文摘
伤口感染是最常见的一种,严重的问题在伤口管理。寒冷的大气等离子体(CAP)被认为有一个好的影响伤口愈合的新型药物。然而,有一个关键问题尚未解决的由等离子治疗感染伤口。细菌被发现时都深地区的伤口。当等离子体是用来治疗伤口,消毒时它也作用于正常组织细胞。有什么区别相同剂量的等离子体作用于细菌和正常细胞?在这项研究中,最常见的细菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌)感染伤口和两种正常皮肤细胞(人类的角化细胞和人类皮肤成纤维细胞(HSF))选择研究的差异的影响相同剂量的等离子体对细菌和细胞。研究结果表明,三种106CFU毫升细菌能有效灭活5订单等离子治疗后3分钟,而铜绿假单胞菌对等离子体更敏感(可以灭活5订单2分钟治疗后)。104毫升角化细胞和HSF服用相同剂量的等离子体;角化细胞可以保持超过90%的活动和HSF细胞可以保持超过70%的活动。此外,胶原蛋白的水平我由HSF分泌增加。因此,细胞可以保持较高的活动当一个等离子体应用剂量灭活细菌的能力。
1。介绍
在一些发达国家,感染伤口是重要的健康问题。1%的人口不断遭受创伤。和这些伤口的治疗费用约占总预算的2%到3%的卫生保健系统1,2]。受伤后,细菌总是发现伤口深地区的床上(3- - - - - -5]。附件伤口的细菌可以在几分钟内完成(6]。细菌将损害所有伤口愈合的过程包括凝血、炎症、增生,上皮形成和重塑。更高的细菌水平增加炎症和延迟愈合过程(3,7,8]。的照片感染伤口和皮肤结构如图1。莫匹罗星抗生素被广泛用于治疗感染性伤口。然而,莫匹罗星的耐药细菌的增加(5]。现在,有许多研究发现高效和高度创新药物促进伤口愈合5,9- - - - - -11]。等离子体作为一种新型的医学有相对明确的生物效应包括广泛的细菌失活、促进细胞增殖、迁移和分化在低剂量,并促进细胞凋亡在高剂量6,12]。
一些研究已经进行了学习等离子体对伤口愈合的影响。Isbary et al。13)使用等离子发生器MicroPlaSterα和β治疗慢性伤口患者每天2分钟。设备可以减少细菌相比治疗组40%和23.5%。莱梅尔et al。14]PlasmaDerm vu - 2010设备已用于治疗7例,另一个7例接受常规治疗。两组接受治疗8周的每周3次。5例实验组减少伤口的大小。患者中7等离子体、细菌负荷已经显著减少,4患者减少溃疡大小。等离子治疗优势在减少伤口的大小和疼痛感。
总之,关键原因之一等离子体可以促进伤口感染是细菌造成影响。然而,另一个关键问题尚未解决的人员;即等离子体如何影响正常细胞,同时净化。一些人提到了等离子体的概念对细菌和细胞剂量(15,16),但他们没有把他们在同等条件下(包括电源、加工方法、加工区域,和处理时间)。
为了回答上述问题,我们设计了一个体外实验通过治疗常见伤口感染细菌和正常皮肤组织细胞与等离子体在相同条件下,然后检测等离子体的影响。许多研究已经证明,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌和大肠杆菌的主要原因延误急性和慢性伤口愈合和感染(10,17]。成纤维细胞和角质细胞在伤口愈合的过程中起着重要的作用[14]。在皮肤损伤的早期阶段,角质细胞开始和微分迁移到伤口,产生大量的细胞因子,它可以刺激不仅角质细胞,而且其他炎症细胞和成纤维细胞,促进伤口愈合18,19]。成纤维细胞结缔组织细胞,能产生胶原蛋白,修复缺陷和恢复解剖结构,促进伤口愈合14,20.]。主要分泌胶原蛋白I(85 - 90%)和胶原蛋白3 (10 - 15%)21]。
在我们的实验中,我们将等离子体应用于特定的区域,细菌和细胞填充空间(与6-well板直径3.5厘米)。重要的是要强调,HSF和角化细胞的大小是大约10微米,而细菌的大小大约是1微米,细菌的数量应该设置为细胞的数量的100倍。和液体环境中细胞和细菌坐落在等离子体处理改变了PBS的解决方案来消除不同文化传媒的影响。PBS通常用于当检测体外模拟体内环境。我们使用的设备是一个新数组式空气等离子体装置是可食用的,安全的,有一个很大的放电区域。等离子体的影响细菌和细胞的生存能力会通过CFU-counting法和流式细胞仪测定。由成纤维细胞分泌胶原蛋白我也测量。通过我们的工作,我们可以得出结论,可以灭活细菌在细胞仍然保持高活动相同的等离子电源。我每个成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力得到了增强。
