文摘

Sepsis-related急性肾损伤(AKI)是一个全球健康问题,及其发病机制涉及多个通路。脂多糖(LPS)是一种内毒素诱发系统性炎症反应。蜂毒肽,蜂毒的主要成分,对一些生物活性如抗氧化剂,抗炎,抗凋亡的行动。然而,是否蜂毒肽预防endotoxin-induced阿基仍未确定。这里,我们旨在研究蜂毒素的潜在行动LPS-induced肾损伤和探索的机制。我们表明,急性肾功能衰竭和结构损伤后注射LPS明显减毒蜂毒素的政府。肽也抑制表达标记LPS-treated直接管损伤肾脏的老鼠。从力学上看,蜂毒肽减少系统性和肾功能水平的细胞因子和抑制肾免疫细胞积累与伴随的抑制核转录因子kappa-B途径。有限合伙人治疗后增加大量的脂质过氧化反应产品在很大程度上减少了蜂毒肽。此外,肽的表达减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4和增强的核因子erythroid-2-related因子2-mediated抗氧化防御。 Moreover, melittin inhibited apoptotic and necroptotic cell death after LPS treatment. Lastly, we showed that melittin improved the survival rate of LPS-injected mice. These results suggest that melittin ameliorates endotoxin-induced AKI and mortality through inhibiting inflammation, oxidative injury, and apoptotic and necroptotic death of tubular epithelial cells.

1。介绍

脓毒症是一种严重的疾病引发的异常免疫反应,感染和仍然是一个全球主要的死亡原因在医院(1]。急性肾损伤)经常发生脓毒症的发病率,与危重患者死亡率增加相关(2]。标准从sepsis-related肾损伤病人的治疗包括抗生素和快速管理避免低血压通过足够的液体复苏或使用升压(3]。然而,当前的治疗有一定的局限性,开发新型药物的目的是安全有效地控制sepsis-related阿基将提供一个更有前途的治疗方法预防严重的医疗条件。sepsis-related AKI的机制是多因素疾病,仍然不清楚。其分子模式(pamp)是由微生物产生的,被模式识别受体。在脓毒症中,它们释放到血液循环(3]。在pamp,脂多糖(LPS)是一种革兰氏阴性细菌产生的内毒素。这炎性介质刺激许多不同类型的细胞包括肾小管上皮细胞和免疫细胞通过toll样受体相互作用(通常),导致氧化应激诱导的炎症和细胞死亡(3- - - - - -5]。

在过去的几个世纪里,蜂毒疗法已被应用于人类急性和慢性疾病的管理(6]。毒素包含多种生物活性肽和酶。其中,蜂毒肽是一种多肽构成大约50%的毒素的干重(7]。新出现的证据表明,肽具有多种生物功能包括抗氧化、抗炎、抗菌行为(8,9]。最近的一项研究表明蜂毒肽改善单侧输尿管梗阻后肾损伤和纤维化小鼠(10]。然而,是否蜂毒肽预防LPS-induced阿基仍未确定。在这项研究中,我们评估了行动的蜂毒肽endotoxin-induced肾损伤和探讨了机制。

