文摘

背景。肿瘤免疫微环境(时间)与癌症发展和免疫逃逸。虽然KLHDC8A已经发表在神经胶质瘤在体外,这种基因的表达和临床意义在临床样本是未知的。方法。癌症基因组图谱和中国神经胶质瘤基因组图谱数据库被用来评估mRNA的表达水平KLHDC8A在神经胶质瘤时间及其意义。组织芯片多个进行免疫组织化学染色法来确定KLHDC8A蛋白质水平和描述肿瘤浸润免疫细胞在神经胶质瘤的免疫签名。结果。肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达KLHDC8A。KLHDC8A的表达在神经胶质瘤组织中高于正常脑组织,并与病人的临床特点。神经胶质瘤表现出较高的大量的巨噬细胞,中性粒细胞,调节性T细胞,免疫PD-L1检查站,以及高KLHDC8A表达式。Cox回归分析表明,KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞和KLHDC8A预测不利的神经胶质瘤患者的生存期。最后,蛋白质相互作用网络分析表明,KLHDC8A表达式与缺氧和氧化应激有关。结论。KLHDC8A是一个潜在的标记神经胶质瘤的临床诊断。巨噬细胞的免疫特点发挥着至关重要的作用在预测神经胶质瘤患者,神经胶质瘤靶向治疗提供了一条新途径。

1。介绍

神经胶质瘤是中枢神经系统的肿瘤,影响大脑和脊髓1]。它包括颅脑恶性肿瘤的81%,是最典型的常见的原发性肿瘤的中枢神经系统2]。据世界卫生组织(世卫组织)、神经胶质瘤分为四个年级根据预测的临床特点(3,4]。最贫穷的五年生存率为胶质母细胞瘤,而相对存活率最高pilocytic星形细胞瘤(5]。此外,神经胶质瘤患者IDH突变有更好的生存6,7]。大多数神经胶质瘤患者的预后仍然贫穷,尽管存活率为那些经历伴随化疗和术后放射治疗改善。免疫治疗一直被认为是一种很有潜力的治疗策略对抗癌症,等新的机制可能显著改善神经胶质瘤免疫治疗的疗效。

大脑肿瘤微环境(时间)是至关重要的在大脑初级和转移性恶性肿瘤(8]。肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)时间可以加速肿瘤进展(9,10]。越来越多的证据表明,肿瘤相关巨噬细胞(tam)促进细胞增殖和入侵神经胶质瘤(11]。重要的是,TAM抑制强烈块形成神经胶质瘤(12]。tam,特点是CD163的表达,CD204,或CD206,支持肿瘤的生长13]。因此,当务之急是确定发展目标免疫疗法macrophage-related标记时间和确定新的治疗靶点14]。同时,缺氧和抗辐射性与神经胶质瘤密切相关。此外,氧化应激,参与中枢神经系统疾病,可能导致结构和功能障碍(15]。在氧化应激、过度生产活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)可以导致神经功能障碍和死亡(16]。

基于生物信息学方法,KLHDC8A作为中心筛选基因差异表达分析。KLHDC8A编码为Kelch domain-containing蛋白质属于Kelch总科(17]。几个Kelch蛋白质发挥重要作用在许多人类疾病,包括肿瘤和神经系统疾病。Kelch蛋白质的表达是调节在癌症18- - - - - -20.]。蛋白质属于Kelch总科参与细胞外互动、细胞迁移、细胞形态、基因表达、蛋白质降解[21,22]。超表达KLHDC8A驱动生成和发展的神经胶质瘤和增殖,迁移和入侵神经胶质瘤细胞(23]。此外,神经胶质瘤的发病机制是相当丰富的免疫相关组件(24]。免疫系统的人更容易患脑部肿瘤(25- - - - - -27]。然而,KLHDC8A表达和神经胶质瘤的免疫微环境之间的关系还没有被报道。因此,在神经胶质瘤KLHDC8A时间的作用值得进一步调查。