2。材料和方法
2.1。DC-Driven帽阵列源
设备产生等离子体羽流(图2)是由直流低电压源。低电压提高到kV级通过设置电压互感器的1000倍。37组高压电极相连。每一组电极焊接是300米Ω限流电阻和钨针、等离子体生成钨针的尖端。飞机横截面是700毫米2这大大增加了治疗区域。设备是便携式的,因为它可以在空气放电。更重要的是,没有电击或明显的热感觉与人体直接接触了几分钟。
(一)
(b)
钨针的顶端之间的距离,产生等离子体处理和液体表面固定在15毫米。放电电流通过接地线电流测量的电流探针(Tektronix TCP312A)和电压测量的电压探针(Tektronix P6015A)。电流和电压的波形如图所示3。图3(一个)表明,放电表现为一个周期微秒脉冲重复和重复频率约为1.4 kHz。应用电压约5.74 kV。峰值电流可以达到40 mA。图3 (b)是一个典型的单脉冲的放大视图。
(一)
(b)
等离子体功率可以通过波形的公式来计算:
它可以计算出平均功率约为1.16 W。
2.2。水的化学分析方法
我们选择使用过氧化氢测定工具包(Beyotime,中国)来检测过氧化氢的浓度。50μL plasma-treated的解决方案与100年拍摄和混合μL(过氧化氢检测试剂。经过30分钟的反应,一个标(BioTek协同H1)被用来测量吸光度的波长560 nm。最后,过氧化氢的浓度可以根据标准曲线计算。
通过亚硝酸盐亚硝酸盐和硝酸盐的浓度检测化验设备(南京建成,中国)和一氧化氮测定工具包(硝酸还原酶方法)(南京建成,中国),及其在波长550纳米的吸光度检测到一个紫外分光光度计(UV1800PC,波长范围190 ~ 1100海里)。
2.3。试剂和细菌细胞/文化
金黄色葡萄球菌(CMCC (B) 26003)、大肠杆菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌(CMCC (B) 10104)是生命科学和技术学院提供的公司。这些细菌,分别播种到Trypticase酱油汤(TSB)媒体,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被储存在4°C,而铜绿假单胞菌是储存在室温下。
HSF和角化细胞是生命科学和技术学院提供的公司。细胞培养在杜尔贝科的修改鹰中、高葡萄糖(HyClone,美国)含15%胎牛血清(Gibco,美国)和1%青霉素和链霉素(Gibco,美国)。他们被播种在6-well板块与2毫升(康宁)和培养细胞培养箱(37°C, 5%的公司2)。确保细胞生存能力,所有实验都应该做当细胞增长来满足80 ~ 90%的6-well盘子的底部在章节3 - 6,和文化媒体应该改变每2天。
2.4。等离子体处理的细菌细胞
人们普遍知道有很大的区别细菌和细胞的大小。HSF和角化细胞的大小大约是10微米,而细菌的大小大约1微米。当相同数量的细胞和细菌传播6-well盘子的底部,治疗区域千差万别。细胞可以满足底部,而细菌只能覆盖1%的底部。这显然不符合我们的要求,在相同条件下处理细胞和细菌。为了保证一致性,细菌的数量应该设置为细胞的数量的100倍。咨询文献和实验后,我们知道它是合适当种子细胞的数量在每个6-well板块的2毫升的密度 ,所以细菌的数量应该设置为2毫升的密度 。
PBS代替文化传媒(细胞在DMEM培养,细菌培养在TSA介质)在等离子体处理消除不同文化传媒的影响。这个过程应该注意减少细菌和细胞的损失。对于细菌,我们使用2毫升的细菌密度的解决方案 ,离心机在10000转10分钟,仔细丢弃的上层清液,然后把2毫升的PBS解决resuspend细菌沉积物和6-well播种它到一个盘子。细胞,因为细胞贴壁细胞,可以取代旧的文化媒体2毫升PBS轻轻地在每个失去很少的细胞。
