文摘

赖氨酸β-hydroxybutyrylation (Kbhb)是一种新发现的蛋白质翻译后修饰(天车)来自β羟基丁酸(BHB),酮体代谢的产物在肝脏。BHB可以作为能量来源,抑制氧化应激中发挥作用。BHB的血浆浓度可能会增加20 mM在饥饿和病理条件。尽管进展,细胞来源于肝外组织如何应对环境BHB升高在很大程度上仍是个未知数。鉴于BHB可以显著Kbhb开车,我们为BHB-induced赖氨酸β-hydroxybutyrylome和acetylome定量蛋白质组学。共有840个独特Kbhb网站429蛋白被发现,与42个站点39蛋白质在应对BHB增长超过50%。结果表明,调节引起的Kbhb BHB参与氨酰生物合成,2-oxocarboxylic酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解/糖质新生,丙酮酸代谢途径。此外,一些BHB-induced Kbhb基质显著参与癌症等疾病。综上所述,我们研究赖氨酸的动力β环境BHB -hydroxybutyrylome和acetylome诱导,揭示了Kbhb的角色在调节各种生物过程和膨胀BHB的生物功能。

1。介绍

蛋白质翻译后修饰(天车)可以改变蛋白质的理化性质,影响空间构象、活动、亚细胞定位、蛋白质折叠,等等1]。他们扮演重要的角色在不同的细胞过程,如基因表达调控、细胞分裂,蛋白质降解,信号转导,和蛋白质相互作用[2]。深入研究蛋白质的天车具有重要意义在阐述生命活动的机理,发现药物靶标,为临床治疗奠定了基础(3]。随着高分辨率质谱(MS)的发展,蛋白质组学技术,许多新型的多功能天车近年来已确定,如2-hydroxyisobutyrylation赖氨酸、苯甲酰化,lactylation [4- - - - - -8]。

大量的证据表明在哺乳动物细胞内源性代谢物紧密耦合的铝(9,10]。一个值得注意的例子是β羟基丁酸(BHB),肝脏脂肪酸氧化和分解的中间产品(11]。BHB、乙酰乙酸和丙酮统称为酮,BHB约占80% (12,13]。BHB可以作为内源性生物活性小分子,重要的神经保护作用,心血管疾病和其他组织和器官(12,14- - - - - -18]。最近,我们发现了一种新型的多功能天车,赖氨酸β-hydroxybutyrylation (Kbhb),表明BHB作为前体Kbhb [19]。我们的结果表明,饥饿,生酮饮食和药物诱导糖尿病可以提高BHB代在肝脏,进而调节细胞信号函数(20.- - - - - -22]。值得注意的是,当血糖水平很低,可以生成BHB肝脏中耗能和运输到其他组织作为一种补充能源(23]。在这样的条件下,细胞来源于肝外组织如何应对高环境BHB尚不清楚。

探索的角色Kbhb BHB水平升高引起的途径,我们定量分析的动态Kbhb回应环境BHB小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞。总的来说,我们认为840年独特Kbhb网站429个蛋白质,来自39个蛋白和42个地点均增加了50%以上( )为了应对BHB。功能富集分析表明显著调节Kbhb网站参与氨酰生物合成,2-oxocarboxylic酸代谢,柠檬酸循环,丙酮酸代谢,果糖和甘露糖代谢、糖酵解和糖质新生途径。

我们还发现了5587个赖氨酸乙酰化蛋白质(Kac)网站在2303年。与Kbhb途径不同,动态卡茨蛋白质引起的环境BHB鞘脂类信号,主要是相关necroptosis,细胞衰老,ubiquitin-mediated蛋白质水解途径。Kbhb和卡茨途径的多样性表明他们不同的角色来响应BHB升高,因此,协调不同的下游细胞过程。

