文摘

脊髓损伤(SCI)是指一个主要全球意外死亡和残疾的原因。然而,复杂的病理生理机制可能导致有效的临床治疗。生长分化因子11 (GDF-11),一个抗衰老因子,据报道,影响神经发生的发展和发挥脑缺血性损伤后神经保护作用。目前的研究旨在调查GDF-11在SCI后功能恢复的影响,除了潜在的机制。我们雇了一个小鼠模型的脊髓挫伤损伤和功能评估结果通过低音部鼠标规模和足迹分析SCI后。利用免疫印迹分析和免疫荧光,我们分析了pyroptosis的水平,自噬,necroptosis,分子AMPK-TRPML1-calcineurin相关信号通路。结果表明,GDF-11明显优化function-related复苏,自噬增加,抑制pyroptosis,缓解necroptosis SCI后。此外,GDF-11施加有益的影响正好相反的应用3-methyladenine马(3),一个自噬抑制,表明自噬严重影响治疗相关的好处GDF-11 SCI后恢复。所述机械的研究,GDF-11刺激随后自噬改善和抑制pyroptosis necroptosis,这被认为是由TFE3;这种效应引起的活动通过AMPK-TRPML1-calcineurin TFE3信号级联。 Together, GDF-11 protects the injured spinal cord by suppressing pyroptosis and necroptosis via TFE3-mediated autophagy augmentation and is a potential agent for SCI therapy.

1。介绍

脊髓损伤(SCI)指的是一种破坏性疾病,导致严重的神经系统和运动障碍结构时受伤(1]。临床上,一些科学治疗,包括手术、血压升高、甲强龙管理局能够减压和稳定的伤害,预防继发性并发症和管理症状(2- - - - - -4]。SCI病理复杂,操作分为两种状态:主要损伤引发的机械损伤,包括脱髓鞘和轴突和神经元的坏死,和二次损伤由多种病理生理学,包括自噬,细胞凋亡,氧化应激,炎症,和其他因素,它们主要加重神经功能障碍和可能是可逆的和监管5- - - - - -7]。因此,二次伤害预防和干预被认为是很有前途的治疗SCI (8]。中提到的病理生理的事件在二次损伤,细胞死亡和炎症被认为是两个关键目标科学治疗(9,10]。

Pyroptosis、proinflammation-related程序性细胞死亡通路存在显著影响,一个关键元素,驱动器通过inflammasome post-SCI继发损伤,诱导激活(11,12]。multimeric inflammasome指的是一个复杂的蛋白质,包括胞质传感器(如NLRP1, NLRP2, NLRP3,等等),一个适配器蛋白(ASC)和一个效应半胱天冬酶(caspase-1) [13,14]。通过刺激胞质inflammasome复杂,caspase-1/4/5/11被激活和gasdermin——(GSDMD)N域转移到细胞膜,从而诱导形成孔隙,导致pyroptosis [15- - - - - -17]。Necroptosis proinflammation-related程序性细胞死亡的另一种类型,是由绑定激活的肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1),参与细胞内的信号级联涉及receptor-interacting蛋白激酶1/3 (RIPK1/3)和混合血统激酶域(MLKL)蛋白质18]。此外,它是证明caspase-8抑制necroptosis[的发生19]。越来越多的研究表明,necroptosis pyroptosis导致许多神经系统疾病,包括缺血性脑损伤,神经退行性疾病和精神疾病(20.,21]。此外,necroptosis pyroptosis加重神经元和神经胶质细胞死亡后SCI (22,23]。因此,针对necroptosis和pyroptosis承诺对SCI作为一个潜在的治疗。

Macroautophagy(以下称为自噬)是一个动态监管机制,维持细胞内环境的稳定性和选择性地降解长寿蛋白质和受损的细胞器(24,25]。越来越多的证据,自噬在神经系统疾病有关键影响通过调节神经细胞死亡(26,27]。根据SCI发病机理,在自噬溶酶体损伤和功能障碍可以触发缺陷通量和混乱的环境,引发炎症反应(28]。随后,激活NLRP3 inflammasomes促进pro-IL-1的乳沟β/ 18和劈开GSDMD分成2部分,最终启动pyroptosis [29日- - - - - -32]。此外,人们已经发现,溶酶体损伤自噬流量减少,导致快速增加necroptosis活化剂RIPK1, RIPK3, MLKL神经元(33]。此外,最近的研究也表明,自噬可以抑制pyroptosis和necroptosis降解关键催化剂(34- - - - - -36]。因此,我们推测,自噬可以调节神经细胞的死亡神经保护通过抑制pyroptosis和necroptosis可能改善SCI后功能恢复。因此,积极的药物能够抑制pyroptosis和necroptosis应确定通过自噬的激活。