6-well板由细菌添加解决方案或细胞放置在洁净工作台接地。和一个与地面线是用来连接解决方案。等离子体处理后,细菌,收集的治疗方案。100年μL镀处理的解决方案是对胰蛋白示大豆琼脂(TSA)媒体和把它在细菌培养箱(37°C)约为24小时为后续CFU计数。细胞,一些附着细胞可能会变得不再附着和悬浮在等离子体处理后的PBS。为了减少错误,我们需要收集PBS治疗,在1000转离心5分钟,丢弃的上层清液,用1毫升的新鲜培养基resuspend细胞颗粒。1毫升的再悬浮细胞,另一个1毫升的新鲜培养基添加到一个好6-well板的细胞治疗。最后,细胞植入细胞培养箱培养24小时和48 h。
2.5。细胞生存能力分析
的膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(Dojindo实验室、日本)CytoFLEX(贝克曼库尔特,美国)是用来区分可行的细胞、凋亡细胞和坏死细胞。具体过程如下。
plasma-treated后细胞培养了24小时和48 h,分别,这些细胞(包括细胞上清液)与胰蛋白酶消化(没有EDTA) (Gibco,美国)和收集。我们已经增加了3毫升的PBS和离心机在1000转3分钟,然后丢弃的上层清液。细胞颗粒resuspended 300μL具有约束力的缓冲区。5μL的膜联蛋白V-FITC和5μL PI的解决方案添加到细胞悬液。这是孵化在室温下15分钟在黑暗中。最后,测试结果应该在1 h。
台盼蓝是摄政可以分化细胞生存能力。可以被染色的细胞蓝都死了。我们用台盼蓝染色细胞生存能力分析工具包(Beyotime,中国)计算可行的等离子体处理后细胞的数量。
2.6。我HSF分泌的胶原蛋白
HSF等离子处理后的上层清液收集24和48 h,胶原蛋白的浓度,我发现使用一个微型板块读者在450 nm波长与人类胶原蛋白I型酶联免疫试剂盒(南京建成,中国)。
2.7。统计分析
每个实验设置3个平行实验。所有与SPSS数据处理计算机程序(Windows版本21.0)由单向方差分析(方差分析)。结果表示为 。 被认为是具有统计学意义,而 非常重要的。
3所示。结果
3.1。等离子体对细菌的灭活效果
我们选择使用CFU-counting方法来量化等离子体对细菌的灭活效率,结果如图4。初始浓度的细菌都是106毫升。与帽治疗时间的增加,三种细菌的浓度表现出下降的趋势。当一分钟的等离子体处理,减少细菌的三种非常小,小于1的日志。当治疗时间达到2分钟,突然减少这些细菌的数量。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能减少几乎2日志和铜绿假单胞菌可以灭活,而花了3分钟为等离子体灭活5日志的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。通过实验结果,我们可以发现,等离子体有更大的失活效应对铜绿假单胞菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
3.2。等离子体对细胞生存能力和胶原蛋白分泌的影响
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
在图5HSF,随着治疗时间的增加,可行的细胞的百分比继续减少。然而,凋亡细胞的比例,晚期凋亡和坏死细胞不断上升。凋亡细胞的比例低于晚期凋亡和坏死细胞的百分比孵化24小时后,在48小时后的情况是相反的。这表明,增加等离子治疗时间可能会刺激凋亡程序的表达。所以应该避免过度等离子治疗。
角化细胞,他们是否培养24小时后48 h或等离子治疗,细胞可以保持良好的活动。而文化的48小时后,可行的细胞的数量减少而24小时的文化。和凋亡细胞的比例低于晚期凋亡和坏死细胞的百分比。从这些数据,我们可以发现,角化细胞更宽容比HSF寒冷的大气等离子体处理。等离子体处理后和文化24小时,可行的细胞的比例仍然可以保持在90%。
图5只能解释可行的细胞总细胞的百分比。它可能发生在治疗后,虽然可行的细胞的比例已经下降,而他们的数量与对照组相比增长了。为了澄清这一点,可行的细胞的数量和台盼蓝数。可行的对照组细胞的数量标准化为1,便于比较。结果如图所示6。