2。材料和方法

2.1。材料

蜂毒肽是购自恩佐生命科学(美国纽约法明岱尔)和有限合伙人收购Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。肌酐和血尿素氮(BUN)测定包被收购了从生物测定系统(美国海沃德CA)和峨山制药(首尔,韩国),分别。酶联免疫吸附试验(ELISA)对肿瘤坏死因子-套件α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6)是获得从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。脂质过氧化作用比色/荧光测定从Sigma-Aldrich装备了。Lotus tetragonolobus凝集素(LTL)与荧光素共轭从向量获得实验室(美国伯林盖姆,CA)。主要抗体抑制剂κB -α(我κB -α导出),电κB -α核转录因子,κB (NF -κB) p65 p-NF -κB p65,裂解聚(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)裂解caspase-3, p53, receptor-interacting丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (RIPK1) RIPK3, mixed-lineage激酶域蛋白质(MLKL) p-MLKL或glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)从细胞信号(丹弗斯、马、美国)。主要抗体Mac-2、CD4 4-hydroxynonenal (4-HNE)、肿瘤坏死因子-α、il - 6、肾损伤molecule-1 (Kim-1)和核转录因子erythroid-2-related因子2 (Nrf2)获得Abcam(美国Cambridge, MA)。Antineutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)和anti-Bax主要从圣克鲁斯生物技术获得的抗体被(美国圣克鲁斯,CA)。主要的抗体对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 (NOX4)获得罗福斯生物制剂(利特尔顿有限公司、美国),和主要抗体血红素加氧酶1 (HO-1)收购恩佐生命科学。Anti-lamin B1主要抗体购自英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。核蛋白质提取设备是来自热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)和布拉德福德蛋白质化验设备收购从Bio-Rad实验室(美国大力神,CA)。RNeasy迷你包从收购试剂盒(瓦伦西亚、钙、美国),和高容量cDNA逆转录工具包获得应用生物系统公司(美国CA福斯特城)。混合电力SYBR绿色PCR主应用生物系统公司的收购。原位细胞死亡检测设备是来自罗氏诊断(美国在印第安纳波利斯)和Lightshift®是来自热费希尔科学化学发光EMSA工具包。

2.2。动物

动物实验是进行雄性C57BL / 6 N小鼠(8周的年龄;Samtako生物韩国乌山、韩国)。老鼠被安置在 °C在12小时的日夜周期和免费获取标准啮齿动物饮食和水。机构的动物保健和使用委员会大邱天主教大学医学中心批准所有实验程序。

2.3。协议的LPS-Induced阿基

老鼠被随机分为三组( 每组):vehicle-injected集团(阿明费),LPS-injected集团(有限合伙人)和有限合伙人+蜂毒肽治疗组(有限合伙人+梅尔)。LPS组小鼠腹腔注射LPS(10毫克/公斤)。老鼠的Veh组受到的腹腔内注射无菌生理盐水的体积相等。蜂毒肽(0.01毫克/公斤)小鼠的腹腔内注射LPS +梅尔组注射LPS前1小时。本研究中使用的剂量的蜂毒肽和有限合伙人选择基于之前的研究结果(10- - - - - -12]。在注射LPS后24小时,所有老鼠都牺牲了。肾脏被立即隔离,血液样本集合是由心脏穿刺。为生存实验,小鼠被随机分为三组( 每组;阿明费、有限合伙人和有限合伙人+梅尔)。小鼠腹腔注射蜂毒肽(0.01毫克/公斤)前1小时注射LPS(20毫克/公斤)。有限合伙人治疗后生存监控直到96小时。

2.4。生化分析

全血分离成等离子体进行了用离心的方法。肾功能评估评价血浆肌酐浓度和包,进行使用肌酐和包分析工具,分别。等离子体浓度的TNF -α使用ELISA试剂盒和il - 6进行了分析。大量的丙二醛(MDA),分析了在肾脏脂质过氧化作用的产品,使用脂质过氧化作用比色/荧光测定工具包。

2.5。组织学分析、免疫荧光和Immunohistochemisty(包含IHC)

肾脏在4%多聚甲醛固定。然后组织脱水,清除,分段嵌入在石蜡块,和。切片后,苏木精和伊红())和周期性acid-Schiff (PAS)染色进行薄片。管损伤评估在10任意选择不重叠的领域(400 x放大)为每个肾脏PAS-stained部分。受伤的程度得分是基于受损区域的百分比:得分0,没有管损伤;分数1≤10%的小管受伤;分数2,11 - 25%受伤的小管;分数3,26 - 45%受伤的小管;得分4,46 - 75%的小管受伤;分数76 - 100%的受伤小管(13,14]。刷状缘的近端小管通过染色与LTL共轭荧光素被发现。包含IHC,探讨了肾脏部分主要抗体NGAL, Kim-1, Mac-2, CD4,或者4-HNE。洗后,部分和二次抗体孵化。用苏木精核复染色了。阳性染色为特定目标的百分比分析10任意选定字段(400 x放大)为每个肾脏使用i-Solution DT软件(IMTechnology、温哥华、BC、加拿大)。细胞染色Mac-2或CD4的数量在10计算任意选定字段为每个肾脏(400 x放大)。