生长分化因子11 (GDF-11)属于转化生长因子β(TGF -β)总科,成员众多的过程的影响,如组织发生,胚胎发育,癌症和代谢紊乱37,38]。最近的一项研究表明,GDF-11发挥其神经保护作用在脑缺血性损伤减少神经细胞凋亡39]。GDF-11治疗也改善功能结果和刺激神经发生和血管生成在老鼠通过激活自噬在缺血性中风40]。然而,GDF-11治疗SCI施加的影响从来没有被调查。此外,GDF-11抑制pyroptosis和necroptosis是否通过激活自噬仍然未知。因此,我们评估了GDF-11对自噬的影响,pyroptosis, necroptosis和评估它对SCI后功能恢复的影响使用SCI注射GDF-11的小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物和伦理语句

健康的成年C57BL / 6小鼠(女性,平均体重20 - 30 g)来自温州医科大学实验动物中心(许可证号。SCXK (ZJ) 2015 - 0001),浙江,中国。所有的动物都被安置在标准条件下(温度:21 - 25日°C, 12 h光/暗周期,湿度:50 - 60%)与免费的水和食物。有关动物实验过程遵循的指导的实验室动物保健和使用中国国家卫生研究院,作为接受温州医科大学动物保健和使用委员会(wydw 2017 - 0022)。

2.2。抗体和试剂

下面列出的化学物质被使用在此:GDF-11收购PeproTech(落基山,美利坚合众国;猫# 120 - 11)。Solarbio科技(中国,北京)提供了戊巴比妥钠,diaminobenzidine (DAB)开发人员,马森染色工具,苏木精和伊红染色(他)工具。Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美利坚合众国;猫# M9281)提供3-methyladenine马(3)。MedChemExpress(新泽西州蒙茅斯结,美利坚合众国;猫# hy - 13418 a)提供了dorsomorphin(复合C, C24H25N5O;纯度≥98.14%)。上海Genechem有限公司(上海,中国)开发了腺相关病毒转录因子E3 (AAV-TFE3)成分(血清型9,没有荧光报告基因)。热费希尔科学(罗克福德,美利坚合众国)提供了胞质提取试剂和NE-PER™核和BCA工具。 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, United States of America; Cat# 3738, Cat# 15101, Cat# 5832, Cat# 2535, Cat# 2983, and Cat# 5536) supplied the primary antibodies against Beclin1, NLRP3, AMPK, p-AMPK, p-mTOR, and mTOR. Proteintech Cohort (Chicago, IL, United States of America; Cat# 12452-1, Cat# 21327-1, Cat# 22915-1, Cat# 17168-1, and Cat# 10494-1) provided the VPS34, CTSD, CASP1, histone H3, and GAPDH antibodies. Abcam (Cambridge, UK; Cat# ab106393, Cat# ab62344, Cat# ab180799, Cat# ab207323, Cat# ab52761, Cat# ab52636, Cat# ab183830, Cat# ab104224, Cat# ab272608, Cat# ab56416, Cat# ab150077, and Cat# ab150115) provided the goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 647), RIPK1, RIPK3, ASC, IL-18, calcineurin, synaptophysin (SYN), microtubule-associated protein-2 (MAP2), NeuN, TRPML1/MG-2, p62/SQSTM1, and goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488) antibodies. The primary antibody against TFE3 was purchased from Sigma-Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, United States of America; Cat# HPA023881). LC3B was purchased from Novus Biologicals (Littleton, CO, United States of America; Cat# NB600-1384). IL-1β从ABclonal购买技术(Cambridge, MA,美利坚合众国;猫# A1112)。MLKL、GSDMD NLRP1来自亲和力生物科学(哦,美利坚合众国;# AF4013猫# DF7412,猫,猫# DF13187)。圣克鲁斯生物技术(达拉斯,TX,美利坚合众国)提供了辣根过氧化物酶,(合)共轭免疫球蛋白二级抗体。柏妘生物技术(南京,中华人民共和国)提供的异硫氰酸荧光素(FITC)共轭免疫球蛋白二级抗体。此外,Beyotime生物技术(江苏、中华人民共和国)提供了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)解决方案。

2.3。SCI的动物模型

在程序之前,麻醉管理动物通过腹腔内注射1% ( )戊巴比妥钠(50毫克/公斤)。接下来,执行标准椎板切除术在T9-T10椎揭露一个硬脑膜循环。随后,体重下降损伤模型采用触发脊髓挫伤后受伤之前的描述(41]。简而言之,我们放弃了酒吧(10 g在重量和直径1.2毫米)从15毫米到暴露脊髓诱发温和SCI挫伤同时保持硬脑膜完好无损。受伤后,层皮肤、筋膜、肌肉与4 - 0时的针脚缝合关闭。老鼠在虚假的组接受相同的操作如上所述,没有损伤引起的体重下降。手术后,老鼠每天三次人工撒尿。