此外,我们发现,一些动态Kbhb站点位于重要位置对蛋白质基质/代数余子式绑定,这意味着BHB升高可能影响基质蛋白质的功能通过诱导Kbhb在这些位置。

在一起,本研究确定并量化Kbhb和卡茨网站的动态响应环境BHB,扩大了Kbhb的角色和奠定了基础为进一步探索Kbhb通路的机制在各种生理和病理条件下。

2。实验部分

2.1。材料

潘anti-Kbhb(铝- 1204)和anti-Kac抗体(铝- 104)从多功能天车生物学实验室购买。Anti-histone H3抗体(M1306-4)从Huabio购买。Anti-beta肌动蛋白抗体(66009 - 1)从Proteintech购买群体。“光”(12C614N2赖氨酸,12C614N4arg)(乌尔姆- 8766 pk)和“重”(13C615N2赖氨酸,13C615N4北欧共同劳力市场- 291 h - arg) (pk)氨基酸从剑桥同位素实验室购买。胰蛋白酶用于修改排序从Promega购买(麦迪逊,WI)。

2.2。稳定同位素标记和BHB治疗细胞

MEF细胞在DMEM培养自由的赖氨酸和精氨酸,10%的透析的边后卫,“光”(12C614N2赖氨酸,12C614N4arg)或“重”(13C615N2赖氨酸,13C615N4arg)氨基酸(100 mg / L)和青霉素和链霉素1% 5%的股份有限公司2气氛在37°C。至少7代的细胞培养,确保标签效率超过98%。MEF细胞治疗5毫米BHB 24小时以进行蛋白质组学。

2.3。蛋白质的提取和胰蛋白酶消化

根据前面描述的方法(24),收集到的“重”和“轻”细胞与预冷洗了三次磷酸盐。然后,我们添加了蛋白裂解缓冲(EDTA 8 M尿素,2毫米,3μM TSA, 50毫米,5毫米德勤,1%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒III) resuspend细胞,用声波dismembrator (JY96-IIN市景心,中国上海)冰。在18 000 g离心后3分钟在4°C,蛋白质转移到一个新的管由BCA方法并确定浓度。蛋白质从“重”和“轻”细胞同样混合和减少1 h和10毫米二硫苏糖醇在37°C和烷基化和20毫米为45分钟在黑暗环境中碘乙酰胺25°C。然后,块多余的碘乙酰胺20毫米半胱氨酸。接下来,NH 100毫米4HCO3添加到蛋白质样品确保尿素浓度小于2米。然后,胰蛋白酶在1:添加到蛋白质50 trypsin-protein质量比消化在一夜之间获得肽样本。

2.4。Immunoaffinity浓缩

Kbhb和卡茨肽immunoaffinity丰富如前所述[24]。短暂,肽溶解在NETN缓冲区(100毫米氯化钠,1毫米EDTA, 50毫米Tris-HCl NP-40 0.5%, pH值8.0)和孵化20μL潘潘anti-Kbhb或anti-Kac抗体结合琼脂糖珠与温柔的摇瓶在一夜之间在4°C。为了消除非特异性富集,我们洗的珠子NETN缓冲和ddH的四倍2O两次。最后,使用0.1%三氟乙酸,筛选了肽被蒸发干燥在真空和脱盐质谱鉴定。

2.5。质谱分析

一个nanoElute nanoflow UHPLC同时在线混合困离子迁移spectrometry-quadrupole飞行时间质谱仪(timsTOF Pro,力量Daltonics,不来梅,德国)。肽分离在60分钟300 nL分钟的流量−1在一个 列拉发射器小费,挤满了1.9μm ReproSil-Pur C18-AQ粒子(Maisch博士,德国)。移动阶段A和B是0.1%甲酸乙腈水和0.1%甲酸80%,分别。LC方法组成的2 - 85%的梯度高效液相色谱流动相B(0.1%的甲酸乙腈, )在流动相乙腈(0.1%甲酸和2%水)。筛选了肽受到毛细管源timsTOF Pro质谱紧随其后。喷雾电压为1.60伏特。TOF探测器前体和片段进行了分析,用MS / MS扫描范围从100年到1700年 。timsTOF Pro积累串行并行操作碎片(PASEF)模式。前体与电荷状态0到5被选为碎片,和10 PASEF-MS /女士扫描获得每循环。动态排斥被设置为30岁。