2.6。西方墨点法

蛋白质提取从组织裂解缓冲。核分数使用核蛋白质从组织分离提取工具。蛋白质样品使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分离。分离蛋白被转移到膜上,并探讨了主要抗体NGAL, TNF -αil - 6,我κB -α导出,κB -αNF -κB p65 p-NF -κB p65 NOX4 Nrf2、HO-1 caspase-3裂解,裂解PARP-1, p53,伯灵顿,RIPK1, RIPK3, MLKL, p-MLKL,核纤层蛋白B1或GAPDH。洗后,膜与二次抗体探测。核纤层蛋白B1和GAPDH是用作加载控制。的ChemiDoc^TMXRS +系统(Bio-Rad实验室)是用于检测化学发光信号。

2.7。实时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)

从组织总RNA提取使用RNeasy迷你工具包。高容量cDNA逆转录工具包用于合成互补。使用电力SYBR绿色实时rt - PCR进行PCR大师混合和应用生物系统公司7500实时PCR系统。表1显示引物序列用于这项研究。特定基因的相对表达计算了2^{- - - - - -ΔΔCT}方法,使用GAPDH基因作为参考。

2.8。TdT-Mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色

肾小管细胞凋亡在肾脏部分被TUNEL染色使用原位细胞死亡检测工具根据制造商的指示。总之,部分deparaffinized,水化,permeabilized。然后,探讨了部分与TUNEL反应混合物。4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)应用到可视化细胞核。细胞与TUNEL染色数在10任意选择不重叠的每个肾脏(400 x放大)。

2.9。电泳迁移率改变分析(EMSA)

EMSA都使用了Lightshift®化学发光EMSA装备根据制造商的指示。biotin-labelled DNA的化学发光检测使用Chemidoc XRS +系统(Bio-Rad实验室)。NF -κB寡核苷酸探针(5 - - - - - -AGT TGA GGG广汽TTT CCC gg颈- 3 )是结束标记digoxigenin ddUTP。

2.10。统计分析

给出的结果 。组间显著差异确定使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni事后测试。生存分析是使用kaplan meier执行方法。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。蜂毒肽抑制LPS-Induced肾脏功能障碍和结构损伤

LPS-treated老鼠表现出深刻的肾功能下降,随着由增加血浆肌酐浓度和面包,在24小时后注射LPS(数字1(一)和1 (b))。他走时,PAS染色显示LPS-injected老鼠显示组织病理学改变,包括管状扩张和肾小管上皮细胞肿胀(数字1 (c)和1 (d))。有限合伙人治疗后明显下降LTL染色也观察到,表明LPS诱导的刷状缘在近端小管(数据损失1 (e)和1 (f))。然而,肾脏功能障碍和结构损伤诱导内毒素被蜂毒素管理显著改善。

接下来,免疫组织化学染色肾脏部分anti-NGAL或anti-Kim-1抗体进行了进一步探讨蜂毒肽的作用在管状损伤LPS-injected老鼠。我们发现蜂毒肽显著降低LPS治疗后管损伤标志物的表达(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。西方墨点法还透露,增加NGAL LPS-injected小鼠蛋白质水平主要由蜂毒肽抑制(图2 (d))。

