文摘

有机金属nanoconjugates引起了极大的兴趣,由于他们的双峰特性和高稳定性。在目前的研究中,我们分析了碳量子点的细胞毒性性质(CDs)和一系列有机金属nanoconjugates包括gold@carbon点(Au@CDs)和silver@carbon点(Ag@CDs)通过水合成模式。我们旨在透露细胞增殖的比较分析,吸收,和本地化的粒子在海拉和HEK293细胞线。我们的Au@CDs结果显示细胞毒性存在剂量依赖的相关性,Ag@CDs和cd。然而,Ag@CDs显示最高抑制通过海拉细胞IC₅₀价值约 μ克/毫升。共焦成像所指粒子的吸收由蓝色荧光内陆地区的海拉细胞。此外,TEM显微图描述粒子的裹入通过内吞作用辅助细胞微绒毛。cd和Au@CDs因此观察到浓度100是相对安全的μg / mL,没有引起任何细胞形态学变化。此外,这些nanoconjugates的细胞增殖试验对HEK 293个细胞标志着无毒nanoconjugates的性质。结果从而揭示两个事实:首先,Ag@CDs强有力的治疗潜力,标志着他们的潜能是一种很有前途的抗癌药物,其次,在定义cd和Au@CDs剂量可以作为探针检测也bioimaging代理。

1。介绍

工程纳米材料与多通道属性最近的焦点,特别强调应用程序相关的生物医学领域包括成像、药物输送,若探测器(1- - - - - -4]。纳米粒子的小尺寸(NPs)允许他们容易渗透进入细胞和与蜂窝系统的交互5]。此外,NPs的有趣的物理化学性质,如大小、形状、表面化学、表面电荷在吸收方面发挥关键作用的细胞(6- - - - - -9]。由于这些属性,NPs广泛分析他们的基因传递的潜力,有针对性的药,治疗,肿瘤定位(10- - - - - -12]。

在特定的,金属氧化物NPs报道的重要生物适用性(13]。有大量的报道,显示应用程序的金银NPs在共同参与14- - - - - -17]。Endosome-entrapped黄金NPs大小从4到6 nm已报告的优秀的吸收和bioimaging潜在由海拉和MCF-7细胞系(15]。碳点(CDs)小说零维碳基纳米材料相对强劲的荧光特性。已经有一个巨大的碳点的使用上升(CDs)作为荧光探针bioimaging应用程序(18]。光盘生产的合成方法包括技术,如激光辐照、电化学氧化、强酸氧化、超声波合成(19- - - - - -22]。但是,这些方法受水可分散性的缺点,高价,危险的前兆,而复杂的仪器,从而限制他们在共同使用。因此,研究人员目前正在集中注意力在当下的nanoconjugates合成多功能性的优势,有针对性的功能,和优越的物理化学性质。

无论在纳米技术领域的重大进展,我们不太了解他们的细胞吸收和随后的行动模式。此外,大部分的研究没有表明这些特定粒子的毒性评估。大量的因素如剂量、分布、疗程,与特定的生物分子交互影响NP-based细胞反应(23,24]。一般来说,NPs被内吞作用的通路中内化吸收效率和合成毒性与给药途径。除了粒子的大小和形状、电荷密度、细胞类型、分化阶段,和表面化学的NPs确定吸收路线(10,25- - - - - -27]。

之前和兼容性的行为模式的不确定性决定其bioapplication与引进任何新的复合纳米材料。为了确保纳米材料的有效的和无害的实现,有必要完全阐明纳米材料的细胞反应。消除毒性和不良的风险在体外细胞反应,许多参数(细胞生存能力,剂量的颗粒,细胞类型、内化的粒子,和降解产物)需要调查。我们之前的研究报告cd的合成生物相容性前体中合成粒子提供水溶解度的优势,稳定,高量子产率。此外,我们合成了双模nanoconjugates (Au@CDs和Ag@CDs)定义良好的光和荧光性质,从而呈现bioimaging承诺使用。

