗血管新生作用在血管EC通过抑制细胞生长、迁移和生存。机械化,BA可能直接导致线粒体功能障碍,引起线粒体ROS生产过剩,抑制PI3K / AKT通路,诱导细胞凋亡。因此,我们的研究进一步表明,抗血管作为英航药理机制在肿瘤抑制的新见解。
缩写
| 芭: | Brevilin一 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子 |
| HUVECs: | 人类脐静脉内皮细胞 |
| MMP的: | 线粒体membranal渗透率 |
| ROS: | 活性氧 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| 南京: | N-acetyl-cysteine |
| 电子商务: | 内皮细胞 |
| 中医: | 中药 |
| ecg: | 内皮细胞生长的补充。 |
数据可用性
在当前的研究中获得的数据都是可以从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
赵峰和施Lei负责研究设计。援助,甄浩,浩郑负责进行实验。拯救魏甄豪负责数据采集。援助,郝郑,远华秦负责数据分析。赵峰,Lei史和拯救魏负责写手稿。所有的作者都对本文的完成起到了推波助澜的作用。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(格兰特数字:81870360和81702626),健康委员会厦门,福建,中国(2020 ggb063)和辽宁省计划基本医疗科学学科。
补充材料
图S1: Brevilin化学结构。图S2: Brevilin的影响在NOX2和NOX4的表达。(补充材料)