2.6。数据库搜索和数据过滤标准

对获得的原始文件,执行搜索基于UniProt鼠标蛋白质数据库(17027个条目,http://http: / / www.uniprot.org)使用峰值Studio(版本10.5,生物信息学解决方案公司)。被指定为胰蛋白酶酶、肽质量公差是设定在20 ppm,女士和女士/质量公差是0.05哒。甲硫氨酸残基的氧化(+ 15.99 Da),乙酰化作用的蛋白质N-termini Da) (+ 42.01,β-hydroxybutyrylation赖氨酸、赖氨酸乙酰化作用是指定为变量的修改。最大的错过了分裂/肽被设置为3。肽序列匹配的人类UniProt数据库得到 蛋白质和多肽。一个诱饵融合法为罗斯福计算峰值。定量数据生成的山峰问模块使用“前体离子量化”在“量化”选项下,和“SILAC-2plex (R10 K8)”方法被选中。

2.7。生物信息学分析

类似于我们以前报道的方法(24),用超几何测试clusterProfiler包在R KEGG通路富集分析(25]。蛋白质相互作用网络的动态Kbhb蛋白质被字符串数据库(v11,http://www.string-db.org/)[26)和可视化Cytoscape (v.3.8.2) [27]。

3所示。结果

3.1。系统分析BHB Kbhb的反应

Kbhb是一种新发现的天车由脂类代谢的产物,BHB(图1(一))。探索Kbhb通路的角色来响应环保BHB,我们进行了定量Kbhb和卡茨MEF细胞蛋白质组学研究处理BHB 24小时(5毫米)。全球识别Kbhb和卡茨网站和描述他们的多样化BHB刺激,我们使用稳定同位素标记的氨基酸在细胞培养(SILAC)结合immunoaffinity浓缩和串联的质量分析方法。三个生物复制实验进行中MEF细胞新陈代谢贴上“重”的氨基酸(13C615N2赖氨酸,13C615N4arg)和“轻”氨基酸(12C614N2赖氨酸,12C614N4分别arg)治疗和治疗(图1 (b))。细胞溶解的蛋白质从“重”和“轻”细胞同样结合,胰蛋白酶消化。然后,Kbhb和Kac-containing肽富含固定化anti-Kbhb anti-Kac抗体紧随其后HPLC-MS timsTOF Pro / MS分析质谱仪(力量)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
系统分析的赖氨酸β-hydroxybutylome acetylome。(一)说明acetyl-lysine和酶促反应β-hydroxybutyryl-lysine。(b)实验流程示意图表示的识别和量化Kbhb和卡茨MEF细胞。(c)饼图显示了三个生物复制的实验重现性。

完全,我们确定840独特Kbhb网站在429蛋白质和5587卡茨网站2303个蛋白质。此外,64% Kbhb网站和70%卡茨网站被确定在至少2生物复制,展示良好的再现性(图1 (c)和表S1、S2、S3)。

3.2。表征Kbhb蛋白质组

首先,我们探讨的亚细胞分布在MEF Kbhb基质细胞通过细胞间分析。结果显示,26%的Kbhb蛋白质在细胞核本地化,而74%是在细胞溶质(图2(一个))。然而,只有10%的Kbhb蛋白在线粒体注释。这些结果不同于我们之前报道Kbhb蛋白质组在HEK293细胞中,其中78%的Kbhb蛋白在核本地化(19]。在这项研究中,74%的Kbhb蛋白质是完全或部分局部细胞溶质,表明Kbhb通路可能扮演不同的角色之间的细胞和组织来源。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
Kbhb蛋白质组的特征。(一)维恩图显示了Kbhb蛋白质的细胞间分布。(b)的分布Kbhb网站数量/蛋白质。(c)条形图显示了蛋白质包含超过6 Kbhb网站。(d)共识序列标识显示了一个代表序列BHB-induced Kbhb网站。