因此,在目前的研究中,我们梦寐以求的调查的毒性作用合成nanoconjugates (cd、Ag@CDs和Au@CDs),了解抗细胞吸收和内化途径。Ag@CDs细胞吸收和分布,Au@CDs,分析了CDs在海拉细胞线。总的来说,我们的研究建立了基于cd细胞反应的海拉细胞暴露于nanoconjugates,荧光成像技术的潜力,和细胞内的吸收效率。

2。材料和方法

2.1。合成的碳点(CDs)

cd按我们之前的合成研究(28]。挂钩和柠檬酸作为前体,并通过微波法合成了。

2.2。合成Au@CD / Ag@CD Nanoconjugates

合成cd适当稀释,用于gold@carbon点(Au@CDs)和silver@carbon点(Ag@CDs)合成。在HAuCl Au@CDs合成₄浓度为0.12毫克/毫升按照协议采用(28,29日]。紫外和荧光光谱分析确定合成nanoconjugates执行的。平均粒径和形态是由动态光散射(DLS)和JEOL 2100 f透射电子显微镜(TEM)在200千伏的电压。水动力大小( )粒子的决心使用Stokes-Einstein方程[30.从DLS数据)。

2.3。在体外毒性

2.3.1。细胞培养

人类宫颈癌细胞系(海拉)和人类健康的胚胎肾脏细胞株(HEK293)采购从国立细胞科学中心,生物技术,印度浦那。在rpmi - 1640细胞培养中补充了10% ( )的边后卫和抗生素(链霉素10μg / mL和青霉素100 U /毫升)。

2.3.2。细胞毒性试验

的细胞毒性nanoconjugates MTT比色和cd试验对海拉和HEK293细胞线。简单地说, 细胞/被播种在96孔板在孵化器和孵化24小时保持在37°C和5%的公司₂。传统媒体被替换为新的介质含有不同浓度的nanoconjugates和cd和孵化进一步为另一个24小时。此后,30μL(1毫克/毫升MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑)和70年μL的媒体被添加到每个。4 h孵化后,与100年媒体补充μL DMSO和孵化10分钟。吸光度是记录在ELISA板读者在570 nm,和%可行性计算按下文提及的公式。

。

2.3.3。测定活性氧(ROS)

细胞内ROS生成的孵化nanoconjugates估计2细胞系 ,7dichlorofluorescein-diacetate (DCFHDA)染色。播种密度的细胞系 细胞/好,隔夜的37°C的5%孵化有限公司₂。然后细胞处理不同浓度的nanoconjugates和碳点和留给暴露24 h。细胞与磷酸盐(PBS),之后洗和40μM DCFHDA被添加到每个好,孵化为30分钟37°C。与PBS的细胞被洗两次,荧光强度测量使用485兴奋和520海里排放过滤器使用荧光计(rf - 5301电脑日本岛津公司荧光谱仪Nakagyo-Ku,京都,日本)。

此外,ROS生成的海拉细胞的治疗与nanoconjugates是由使用DCFHDA染料荧光成像技术。在海拉细胞 细胞/好被播种在盖玻片six-well盘子。板是孵化一夜之间,允许细胞的增长和附件。nanoconjugates在不同浓度添加到井和隔夜37°C和5%孵化有限公司₂。这些细胞被洗PBS和40μM DCFHDA孵化了30分钟。孵化后,DCFHDA被,盖玻片是悬浮在PBS。盖玻片被移除和可视化尼康的Eclipse Ti-E(日本东京)荧光显微镜在20 x放大。

2.3.4。细胞形态学分析

海拉细胞的细胞形态变化与nanoconjugates治疗后使用相差显微镜进行了分析。细胞治疗18 h,任何使用显微镜观察形态变化(Eclipse Ti-S尼康,日本东京)。

2.3.5。细胞吸收和Bioimaging

分析吸收nanoconjugates的海拉细胞,这些细胞被处理50μg / mL nanoconjugates和孵化6 h。完成后的潜伏期,细胞使胰蛋白酶化,在5000转离心5分钟。获得的颗粒被溶解在1毫升0.1 PBS。成像进行了使用一个奥林巴斯FluoView TM FV1000激光共焦显微镜。