3.2。蜂毒肽抑制LPS-Induced炎症

内毒素可以触发炎症激活通过增加大量炎症介质的分泌免疫细胞(3]。它已经表明蜂毒肽发挥抗炎活动(8]。探讨蜂毒肽的作用endotoxin-induced炎症反应,我们测量血浆TNF -的浓度α和il - 6组。管理蜂毒肽显著降低血浆浓度的有限合伙人治疗后细胞因子(数字3(一个)和3 (b))。信使rna和蛋白质水平的这些细胞因子增加肾脏也很大程度上减少了蜂毒肽(数字3 (c)和3 (d))。接下来,我们评估endotoxin-induced NF -肽的影响κB激活。蜂毒肽显著降低》κB -α表达和增加我κB -αLPS-injected小鼠肾脏的表达,表明我减少κB -α磷酸化导致增加我的稳定κB -α蜂毒肽治疗后(图3 (e))。水平的NF -κB p65及其磷酸化形式在肾脏也明显减少了蜂毒肽(图3 (e))。进一步检查的作用对dna结合活性的肽NF -κEMSA B,核提取物进行了分析。NF - dna结合活性增加κB是LPS-injected老鼠(图中观察到肾脏3 (f))。然而,这种绑定活动增加在很大程度上抑制了蜂毒肽。免疫组织化学染色显示,蜂毒素很大程度上降低了细胞的数量沾Mac-2或CD4 LPS-treated小鼠的肾脏,表明肽抑制免疫细胞的渗透进入肾脏受伤(数字4(一)- - - - - -4 (c))。

3.3。蜂毒肽抑制LPS-Induced氧化损伤

除了炎症,氧化应激发挥了至关重要的作用在endotoxin-induced肾损伤的病理生理学(4]。下一个评估蜂毒素对氧化应激的影响,我们染色肾脏部分4-HNE抗体检测脂质过氧化作用的产品。我们发现4-HNE-positive细胞的数量在很大程度上增加了肾脏LPS-injected小鼠控制老鼠相比,显著降低的蜂毒肽(数字5(一个)和5 (b))。肾MDA水平也显著减少了蜂毒肽有限合伙人治疗后(图5 (c))。

NOX4是主要来源之一的活性氧(ROS)在LPS-induced阿基(15,16]。我们发现信使rna和蛋白质水平的NOX4在很大程度上减少了蜂毒肽在LPS-injected小鼠的肾脏(数字5 (d)和5 (e))。此外,治疗有限合伙人也导致核易位Nrf2 HO-1蛋白质含量的增加,其目标基因在肾脏(图5 (f))。有趣的是,蜂毒素管理进一步加强核易位HO-1 Nrf2和蛋白质的表达。肾mRNA NAD (P) H水平:醌氧化还原酶1 (NQO1),另一个目标Nrf2基因,以及HO-1蜂毒肽也显著增强,表明肽进一步激活Nrf2-dependent抗氧化反应途径(图5 (g))。

3.4。蜂毒肽减毒LPS-Induced细胞凋亡

细胞凋亡也有助于endotoxin-induced肾损伤的病理生理学5]。因此,我们调查了在endotoxin-induced蜂毒肽细胞凋亡的作用。LPS-injected老鼠表现出深刻的增加细胞的数量与TUNEL染色肾脏(数字6(一)和6 (b))。然而,蜂毒肽显著降低TUNEL-stained细胞的数量。此外,增加乳沟caspase-3 PARP-1,其基质,有限合伙人治疗后明显减弱了蜂毒肽(图6 (c))。我们还发现,蜂毒素减少蛋白质p53和伯灵顿(图的水平6 (c))。

除了细胞凋亡,最近的研究表明,necroptosis,另一种形式的细胞死亡,发挥了至关重要的作用在阿基17]。我们观察到治疗与LPS RIPK1蛋白表达明显增加,RIPK3, p-MLKL,表明LPS诱导necroptotic细胞死亡(图6 (d))。然而,这些变化被蜂毒肽显著逆转。