在图6HSF,不管孵化时间是24小时48 h,随着帽治疗时间的增加,可行的细胞的数量持续减少。当我们对待它1分钟和孵化24或48 h,或治疗2分钟和24小时孵化,HSF的数量没有显示一个明显的减少。而当我们治疗了2分钟和孵化48 h,或把它3分钟24或48小时孵化,HSF显示的数量急剧减少。特别是当细胞治疗3分钟,然后培养48 h,可行的细胞的数量下降到只有50%与对照组相比,这表明等离子治疗3分钟HSF可能太长。
角化细胞,之间没有显著差异的数量可行的实验组和对照组的细胞( ),这可以证明角化细胞对等离子体与HSF相比并不敏感。
我们可以发现,当等离子体处理时间在2分钟后不会减少可行的细胞48 h。虽然长时间的等离子体处理将导致极大的破坏细胞48 h后孵化24 h。
胶原蛋白起着重要的作用在促进伤口愈合。我们选择检测的分泌胶原蛋白我HSF等离子治疗后。分泌的胶原蛋白量的结果我HSF如图7。没有显著差异在胶原蛋白分泌帽治疗后与对照组相比 )。等离子体处理后3分钟和24小时孵化,细胞的数量是对照组的66%,如图6,但是我分泌胶原蛋白的数量并没有改变很多,表明每个细胞分泌胶原蛋白的能力我是等离子体的刺激下大大增强。等离子治疗3分钟和孵化后48 h,胶原蛋白的分泌减少到80%的对照组,可行的细胞的数量是对照组的50%,所以我每个细胞分泌胶原蛋白的能力也增强。
3.3。活性物种在水相
pH值、氧化还原电位(ORP),活性物种在水相测量,如图8,这反映了长寿命等离子处理后活性成分。在水相,由于PBS溶液的缓冲能力pH值,pH值基本上不改变和维持在约7在PBS溶液被等离子体。ORP增加与帽治疗时间的增加,和最大ORP 259 mV。ORP值基本上没有杀菌能力当pH值是7。在等离子治疗,亚硝酸盐的浓度,硝酸和过氧化氢积累不断 , ,和 在3分钟。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
使用等离子治疗感染伤口已经收到了越来越多的关注(22- - - - - -26]。作为一个有效的药物,其生物机制在细胞水平上已经被一些研究者研究[6,12,20.,27]。现有研究表明,等离子体具有很强的抗菌能力,这可以减少细菌负荷在伤口13,14),促进细胞的增殖和迁移通过刺激细胞因子的分泌,并促进血管的生产(28]。但获得的结论是不相同的等离子体参数,和他们没有控制细胞和细菌的治疗区和液体环境是平等的。等离子体的剂量,杀死细菌可能做很多伤害细胞,剂量和血浆,促进细胞增殖可能不会杀死细菌。人们想知道是否可以伤害正常细胞,洗净。
通过我们的工作,空气数组等离子体装置已用于治疗细胞和细菌在同样的环境,同样的电气参数。治疗细胞和细菌的数量和实验过程已经决定以确保治疗区域的一致性。在同样的电气参数和同一地区治疗,所选择的三个细菌可以在3分钟内完全净化,但HSF和角化细胞仍能维持高的活动。在我们的实验中,也有细菌和细胞治疗时等离子体之间的区别。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等离子3分钟杀死,而铜绿假单胞菌只花了2分钟。角化细胞能保持大约90%的活动等离子治疗后3分钟,而HSF细胞只能维持70%的活动,但胶原蛋白分泌的总量仍基本上不变,和一个HSF细胞分泌胶原蛋白的能力极大的改进。通过结果,我们也可以发现,过度等离子治疗将导致损害细胞的长时间孵化。
帽的功效在生物应用程序可能依赖于共同作用的活性氧(ROS),活性氮物种(RNS)、自由基、紫外线光子,带电粒子,和电场29日- - - - - -31日]。等离子体可以产生大量的活性氧和氮物种(罗恩)在放电过程中,其中ROS主要包括 , , , ,和和RNS主要包括 , ,和 。电场的影响也是一个重要因素,当等离子体直接治疗。这些文章(32- - - - - -35]介绍了瞬态电场特性的实验测量和模拟大气等离子体研究的冷。紫外线辐射也贡献等离子治疗期间,这被认为是导致DNA链的胸腺嘧啶二聚作用,抑制细菌的能力正确地复制(36]。