2.3.6。TEM分析

nanoconjugates的亚细胞定位分析了海拉细胞治疗细胞nanoconjugates和随后的孵化24小时。细胞治疗是使胰蛋白酶化和2.5%戊二醛固定45分钟,使用1%锇酸后缀,0.1 PBS是添加到它。细胞被乙醇脱水,嵌入在环氧树脂812,切片做了使用一个超微切片机(徕卡Ultracut-UCT)。下的部分观察jeol jem - 2100 - f透射电子显微镜与醋酸双氧铀染色后200千伏。

3所示。结果

3.1。表征Nanoconjugates

CDs合成使用挂钩和柠檬酸作为后续的还原剂合成非盟和Ag-based nanoconjugates。改变颜色从最初的黄色到紫色,红棕色提供初始Au@CD和Ag@CD形成的证据,分别。一个明显的表面等离子体共振(SPR)观察峰在530和420海里Au@CDs和Ag@CDs分别在紫外可见吸收光谱。此外,荧光强度的淬火证实nanoconjugates(数据的形成1(一)和1 (b))。

详细的物理特征(TEM、HRTEM、EDX光谱)和cd和Au@CD和Ag@CD合成机制已经出版,在我们之前的研究和数据可用与多模传感应用程序(28,29日),因此,在这项研究中,我们探讨了细胞增殖,吸收,定位在癌细胞和正常细胞。水晶颗粒的性质从XRD分析确认。表1总结了合成nanoconjugates和cd的物理参数。

3.2。的评估在体外合成Nanoconjugates毒性

的抗增殖效果合成nanoconjugates和cd了对海拉细胞通过MTT试验。细胞治疗与nanoconjugates 25 - 200的浓度范围μ克/毫升(图24小时2)。在粒子,Ag@CDs显示最高的海拉细胞抑制IC₅₀价值(浓度50%的细胞死亡在哪里观察) μg / mL, cd显示毒性最小的IC₅₀价值约 μ克/毫升。Au@CDs显示集成电路₅₀的价值 μg / mL,从而标志着Au@CDs毒性很小。的细胞毒性研究表明抗增殖效果Ag@CDs剂量依赖性的方式。文献表明,银NPs的优越的毒性,细胞生存能力下降了近60%浓度仅为65μg / mL L929细胞(31日]。在目前的情况下,最高的失活Ag@CDs观察细胞增殖,这可以归因于Ag)⁺离子形式的整体核心粒子。在类似的情况下,黄金已报告NPs抑制道尔顿淋巴瘤细胞的增殖,约有40 - 50%浓度范围的可行性80 - 100μg (32]。在这项研究中,最小的毒性观察Au@CDs这可能是由于CD壳无毒的金颗粒呈现它们。相对略高,毒性Au@CDs cd相比可以假定非盟之间形成有效的结合离子和细胞表面,允许优越的互动与渗透进入细胞。

nanoconjugates观察形态学变化引起,治疗细胞在显微镜下拍摄的图像。海拉细胞被对待nanoconjugates享年100岁μ克/毫升浓度。不同形态的变化以及在细胞密度相比,控制细胞(图中被发现3)。而控制集(未经处理的海拉细胞)显示完整的形态学特征,细胞治疗Ag@CDs显示破坏细胞组织,细胞收缩,细胞。细胞出现萎缩,不规则的形状,变成了圆形。死细胞或细胞压力下显示一个圆形形态和表面脱离。此外,存活细胞的数量明显减少建议的高毒性和诱导细胞凋亡和坏死,享年100岁μg / mL Ag@CD浓度。此外,细胞治疗cd出现类似形态的控制细胞表明对海拉细胞无毒性的cd。同样,细胞治疗Au@CDs显示一些完整的形态标志着他们的小圆细胞毒性Ag@CDs相比。