3.5。蜂毒肽改善LPS-Injected小鼠存活率

最后,评估LPS-injected老鼠的蜂毒素对存活率的影响,蜂毒肽剂量为0.01毫克/公斤腹腔注射小鼠1小时前注射LPS的剂量20毫克/公斤。我们发现蜂毒肽治疗的存活率显著提高LPS-injected老鼠(图7)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们评估蜂毒素的潜在行动LPS-induced肾损伤及其机制研究。我们的数据显示,政府的蜂毒肽改善LPS处理后安琪和改善生存率。肽的有利的行动是由于抑制炎症,氧化损伤,肾小管细胞死亡(图8)。我们的数据揭示了小说蜂毒素对LPS-induced肾损伤产生的有利影响。

Sepsis-related阿基密切相关危重患者的临床结果较差(2]。然而,目前没有药物治疗sepsis-related肾损伤。最近,我们表明蜂毒的有益作用及其组件apamin LPS-induced急性肾功能衰竭和结构性破坏12,18]。然而,蜂毒素的影响,蜂毒的主要组成部分,对LPS-induced阿基尚未报道。在这项研究中,我们证明了蜂毒肽抑制急性肾功能下降,由血浆肌酐和包子水平降低,和结构损伤,如管状扩张,肾小管上皮细胞肿胀,和刷状缘脱落。此外,增加表达Kim-1 NGAL,管状损伤标记,也很大程度上减毒的肽。总的来说,这些发现表明,蜂毒肽显示renoprotective效应对endotoxin-induced功能和结构损伤。

pamp发挥关键作用的调节宿主对感染的免疫反应和检测到的模式识别受体(19]。有限合伙人是一个著名的PAMP时,由革兰氏阴性细菌。在细菌性败血症,这些炎症介质与通常表示在许多不同类型的细胞表面的包括肾小管上皮细胞和免疫细胞,导致细胞因子的异常分泌3]。在这项研究中,我们分析了等离子体浓度和肾脏细胞因子来评估是否蜂毒肽发挥抗炎作用。等离子体和局部组织TNF浓度-α注射LPS后和il - 6在很大程度上增加了。然而,蜂毒肽抑制细胞因子的水平,这表明肽抑制LPS引起的全身和局部炎症反应。鉴于NF -κB是一个关键的转录调制器调节生产受损肾脏的细胞因子(20.),我们对NF -下评估其影响κB信号级联。蜂毒肽显著降低磷酸化水平的我κB -α和NF -κB p65 LPS后治疗。此外,NF - dna结合活性κB p65被蜂毒素抑制。与我们的结果一致,先前的研究表明,肽显示抗炎活动对各种炎症性疾病(8]。据报道,奥巴马政府的蜂毒肽抑制炎性细胞因子的生产在单侧输尿管obstruction-induced肾损伤(10]。肽减毒endotoxin-induced NF -κB激活人类角质细胞和单核细胞21,22]。蜂毒肽抑制炎性细胞因子的生产在LPS引起的动脉粥样硬化小鼠和高脂肪饮食22]。此外,该肽改善D-galactosamine并通过抑制NF - endotoxin-induced急性肝衰竭κB信号(23]。已经知道,大规模的免疫细胞渗透到肾脏受伤通常是有限合伙人治疗后观察(12]。浸润免疫细胞可以产生各种细胞因子和加重肾脏的炎症反应。在这项研究中,蜂毒肽缓解endotoxin-induced积累在肾组织免疫细胞。最近报道,肽抑制肥大细胞和T淋巴细胞的积累实验过敏性皮炎的皮肤损伤(11,24]。

除了炎症、氧化应激也在sepsis-related肾损伤中起着重要作用[4,25]。先前的研究已经报道,sepsis-related阿基与ROS生产过剩(密切相关26,27]。在目前的研究中,LPS-injected老鼠表现出增加肾的脂质过氧化作用的产品,由蜂毒肽显著抑制。我们也观察到,蜂毒肽显著减少肾NOX4表达式。因为NOX4主要ROS发电机之一endotoxin-induced肾损伤的病理生理学(15,16),减少prooxidant酶的表达蜂毒肽可能会降低ROS生产肾脏。Nrf2是一个关键的转录因子,调节抗氧化基因的表达和提供了一个关键的细胞防御氧化应激(28,29日]。增加活性氧可以触发Nrf2响应(30.]。在这项研究中,我们发现,蜂毒素增加核易位Nrf2并发upregulation的目标基因,HO-1和NQO1 LPS-injected小鼠的肾脏。先前的研究也报道,蜂毒肽改善心肌炎小鼠通过激活Nrf2 [31日]。总的来说,这些发现表明prooxidant和抗氧化系统的监管蜂毒肽对LPS-induced AKI参与其有益的行动。