确定Kbhb蛋白质有着不同的网站数量。例如,240(56%)的蛋白质有一个Kbhb网站,和189年(44%)的蛋白质至少有两Kbhb网站(图2 (b)和表S3)。此外,一些蛋白质被Kbhb大量修改。Plectin(我们),一种蛋白质,这种蛋白质如何连接与微管、微丝和中间丝锚中间纤维细胞桥粒和半桥粒(28)包含13 Kbhb网站。热休克蛋白HSP 90 -β(Hsp90ab1)是一种分子伴侣蛋白,促进成熟,结构维护和适当的监管特定目标蛋白参与细胞周期控制和信号转导29日,30.),有16个Kbhb网站。此外,肌凝蛋白重链9 (Myh9),参与胞质分裂,细胞形状、分泌,和限制31日,32)(图17 Kbhb网站2 (c)和表S3)。多个Kbhb站点在这些蛋白质可能产生重大影响的细胞功能。

接下来,我们确定了丰富的图案BHB-induced使用IceLogo Kbhb网站。旁侧序列分析表明,疏水性氨基酸低浓缩铀和板式换热器在+ 1位置过多,而酸性氨基酸Asp或Glu丰富在+ 3和1的位置(图2 (d))。这些结果不同于我们之前报道Kbhb主题在HEK293细胞中,正电荷赖氨酸的首选最多的职位(6、5、4、3 + 3 + 4 + 5 + 6),而代表名额不足的负电荷氨基酸−2位置[19]。差异表明环境BHB可能诱发Kbhb在特定底物在Kbhb转移酶。

3.3。定量分析的BHB-Induced Kbhb蛋白质组

免疫印迹分析证实,BHB MEF细胞治疗全球Kbhb水平明显增加,而全球卡茨水平略(图的影响3(一个))。概要Kbhb的动力学和卡茨,我们定量地分析了BHB-induced Kbhb和卡茨蛋白质组。在确定Kbhb网站,其中42来自39蛋白质增加了50%以上( )为了应对BHB治疗MEF细胞(图3 (b)和表S3),而只有6 Kbhb网站从6蛋白下降了33% ( )。不像Kbhb,同样数量的卡茨网站增加或减少BHB治疗后(174年卡茨网站增加了超过50%,189年卡茨网站减少了33%,分别)(图3 (c)和表S2)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
定量分析的BHB-induced Kbhb和卡茨蛋白质组。(一)BHB增强Kbhb MEF细胞的蛋白质。组蛋白Kbhb和卡茨水平分析了控制和BHB MEF细胞通过immuno-blotting表示抗体治疗。(b)的散点图显示了量化Kbhb和卡茨网站。(c)维恩图显示了调节Kbhb之间没有交叉和卡茨网站。(d) Kbhb KEGG通路和卡茨BHB引起的蛋白质组。

接下来,我们比较了Kbhb和卡茨网站BHB治疗后增加了超过50%。引人注目的是,没有一个是重叠(图3 (c)),这表明环境BHB细胞通路通过Kbhb和卡茨差异的影响。支持这种想法,京都基因和基因组的百科全书(KEGG)路径分析的动态Kbhb和卡茨基质透露,BHB-induced卡茨在粘着斑主要目标蛋白质丰富,蛋白聚糖在癌症和RNA运输,而蛋白质与BHB-induced Kbhb参与碳代谢、氨基酸的生物合成、糖酵解/糖质新生(图3 (d))。

3.4。BHB生物功能可能受到影响

为了更好地理解环境BHB Kbhb诱导的角色,我们把所有Kbhb和卡茨网站分为四组平均根据其动力学响应BHB治疗(按升序/控制治疗的比率)。然后,KEGG和基因本体论(去)生物过程每组进行分析。的调整 值计算和规范化 - - - - - -比较四组(图的分数4)。在KEGG类别,氨酰生物合成途径相关(调整 值= 1.50 - - - - - -04),2-oxocarboxylic酸代谢(调整 值= 1.46 - - - - - -05),柠檬酸循环(柠檬酸循环)(调整 值= 1.01 - - - - - -04)显著富集Kbhb基质处理/控制高比率,而核糖体(调整 值= 3.87 - - - - - -05),细菌侵入上皮细胞(调整 值= 2.12 - - - - - -03)和碳代谢(调整 值= 1.72 - - - - - -03)途径是富含低Kbhb BHB治疗水平。不像Kbhb necroptosis(调整 值= 1.51 - - - - - -04),信使rna监测通路(调整 值= 3.41 - - - - - -(03)和鞘脂类信号调整 值= 3.40 - - - - - -02)途径主要是富含卡茨水平增加,而蛋白质与降低卡茨水平以应对BHB治疗主要是参与核质传输(调整 值= 1.81 - - - - - -06),剪接体(调整 值= 1.85 - - - - - -11)和碳代谢(调整 值= 4.08 - - - - - -04)的途径。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
KEGG和生物过程分析。(一)KEGG卡茨蛋白质组的途径。卡茨蛋白质组(b)的注释。(c) Kbhb蛋白质组的KEGG通路。(d) Kbhb蛋白质组的去注释。Kbhb和卡茨网站平均分成四组根据他们的动力学响应BHB治疗(按升序/控制治疗的比率)。