使用多路复用免疫组织化学(mIHC)和建设性的组织微阵列分析(tma),当前的研究评估KLHDC8A蛋白的表达。KLHDC8A的调查结果显示,作用在神经胶质瘤的免疫环境截然不同的表达KLHDC8A TIICs的丰度和氧化应激。

2。方法

2.1。病人和组织样本

转录组概要文件和临床信息689神经胶质瘤患者和1152名健康的人下载的癌症基因组图谱(TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov/)和GETx数据库,分别。中国神经胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库(http://www.cgga.org.cn/index.jsp)是用来下载微阵列数据301神经胶质瘤患者,除缺失的信息,如肿瘤年级(3例)、总生存期(16例)和年龄(2例)。组织样本回顾性收集的231例患者(203神经胶质瘤组织和正常的大脑组织28日)在2012年和2017年之间从南通大学附属医院的临床生物。在手术之前,没有放疗、化疗、免疫治疗或其他治疗。伦理批准是来自南通大学附属医院。

2.2。免疫细胞渗透分析

CIBERSORT是量化细胞成分的计算算法基于组织基因的表达谱(28]。CIBERSORT算法应用于估计22个不同的免疫细胞类型(29日]。基于mRNA的表达KLHDC8A,成立一个高表达组和低表达组。评价之间的关系KLHDC8A TIICs,基因表达的中值设置为11.6。

2.3。组织微阵列和免疫组织化学染色

组织微阵列(TMA)是由手动组织微阵列系统构造快速射线(UNITMA,首尔,韩国)。TMA幻灯片准备从连续手术切除标本,用福尔马林固定,嵌在石蜡中。样本被表示为一个核心TMA直径2毫米。样本使用二甲苯脱蜡、水化(出版,中国)和酒精(ANNJET,中国),分别。然后,TMA片被安置在柠檬酸钠缓冲(Biosharp,中国)(0.5米, )抗原检索的微波辐射。TMA幻灯片被孵化与内源性过氧化物酶(箴言生物技术,中国)阻断剂20分钟,其次是5%牛血清白蛋白(BSA、biofroxx、中国)封锁了20分钟去除背景噪声。幻灯片与兔子anti-PD-L1孵化主要抗体在一夜之间在4°C。然后,部分是孵化反应增强器解决方案(箴言生物技术,中国)30分钟,其次是孵化与二次抗体(箴言生物技术,中国)。然后,TMA幻灯片使用一个EliVision +彩色涂工具包(Kit - 0015;马克西姆生物技术、福州、中国)制造商的指示后,核与苏木精染色(Yizhiyuan,中国)。幻灯片是成像使用Vectra3-automated成像软件,和图像进行了分析,并使用inForm4.1.0得分(珀金埃尔默)。染色强度得分如下:0(无染色);1 +(弱染色);2 +(温和的染色); or 3+ (intense staining). The final staining score was calculated by summing the proportion of cells stained at each intensity and the intensity score (0-300).

2.4。多种免疫组织化学染色

一个蛋白石七色手册包含IHC工具包(PerkinElmer NEL811001KT)被用来执行多个免疫组织化学染色(mIHC)分析。Formalin-fixed石蜡包埋组织部分由微波加热在AR6缓冲区(AR600,海水养)。幻灯片被封锁阻止缓冲区(ARD1001EA颗AKOYA) 10分钟。第二天,幻灯片为30分钟,再与第二抗体孵化蛋白石™聚合物合+ Rb女士(ARH1001EA,珀金埃尔默)在室温下10分钟。然后,细胞核与DAPI复染色蓝(F6057σ)。在我们的研究中使用的主要抗体(补充表中列出的补充材料S1)。

每个样本都被捕获在一个20 x放大使用Vectra3-automated成像软件。图像进行了分析,并使用inForm4.1.0得分(珀金埃尔默),积极或消极的细胞和一个阈值定在每一个细胞。细胞在每个区域的百分比计算,取得了(0 - 100)。

2.5。蛋白质相互作用分析

直接相互作用的蛋白质网络中可以识别(PPI)蛋白质间交互作用分析。字符串是一个搜索工具识别基因相互作用[30.]。使用字符串工具,显示基因相互作用的蛋白质网络KLHDC8A和相关免疫标记了。