毒性的文献表明,感应NPs通常由细胞凋亡,线粒体损伤、代谢活动,和氧化应激(33- - - - - -36]。这些过程是借助于ROS的产生。在这项研究中,我们研究了海拉细胞ROS生产与nanoconjugates治疗后。我们使用了荧光染料DCFHDA ROS生成的分析,其中直接ROS数量和绿色荧光强度之间的相关性。我们没有观察到任何控制细胞的荧光,而海拉细胞治疗cd显示弱和扩散绿色荧光。然而,海拉细胞治疗Ag@CDs显示绿色荧光的强度高。同时,细胞的数量减少被发现的由于高毒性细胞死亡。ROS分析因此说Au@CDs更少有毒Ag@CDs相比,所指的相对荧光强度降低(图4(一))。同样,ROS评估的定量分析显示一个相对高强度的DCF Ag@CD-treated细胞cd和Au@CDs相比(图4 (b))。

3.3。Nanoconjugates细胞吸收和内化

nanoconjugates的吸收是重要的细胞分析粒子的内化。分析合成的潜力nanoconjugates在活细胞成像研究和其他生物医学应用,CDs的吸收,Ag@CDs, Au@CDs评估治疗的细胞与50μg / mL nanoconjugate浓度,几乎一半的浓度,观察对细胞具有毒性。图5显示了共焦成像数据标志着nanoconjugates的细胞吸收。蓝色的花期所指nanoconjugates海拉细胞内部的内化。细胞没有任何nanoconjugates治疗作为控制调整探测器增益和基线校正。图像(图5)表明,Au@CD-treated粒子的散射强度最高。所有这三个粒子在细胞内化,标志着粒子附着能力和由细胞。的荧光强度是最大Au@CDs其次是Ag@CDs和cd,分别。

粒子的透射电镜进一步证实细胞内化。的吸收cd和Au@CDs被TEM研究了。由于Ag@CDs毒性高,是不可能执行TEM研究。由于快速的细胞死亡和随后的超然粘表面,细胞颗粒不能获得。图6(一)展示了代表TEM图像控制,CD-treated, Au@CD-treated海拉细胞。在未经处理的海拉细胞,没有生动的形态变化被发现,细胞膜完整几乎均匀细胞质和统一的囊泡。然而,在治疗组细胞,密集的聚集中观察到的囊泡与内化粒子(数据相对应6 (b)和6 (c))。

在特定的,粒子是由海拉细胞内化的,电子致密骨料所指的红色箭头显示的数字7和8。在海拉细胞治疗CD、囊泡很大,充满了充足的CD总量。同时,内部囊泡小,局限于细胞质中,红色箭头表示的数据7(一)和7 (c)。

此外,包围,如图8(一个),我们观察到附件的cd细胞微绒毛。微绒毛的CD附件已经变大的图像,如图所示7 (b)。大量的聚合粒子附着在外部观察细胞表面或等离子体膜。另一方面,red-encircled站点在图8(一个)在海拉细胞代表Au@CDs的本地化。放大的图像被显示在图8 (b)。值得注意的是,图8 (c)显示了粒子之间的相互作用在细胞表面微绒毛和细胞质之间的交错。图像从而表明粒子通过内吞作用进入细胞的辅助细胞微绒毛。比较分析表明更内化的cd细胞囊泡与Au@CDs相比,这是因为分钟cd支持其吸收的大小通过内吞作用,通过细胞表面扩散。然而,粒子类型(cd和Au@CDs)没有产生任何变化在细胞形态与细胞生存能力的数据一致。