氧化应激可能是导致细胞死亡的主要原因(37]。这些等离子体产生的活性物种可能会修改或破坏细胞膜的完整性通过物理或化学方法。脂类是最容易氧化大分子在细胞膜,和脂质过氧化(法律流程外包)的膜会导致胞质泄漏。法律流程外包是一个连锁反应,产生MDA(丙二醛)。MDA是一项指标描述法律流程外包的有效性。等离子体处理结果在细胞内MDA水平显著增加37,38]。Joshi减少大肠杆菌的形态学观察治疗大肠杆菌与等离子体,一个典型的行为通过减少表面积减少代谢活动和能源需求,通常观察到当细胞受到严重的氧化应激。燕et al。39等离子体羽流)用于治疗HepG2细胞。有人提议,细胞内活性氧会攻击膜脂不饱和脂肪酸侧链,导致脂质氢过氧化物的形成。细胞膜的脂质氢过氧化物的积累会影响细胞的正常功能,导致细胞膜的破裂,最终导致严重的细胞质泄漏(40]。和等离子体处理可引起细胞周期阻滞于G2 / M期(39]。
在这个实验中,细胞仍能保持良好的活动下的等离子体参数可以杀死细菌。我们推测的原因不同的细胞和细菌之间的宽容等离子体如下。比细菌细胞有更先进的自适应机制。有研究指出,细菌积累的静电压力等离子治疗后将摧毁细菌壁结构,而细胞有更强大的功能,可以适应当地的电气环境的变化引起的等离子体(15,41]。细胞有一个更复杂的防御机制对超氧化物过氧化反应中发挥重要作用的磷脂双分子层会导致DNA损坏(39]。细胞过氧化物转化为更少的有害的过氧化氢和修复DNA损伤,而细菌无法这样做,由于缺乏足够的相关酶(42]。研究证明,过氧化氢的浓度会导致DNA双链断裂等于10μ米(28]。我们测量了过氧化氢的浓度如图8。过氧化氢的浓度是0.34μ这将导致没有伤害细胞。细菌细胞表面体积比低于意味着细胞的表面将损害较少受紫外线和电场。更重要的是,较低的表面体积比意味着更多的自适应氧化应激(43]。细菌总是经常复制,没有细胞核,所以它的DNA是暴露这将很容易受损,展开下等离子体处理(16]。这不仅仅是细胞和细菌,宽容不同等离子体。之间有不同的失活时间不同的细菌。革兰氏阳性细菌更难杀死基于目前研究[41]。革兰氏阳性细胞壁厚(20 - 80 nm)和更高的刚度比革兰氏阴性细胞壁(1.5 -10海里)。革兰氏阴性细胞表面粗糙,不规则的由于一个外膜的存在,以便它可以更敏感静电干扰(15,44]。
众多研究表明,一氧化氮是一种重要的分子在促进伤口愈合45- - - - - -47]。一氧化氮能促进伤口愈合,促进HSF迁移和胶原蛋白分泌(47]。水相中的浓度一氧化氮水平应由亚硝酸盐和硝酸盐的总和。在我们的实验中,一氧化氮的浓度( )在plasma-activated PBS大约有328μm。
等离子治疗时间较长(3分钟)将造成更大的破坏细胞48 h内孵化,这表明,过度的等离子体将造成持续伤害细胞,它可能通过累积影响子代细胞基因组不稳定性(48,49]。所以,这是非常重要的找到合适的等离子体处理时间,可以安全使用。我们的实验证明,细菌更敏感比细胞在相同条件下的等离子体。虽然应该避免过度等离子治疗,防止损伤细胞,在临床应用中,情况是非常复杂和体外协议不能直接应用。人体的阻抗因素也应该被认为是(50]。因此,可以进一步探索这个主题。
冷大气等离子的优点作为一种新型的广谱杀死细菌感染伤口治疗,可以不加区别地对待不同的细菌。快速、方便、高效的治疗可以通过使用等离子疗法。此外,等离子体杀死细菌的机制是基于组合的化学和物理作用(51),所以它的机制是非常复杂的。更重要的是,等离子体处理后,细胞仍能保持良好的活性和胶原蛋白分泌能力。
5。结论
等离子体作为一种有效的药物,广泛用于伤口愈合。实验验证,同样的等离子体剂量灭活细菌在细胞还能维持高的活动。和每个细胞可以分泌更多的胶原i .总之,等离子体在细胞生物效应的区别和细菌感染愈合机制的研究是很重要的,它可以提供一个参考确定最好的等离子体处理时间。
数据可用性
所有数据支持结果提供的文本和数据可从作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yiqian李和兰兰聂导致的设计实验,进行实验,并起草了手稿。陈太阳协助实验。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号。52130701,11805075,11805075,52277150)和中国国家重点研究和发展计划(批准号SQ2020YFE010195)。