2.6。统计分析

使用学生的两组之间的差异进行了分析 - - - - - -测试。基于KLHDC8A表达和丰富的CD68 +巨噬细胞,患者分为高、低组使用52和10.14截止点,来自X-tile软件。此外,TIIC丰度和KLHDC8A表达式使用斯皮尔曼相关系数相关。诺模图施工进行了使用“rms”和“生存”包r .描述性统计的军团测定使用SPSS 23.0版。数据也使用R处理软件(v.4.1.1)。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。之间的相关性KLHDC8A在神经胶质瘤mRNA表达和TIIC丰富

在这项研究中,我们分析了一群689神经胶质瘤组织和邻近组织与可用TCGA mRNA表达和临床信息数据库。1152从GTEx数据库正常组织也包括在内。与在正常组织相比,KLHDC8A神经胶质瘤组织中的表达升高(图1(一))。基于KLHDC8A表达式,患者分为高和低表达组根据截止值为11.6。较短的生存是独立相关KLHDC8A表达式(图1 (b))。此外,CIBERSORT算法被用来评估的相对丰度22种TIICs TCGA在每个样本。神经胶质瘤的热图景观提出了一个集成的免疫细胞(图1 (c))。此外,KLHDC8A表达式与丰富的M2巨噬细胞显著相关(枪兵, , ),中性粒细胞(枪兵, , ),和调节性T细胞亚群(枪兵, , )(图1 (d))。这些数据表明一个KLHDC8A表达和神经胶质瘤的免疫微环境之间的联系。

(一)
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图1
KLHDC8A在神经胶质瘤mRNA的表达。(一)KLHDC8A信使rna表达在正常和肿瘤组织。(b)患者高KLHDC8A表达了一个贫穷的预后。(c)的热图代表比例的22个不同的免疫细胞类型。(d) KLHDC8A表达与肿瘤浸润免疫细胞(TIIC)丰度在癌症基因组图谱(TCGA)数据库。
3.2。多路复用免疫组织化学显示KLHDC8A的蛋白质表达水平和本地化

自mRNA表达水平并不总是说明蛋白质含量(31日,32),我们执行mIHC检测KLHDC8A的表达。在协议TCGA的结果,KLHDC8A蛋白高表达在神经胶质瘤组织(图2(a))。免疫荧光染色显示KLHDC8A也表示CD68 +巨噬细胞(图2(b))。此外,神经胶质瘤组织被浓缩在KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞与正常脑组织相比(图2(c))。


图2
KLHDC8A的蛋白质表达水平和本地化。(一)KLHDC8A蛋白表达在神经胶质瘤组织。(b)荧光技术多路复用KLHDC8A的免疫组织化学显示差异表达蛋白在正常和肿瘤组织之间。(c)的渗透KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞在肿瘤微环境。
3.3。KLHDC8A TIICs癌症和巨噬细胞的关系

进一步验证KLHDC8A表达之间的相关性和TIIC丰富在神经胶质瘤的免疫微环境,我们进行了mIHC(图3(一个))。有一个广泛的渗透CD25 + treg CD66b +中性粒细胞,CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,神经胶质瘤和S100A4 +战乱国家的微环境。然而,CD3 + CD4 + T细胞的渗透和CD3 + CD8 + T细胞很低(图3 (b))。的表达KLHDC8A KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞的浸润呈正相关丰富的亚群,中性粒细胞,M2巨噬细胞(图3 (c)补充表S2)。然而,没有观察到显著相关KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞之间的渗透和战乱国家。

(一)
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(b)
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(c)
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图3
KLHDC8A表达之间的相关性在癌症和巨噬细胞和丰富的肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)。(一)代表多重免疫荧光染色图像。(b)的渗透水平TIICs神经胶质瘤。(c) KlHDC8A表达式TIIC丰富有关。
3.4。神经胶质瘤的KLHDC8A表达之间的相关性及临床特征