4所示。讨论

在这项研究中,一个新系列的有机金属nanoconjugates包括Au@CDs Ag@CDs,和cd通过紫外可见光谱,荧光光谱,TEM, SEM和DLS和评估对海拉细胞的抗增殖作用。荧光分析表明高量子产率的cd。此外,合成Ag@CDs和Au@CDs表现出光的双重属性以及荧光检测(28]。最近,量子点量子点(量子点)专门制作基于报告的使用在活的有机体内造影剂;然而,所提供的高毒性浸出的Cd^{2 +}离子进入溶液限制了他们的应用程序。关于这一点,内部合成nanoconjugates优越特性(表面溶解性、稳定性和可访问性),让他们有希望的候选人在活的有机体内应用程序。细胞毒性,特别是Ag)、非盟和CD已经描述在不同的细胞类型(37,38]。相比之下,我们分析了小说双重属性的纳米材料的毒性(光和荧光)。水溶解度,简单的可访问性,稳定性高,量子产率效率做出这样的双模nanoconjugates优越的生物医学应用程序的兴趣。因此,评估这些nanoconjugates的生物相容性判定后续应用程序所必需的。纳米材料的毒性取决于许多因素,如细胞吸收,粒子大小和细胞类型(39,40]。细胞生存能力分析表明,三个粒子,Ag@CDs显著抑制海拉细胞的生长通过剂量依赖性的方式。大多数的机制假设ROS的产生是对nanomaterial-induced细胞毒性的主要因素。用于合成的底物的性质以及表面改性过程中发挥着不可或缺的作用在粒子的吸收和相应的毒性。因此,我们研究了细胞内ROS的生成在海拉细胞反应内化粒子,利用荧光探针DCFDA。事实上,DCFDA一般措施羟基,过氧化氢和其他细胞内的活性氧。Ag@CD-treated海拉细胞表现出相对较高的活性氧强度和生动的细胞形态的变化;凋亡和坏死细胞观察。Ag)的可能的浸出⁺离子进入溶液和随后的绑定的硫醇组内线粒体膜导致的弱化导致活性氧的抗氧化防御机制的形成。在线粒体活性氧的积累结果破坏和释放Cyt C这反过来激活还存在最终导致细胞死亡或DNA碎片(37,38,41]。另一方面,cd和Au@CDs被发现是相对无毒的高浓度的100μg / mL,没有引起任何形态的改变。细胞吸收和内化的CD和Au@CDs共焦成像和TEM研究了。分析表明,粒子都有类似的内化过程借助于细胞微绒毛;然而,细胞内的分布是不同的。由于体积小的cd,他们容易被扩散渗透细胞,胞质囊泡中广泛积累,而Au@CDs大多是本地化的胞质空间。因此意味着NPs的细胞吸收取决于材料的性质、大小、形状和表面电荷(42]。Bioimaging研究需求的合成纳米材料,可以很容易地进入细胞,而不影响其形态和诱导细胞死亡。很容易内化的粒子,均匀分布在细胞内作为合适的药物输送和荧光标记。结果表明CDs和Au@CDs当前协议可以作为优越的探针合成的生物医学和theranostic应用程序。

5。结论

Ag@CDs (50μg / mL)被发现有毒的海拉细胞cd和Au@CDs相比,从而标志着particle-type-specific毒性。虽然CD和Au@CD粒子没有表现出急性毒性甚至在高剂量(100μg / mL),不同的交互与海拉细胞被观察到。共焦和TEM分析表明这些粒子的吸收和随后的内化在细胞质内空间和囊泡。这因此建议cd和Au@CDs可以被细胞没有毒性作用或感应形态变化的结果。此外,Ag@CDs诱导细胞凋亡在海拉细胞可能通过ROS-mediated凋亡途径。总之,研究泄露,细胞毒性取决于粒子组成以及表面改性。同时,cd和Au@CDs由于其水溶解度,无毒性,和荧光效率建议用于bioapplications,然而与细胞毒性控制浓度随粒子剂量。

数据可用性

与手稿相关的数据可从第一和相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

EP是感谢DST-SERB,印度政府的奖学金在国家博士后奖学金计划(批准号PDF / 2017/000024),和工作是由UPE-II(项目ID 357)。作者感谢贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学的先进的仪器研究设施仪器分析。M.H.由于塔伊夫大学研究、沙特阿拉伯、TURSP2020/91支持项目。