我们已经了解到,Nrf2通路抑制NF -κB激活,反之亦然(32]。然而,在我们的研究中,我们观察到,NF -κB和Nrf2信号通路被激活有限合伙人同时治疗。在良好的协议与我们的观察,以往的研究也报道同时激活的信号通路在LPS-injected老鼠33- - - - - -35]。LPS-induced Nrf2激活可能是一个保护机制对NF -κB-mediated炎症反应。然而,Nrf2激活的程度似乎并不足够抑制NF -κB信号。有趣的是,蜂毒肽治疗进一步加强LPS-induced Nrf2激活,导致抑制NF -κB信号通路。与这些研究结果一致,信使rna和蛋白质的表达HO-1蜂毒肽也显著增强。然而,随着HO-1表达式可以由其他转录因子(36,37),我们不能排除这种可能性,Nrf2-independent途径也参与HO-1的调制。

细胞凋亡也有助于sepsis-related肾损伤的病理生理学5]。暴露的肾小管上皮细胞有限合伙人导致深刻的细胞凋亡(38]。pan-caspase抑制剂减少细胞凋亡和肾损伤endotoxin-induced肾损伤(39]。在这项研究中,LPS-treated老鼠表现出深刻的增加细胞的数量与TUNEL染色相伴的caspase-3激活肾脏。然而,有限合伙人的不利影响被蜂毒素明显缓解。从力学上看,蜂毒肽减少肾p53和伯灵顿,其转录目标基因,有限合伙人治疗后,表明肽抑制p53-dependent凋亡途径。因为肾小管细胞凋亡的一个重要因素sepsis-related肾损伤(5),我们的研究表明蜂毒肽与endotoxin-induced肾损害的有益作用,至少部分归因于其凋亡活性。以前的研究都集中在蜂毒肽的抗肿瘤活性40]。然而,最近的研究报道,肽施加强大的各种类型的正常细胞凋亡效应(41,42)和组织(23,31日]。

Necroptosis是一种程序化的坏死和是一个重要的致病过程在阿基17]。新出现的证据表明,necroptosis至关参与肾缺血再灌注损伤(43),cisplatin-induced肾毒性(44],sepsis-related肾损伤(45]。在necroptosis RIPK1与RIPK3形成multiprotein复杂,负责监管MLKL的磷酸化。磷酸化MLKL诱发质膜破裂,从而导致释放细胞内的组件,导致炎症反应的诱导。RIPK3,在这项研究中,表达RIPK1磷酸化MLKL增加有限合伙人治疗后,被蜂毒素明显减弱。总的来说,这些发现表明蜂毒肽抑制LPS-induced necroptotic细胞死亡。

5。结论

这些结果表明蜂毒肽预防endotoxin-induced肾损伤和死亡通过抑制炎症反应、氧化应激和凋亡necroptotic细胞死亡。肽已经显示有一个强有力的抗菌性质(9]。因此,蜂毒素可能是一个潜在的治疗选择防止败血症的肾并发症。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

J.-Y.K。J.L.,和H.-L.H. conceived and designed the experiments. J.-Y.K. performed the experiments. J.-Y.K. and J.L. analyzed the data and wrote the manuscript. H.-L.H. reviewed and edited the manuscript.

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部资助的ICT和未来规划(MSIP) (NRF - 2020 r1c1c1003348和联盟- 2019 r1g1a1008777)。