与神经胶质瘤203例患者的临床资料,包括年龄、性别、肿瘤分级,IDH1突变,和组织学分类,收集来自南通大学附属医院。KLHDC8A表达式在癌症和大量的CD68 +巨噬细胞被分为高和低表达组。接下来,我们分析了KLHDC8A表达和临床病理特征之间的关系。结果显示,KLHDC8A表达式在巨噬细胞和肿瘤细胞与肿瘤相关的成绩(表1)。此外,S100A4 +战乱国家的渗透,CD25 + treg CD66b +中性粒细胞,CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,和S100A4 + CD163 +细胞与神经胶质瘤患者的临床特点(相关数据4(一)和4 (b))。CD25 + treg的渗透,CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,和S100A4 + CD163 + KLHDC8A高表达的增加和高渗透KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞。高KLHDC8A表达式与增强渗透S100A4 +战乱国家,但是KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞浸润并没有显著不同。CD66b +中性粒细胞增加的渗透KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞增加;然而,没有明显的协会之间的观察KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞浸润和KLHDC8A表达式(数字4 (c)和4 (d))。谁的成绩I和II相比,S100A4 +战乱国家,CD25 + treg CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,和S100A4 + CD163 +细胞浸润升高年级III和IV肿瘤(图4 (e))。同时,CD66b +中性粒细胞的浸润在肿瘤的成绩没有显著差异。

表1
KLHDC8A表达和临床病理特征之间的关系。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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图4
之间的关系KLHDC8A表达和神经胶质瘤的临床特征。(a, b)的热图显示巨噬细胞浸润的关系和神经胶质瘤患者的临床特征。(c, d) KLHDC8A的表达与肿瘤浸润免疫细胞(TIICs)的丰度。(e)肿瘤的成绩与TIICs的丰度。
3.5。高KLHDC8A KLHDC8A + CD68 +表达预测不利的神经胶质瘤的预后

一群280神经胶质瘤患者CGGA数据库包括进一步调查KLHDC8A表达的临床结果和TIIC丰富神经胶质瘤患者使用Cox回归分析。与神经胶质瘤预后相关的因素是KLHDC8A、年龄、IDH1, CD163, S100A4和肿瘤分级(图5(一个))。我们的研究结果表明,KLHDC8A KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞,年龄、性别、IDH1突变,和肿瘤年级神经胶质瘤(图是独立的预后指标5 (b)、表2)。相比之下,CD25 + treg CD66b +中性粒细胞,CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,和S100A4 + CD163 +细胞与神经胶质瘤患者的临床结果。此外,患者高KLHDC8A表达式KLHDC8A贫穷的生存结果比低表达(图5 (c))。巨噬细胞高表达KLHDC8A也导致了短的神经胶质瘤患者总生存期(OS)(图5 (d))。同时,肿瘤患者高成绩有不利预后(图5 (e))。Cox回归分析进行调查的预测影响KLHDC8A, KLHDC8A / CD68 +巨噬细胞,性别、年龄、肿瘤分级胶质瘤患者的生存时间。构建计算图表,显示1 -,3 -,神经胶质瘤患者的5年生存率,TCGA数据库队列(数字和我们的审判5 (f)和5 (g))。

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图5
高KLHDC8A KLHDC8A + CD68 +表达式是独立的神经胶质瘤的预后因素。(a)森林图显示肿瘤微环境的影响,(时间)相关特性和KLHDC8A表情总生存期(OS)在癌症基因组图谱(TCGA)数据库。(b)森林图揭示了TME-related特性和KLHDC8A对操作系统的影响在我们的队列。(c) kaplan meier KLHDC8A曲线高和低表达组群。(d) kaplan meier情节表明协会的丰富KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞和操作系统。肿瘤(e)的成绩与患者生存有关。(f, g)诺模图建立了评价免疫功能的预后意义,TCGA数据库和我们的研究群体。
表2
单变量和多变量分析神经胶质瘤患者的5年生存的预后因素。
3.6。生物过程在KLHDC8A丰富