符合以上观察,生物过程分析表明,BHB治疗对Kbhb水平产生更深远的影响在三羧酸循环中(调整 值= 8.23 - - - - - -04)和细胞程序性细胞死亡(调整 值= 1.18 - - - - - -02),而蛋白质参与糖原代谢过程(调整 值= 4.07 - - - - - -03),核糖核酸生物合成的过程(调整 值= 1.29 - - - - - -06)和凋亡过程(调整 值= 2.76 - - - - - -06)富含增加乙酰化水平。这些模式进一步支持环境BHB可以不同调解Kbhb和卡茨水平在这些过程中,从而导致不同的下游细胞的影响。

3.5。交互的网络BHB-Induced Kbhb和卡茨蛋白质组

蛋白质相互作用网络指的是多个蛋白质分子之间的相互作用参与信号转导、能量代谢、基因调控、和其他生理生化过程33,34]。系统分析生物系统的许多蛋白质之间的相互作用是至关重要的对于理解蛋白质在生物体内的功能角色,信号转导的监管机制和能量代谢在不同生理状态下,和功能蛋白质之间的关系35- - - - - -37]。因此,我们未来的蛋白质相互作用网络分析与BHB-induced Kbhb和卡茨网站检索的搜索工具的基础上相互作用的基因/蛋白质数据库(图(字符串)5)。有趣的是,多个核糖体蛋白家族成员的紧密互动,包括RPL29 RPL18A, RPS25。其中,RPL29包含调节Kac的网站,和其他两个调节Kbhb网站。核糖体蛋白在细胞蛋白质生物合成中扮演着重要的角色。结果表明,尽管调节Kbhb和卡茨网站没有重叠,波动引起的这些Kbhb和卡茨网站BHB协同可能影响蛋白质合成过程。


图5
交互网络Kbhb和卡茨蛋白质组。蓝色和红色圆圈代表了蛋白质与调节Kbhb Kac的水平,分别。
3.6。潜在的Kbhb对蛋白功能的影响

越来越多的证据表明,天车在某些残留物可以调节蛋白功能和参与的一系列重要的生物过程(38- - - - - -40]。为了找出Kbhb的潜在影响蛋白质功能更好,我们绘制了BHB诱导Kbhb网站与UniProt数据库(表1)。有趣的是,一些Kbhb站点位于或接近重要的残留蛋白质功能。例如,脂肪酸合成酶(Fasn)是一个关键酶的过程中脂肪合成。酰基转移酶和malonyltransferase活动,可以在一定条件下促进棕榈酸酯的合成,如NADPH的存在(41,42]。值得注意的是,Lys673 Fasn表现出更高的Kbhb BHB治疗水平。有趣的是,这个位置是位于酰基丙二酰基转移酶。Fasn晶体结构表明,K673是乙酰辅酶A的暴露在绑定的口袋,氮原子的K673远离乙酰辅酶A(图4.2只6)。因此,Kbhb水平升高K673 Fasn转移酶活动的可能影响。

表1
Kbhb网站涉及衬底/代数余子式绑定的关键残基上,蛋白质相互作用和癌症生物标记。

图6
Fasn显示了Kbhb网站的三维结构和衬底绑定的口袋里。

另一个例子是Translin(听)标识的单链DNA分解在染色体易位(43]。这种蛋白质单-和双链内切核糖核酸酶活动,主要是参与免疫相关基因片段。循环heterooctamer由六听——和两个Translin-associated蛋白质X子单元对于DNA / RNA绑定[是必要的44]。我们的数据表明,β-hydroxybutyrylation的残留Lys187听是应对BHB-treatment(表中增加了75%1)。值得注意的是,Lys187是位于亮氨酸拉链地区担任二聚模块。Kbhb在这个位置会影响heterooctamer装配和调节其功能。