自PD-L1神经胶质瘤的免疫抑制中起着重要的作用,我们进一步探讨之间的关系和PD-L1 KLHDC8A的表达。我们评估KLHDC8A之间的关系表达式和多种免疫分子和检查站发现之间的显著差异的表达KLHDC8A和PD-L1(图6(一))。

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图6
探索与KLHDC8A相关的生物过程。(a)表达不同的免疫分子检查站高低KLHDC8A表达式组。(b)代表免疫组织化学(包含IHC)的图像PD-L1表达式。(c, d) PD-L1表达呈正相关,KLHDC8A表达式。(e)蛋白质相互作用网络的建设。(f-h) KLHDC8A表达与DEAF1 HIF1A, MCTS1 (MCT1)。(i, j) KLHDC8A表达式与生产活性氧(ROS) (ROS1)和活性氮物种(RNS) (FAM20C)。

此外,我们执行包含IHC评估神经胶质瘤患者PD-L1(图的表达6 (b)),发现KLHDC8A明显的表达与PD-L1(数据呈正相关6 (c)和6 (d))。

字符串工具是用于开发KLHDC8A PPI网络组成,DEAF1, SOX2, S100A4, SLC16A4, MCTS1、CD68、HIF1A, ZEB1, SNAI1 CD163, CD274。DEAF1,先天免疫反应的一个重要机构33),维持免疫细胞功能通过调节antigen-encoding基因的转录在淋巴结基质细胞(34]。然而,它仍然是值得探索KLHDC8A和DEAF1蛋白质之间的相互作用是否能让免疫细胞影响神经胶质瘤进展。MCT1,乳酸出口蛋白质,主要是调节神经胶质瘤细胞在缺氧(35]。同时,缺氧可以诱导epithelial-mesenchymal转换(EMT)在胶质瘤进展(36]。低氧诱导EMT通常EMT转录监管机构的监管,包括蜗牛、Twist1, ZEB1 [37]。EMT过程中,肿瘤细胞诱导巨噬细胞的趋化因子的释放,促进TAM和肿瘤细胞之间的相互作用改变TAM表型。结果表明,KLHDC8A表达式DEAF1的表达有关,HIF1A, MCTS1 (MCT1)(数据6 (f)- - - - - -6 (h))。此外,我们探讨了协会KLHDC8A表达式与ROS和RNS生产。结果显示,KLHDC8A与ROS (ROS1)生产负相关,但它明显和RNS呈正相关(FAM20C)生产(数字6(我)和6 (j))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们进行了生物信息学分析和mIHC染色探索KLHDC8A表达在神经胶质瘤的免疫微环境的相关性及其与氧化应激有关。免疫微环境对神经胶质瘤的发展,很重要的一个最免疫抑制实体瘤。

巨噬细胞被认为有助于肿瘤的生长和发展,促进肿瘤细胞生存、增殖,和传播(11,38]。巨噬细胞是一种免疫入侵神经胶质瘤肿瘤微环境的重要组成部分[39]。M2巨噬细胞可以促进神经胶质瘤的发展和增长40]。Upregulation KLHDC8A有助于扩散、迁移和侵袭性神经胶质瘤细胞(23]。在这项研究中,重要KLHDC8A和时间之间的联系是值得进一步探索。在这项研究中,我们使用生物信息学分析和证实KLHDC8A表达神经胶质瘤免疫特性和氧化应激密切相关。

我们的研究表明,KLHDC8A表达与CD68 +, S100A4 + CD68 + CD163 +,和S100A4 + CD163 +巨噬细胞不同程度的渗透,和KLHDC8A CD68 +巨噬细胞表达。此外,高水平的患者巨噬细胞浸润CD68 + CD163 + CD68 + CD163 +,和S100A4 + CD163 +短生存比低水平的巨噬细胞浸润。CD163 + tam促进肿瘤进展和预后影响41]。我们的研究结果支持这个问题,促使KLHDC8A的肿瘤促进活动是否会影响巨噬细胞浸润。我们的研究结果支持这一结论,我们提出的问题是否KLHDC8A的肿瘤促进活动影响巨噬细胞浸润。