除了上述之外,烯醇酶1(三)催化转换2-phosphoglycerate磷酸烯醇丙酮酸(45,46]。除了糖酵解,还参与发展的规定,组织缺氧,过敏(45,47- - - - - -49]。众所周知,糖酵解是所有生物的共同通路葡萄糖分解代谢。通过糖酵解,葡萄糖降解产生ATP,为生命活动提供部分能源和中间产品或碳骨架的其他代谢途径。Kbhb水平在关键残渣Lys256三BHB治疗后增加了100%,这可能会影响其催化功能糖酵解,导致代谢压力(表1)。

4所示。讨论

BHB新陈代谢的一个重要方面来维持身体的生理体内平衡。在哺乳动物中,BHB生产主要由脂肪酸在肝脏和运送到外围组织以应对营养不良。除了作为一个能源燃料肝脏以外的组织,BHB作为蛋白质天车司机有着至关重要的作用。我们最近发现的一个进化保存天车,Kbhb,组蛋白核心。Kbhb非常动态和水平受生理条件影响和营养来源(例如,饥饿和缺少膳食碳水化合物)。这些发现支持一个模型BHB功能链接的外部环境通过Kbhb通路细胞功能。在人类中,血清浓度BHB可以增加20 mM在病理条件下,如饥饿和糖尿病(DM)和酒精肝损伤。尽管进展,细胞来源于肝外组织如何应对环境BHB升高在很大程度上仍是个未知数。

我们的研究发现Kbhb和卡茨MEF细胞基质,以应对高环境BHB通过定量蛋白质组学。我们发现840独特的Kbhb网站429蛋白质,包括42个网站39蛋白质增加了1.5折( )为了应对BHB治疗(表S1、S2、S3)。值得注意的是,结果表明,调节Kbhb和卡茨网站没有重叠BHB治疗后,这表明BHB-induced Kbhb和卡茨调节不同的细胞功能。通路富集分析也证实这些结果。2-oxocarboxylic酸代谢,例如,氨酰生物合成和柠檬酸循环通路调节Kbhb基质明显富集,而氨基酸代谢,ubiquitin-mediated蛋白水解作用,和鞘脂类信号通路在很大程度上是富含卡茨水平增加。这些结果表明,升高BHB可能调节能量代谢和蛋白质降解通过Kbhb和卡茨途径,分别以响应环境缺乏葡萄糖。此外,我们表明,BHB-induced Kbhb可能占领关键残基的蛋白质具有重要的生物功能,这意味着BHB可以通过Kbhb通路调节特定的蛋白质功能。

BHB已经报道的抑制剂组蛋白脱乙酰酶(hdac) [50]。虽然水平Kbhb BHB治疗后显著增加,我们的研究结果表明,没有明显的增加组蛋白MEF卡茨水平细胞治疗5毫米BHB(图3(一个)),这是符合我们之前的研究(19]。这并不奇怪,因为据报道,丁酸盐,但不是β羟基丁酸,促进组蛋白卡茨在多个细胞系(50]。

总之,我们的研究显示的动态蛋白质组Kbhb和卡茨环境BHB,扩大了Kbhb通路的角色和建议BHB生物功能的新理解。

数据可用性

质谱的蛋白质组学数据被存入ProteomeXchange财团通过骄傲PXD029481伙伴库数据集标识符。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

他黄构思项目并负责监督。希望侯、Guobin刘和雪莲任执行所有的实验和bioinformatical分析。鲜明刘Lei,他参与了质谱数据分析。侯他黄,想写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

我们感激地承认中国的国家自然科学基金(81973164)黄(他)和上海市科技重大项目支持(他黄)。

补充材料

辅料表S1 / S2和S3的完整列表确定蛋白质/卡茨网站/ Kbhb网站MEF细胞有或没有BHB治疗。(补充材料)