除了CD68 + CD163 + M2巨噬细胞,我们确定了S100A4 + CD163 +和KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞子集。S100A4的M2-like极化增强巨噬细胞肿瘤(42]。同时,患者高KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞浸润较短生存比低KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞浸润。因此,我们发现两个特定巨噬细胞亚群与KLHDC8A呈正相关的表达和神经胶质瘤的预后影响。尽管这些结果,还需要更多的研究来确定KLHDC8A通过信号可能会影响神经胶质瘤的发展路线,影响巨噬细胞浸润。

使用字符串数据库,我们发现KLHDC8A与MCTS1和DEAF1蛋白质相互作用。MCT1和MCT4显示缺氧诱导和促进神经胶质瘤细胞增殖和入侵在活的有机体内和在体外神经胶质瘤模型(35]。此外,激活巨噬细胞的数量和糖酵解速率减少MCT4击倒后(43]。这些结果表明,KLHDC8A可能影响神经胶质瘤进展通过瞄准MCT1调节巨噬细胞表型。DEAF1参与先天免疫反应在活的有机体内(44]。EMT的关键诱导癌细胞,ZEB1可以推动EMT在癌症细胞促进肿瘤进展(45]。此外,ZEB1是调节神经胶质瘤,其肿瘤促进功能保持在肿瘤相关巨噬细胞(46]。然而,KLHDC8A能否驱动神经胶质瘤进展通过ZEB1和巨噬细胞的交互需要作进一步的探讨。阻塞PD1和PD-L1交互在活的有机体内增加TAM吞噬作用和减少肿瘤的生长(47]。这个结果表明PD-1-PD-L1疗法通过巨噬细胞发挥其效果,从而使其适用于临床治疗。氧化应激增强巨噬细胞浸润在神经胶质瘤细胞48]。增加了活性氧和RNS可以诱导氧化应激(49]。我们的分析结果表明,KLHDC8A和RNS显著正相关。我们推测,RNS水平升高引起KLHDC8A表达,加速神经胶质瘤的进展。

这项研究有一些局限性。首先,样本容量小;因此,对现有研究结论必须警告。这是一个回顾性研究。我们利用TMA允许我们同时研究大量的样本,但由于小核心大小、样本偏差(包括肿瘤异质性)可能高于整个部分的研究。我们的研究结果并不一定意味着KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞的浸润神经胶质瘤不利地影响患者的预后。我们没有探索KLHDC8A之间的相互作用机理和免疫细胞的免疫微环境。进一步在体外和在活的有机体内需要实验证据来验证本研究的发现。最近,免疫治疗已成为一个新颖和有吸引力的对神经胶质瘤的治疗策略。然而,由glioma-induced免疫抑制免疫疗法的疗效是有限的。因此,神经胶质瘤细胞免疫抑制微环境的战略目标是一个有吸引力的替代治疗方法。

在我们的研究中,全球表达分析显示KLHDC8A调节神经胶质瘤和与不良预后相关。我们强调肿瘤相关巨噬细胞和KLHDC8A表达之间的联系。我们假设KLHDC8A可能是一个有前途的神经胶质瘤的治疗目标。

5。结论

KLHDC8A是一种很有前途的神经胶质瘤的临床诊断指标。巨噬细胞的免疫特点发挥着至关重要的作用在预测神经胶质瘤患者的预后,为神经胶质瘤的靶向治疗提供新策略。

数据可用性

支持这项研究的数据可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

人类研究南通大学附属医院伦理委员会的批准(2018 - k020)的研究方法。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

曾氏和徐Manyu同样这项工作。

确认

这项工作得到了江苏省的科学基金会(BE2018673)和社会事业项目的技术创新和示范南通基金(2022),江苏,中国。我们衷心感谢所有实验室成员。

补充材料

补充1。在我们的研究中使用的主要抗体中列出的补充材料(补充表S1)。

补充2。的表达KLHDC8A KLHDC8A + CD68 +巨噬细胞的浸润与丰富的亚群呈正相关,中性粒细胞,M2巨噬细胞。