2.4。腺相关病毒(AAV)载体包装

上海Genechem AAV-TFE3-shRNA公司开发。TFE3-stimulated蛋白激酶的shRNA序列构造,克隆,然后加工成pAV-U6-shRNA-CMV-EGFP质粒,pAV-U6-shRNA (TFE3) -CMV-EGFP。AAV - 293细胞转染产生AAV9-U6-shRNA (TFE3) -CMVEGFP基于AAV代表/帽表达质粒,腺病毒辅助质粒(广告助手),和pAV-U6-shRNA -CMV-EGFP (TFE3)。同样,AAV9-U6-shRNA(争夺)-CMV-EGFP被用作争夺控制权。病毒颗粒纯化使用iodixanol梯度方法。使用定量PCR,我们检测到的滴定度AAV9-U6-shRNA TFE3 -CMV-EGFP和AAV9-U6-shRNA -CMV-EGFP(混乱),也就是说, 和 分别基因组拷贝/毫升。

2.5。药物和AAV载体管理

我们分开114小鼠随机地分成七个组:虚假的( ),SCI ( ),GDF-11 ( ), ( ), 成分控制( ), 成分( ),和 ( )。GDF-11组处理GDF-11 (100 ng /公斤/天)通过SCI(每日腹腔内注射3天后42]。同等体积的生理盐水是虚假的和科学团体。每日腹腔内注射3-methyladenine (3 ma 15毫克/公斤)和dorsomorphin(复合C, 1.5毫克/公斤)执行GDF-11政府3天前30分钟。的 成分控制和 shRNA组收到了100年μl静脉注射的病毒载体在PBS 打包基因组粒子SCI前14天。14天之后, 成分控制和 shRNA组GDF-11集团接受了同样的治疗。通过动物丧生过量戊巴比妥钠,和组织样本获得的相应实验3天、28天的评分。

2.6。功能性行为评估

我们管理的男低音歌手鼠标规模(BMS)测量运动天0,1、3、7、14、21、28 SCI后评估功能恢复(43]。百时美施贵宝分数范围从0到9,0分代表正常的运动机能和9代表整体瘫痪。我们进行了足迹调查在手术后28天。后肢(红色)和鼠标前肢(蓝色)是用各种颜色的染料染色(44]。两个独立的测试人员没有任何知识的实验条件测量结果。

2.7。组织的幻灯片准备他和马森染色

手术后28天,老鼠接受reanaesthetization使用2% ( )戊巴比妥钠,使用生理盐水灌注,并引入4% ( )多聚甲醛在磷酸盐。接下来,我们把整体部分(10毫米长,震中在中心)和固定部分提到的4% ( )多聚甲醛的24 h。接下来,我们开发了各自的纵向石蜡切片后嵌入在石蜡样品。使用切片机,4μm部分被切割和安装到幻灯片涂poly-L-lysine执行他staining-based组织病理学测试后报告描述(45,46]。马森染色,我们雇佣了10%的三氯乙酸和10%的重铬酸钾为媒染剂纵向部分。苏木精染细胞核。接下来,使用乙醇和盐酸,幻灯片是有区别的,和减少氨回到蓝,沾着马森的解决方案。如前所述(执行染色47]。最后,光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)被用来获取图像。

2.8。免疫印迹(WB)分析

小鼠安乐死在第三天SCI,从小鼠脊髓部分(1.5厘米;覆盖损伤中心)解剖和存储在世行前−80°C。部分样本处理提取蛋白质裂解缓冲。其他样本处理提取的细胞质和核与胞质蛋白提取试剂和NE-PER™核。我们使用蛋白质提取试剂净化整体蛋白质从脊髓标本。BCA量化分析被用于蛋白质。我们进行了12% ( )凝胶电泳分离等量的蛋白质(60μg);样本然后转移到聚偏二氟乙烯膜(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,美利坚合众国),被封锁在5% ( )脱脂牛奶和探索以下抗体在一夜之间在4°C: ASC (1: 1000), NLRP1 (1: 1000), NLRP3(1: 1000),地震- (1:1000),il - 1β(1:1000),GSDMD (1: 1000), CASP1 (1: 1000), Beclin1 (1: 1000), SQSTM1 / p62 (1: 1000) LC3B (1: 1000), VPS34 (1: 1000), CTSD (1: 1000), RIPK1 (1: 1000), RIPK3 (1: 1000), MLKL (1: 1000), CASP8 (1: 1000), p-mTOR (1: 1000), mTOR (1: 1000), p-AMPK (1: 1000), AMPK (1: 1000), GAPDH (1: 1000), CaPML1(1: 1000),组蛋白(1:1000),p-AMPK(1: 1000),和AMPK (1: 1: 1000)。细胞膜随后被孵化与HRP-conjugated免疫球蛋白二次抗体在环境温度为2 h。使用ChemiDoc™XRS +成像系统(Bio-Rad)基于一种ECL immune-detection工具,频带信号的可视化和调查。

2.9。免疫荧光染色(如果)

SCI后第三天,脊髓标本解剖老鼠如果染色和收集。我们执行如果染色组织方面根据吻侧脊髓(1毫米长,4毫米从震中)后之前的描述(48]。我们deparaffinized,水化,水洗,然后把部分10.2毫米柠檬酸钠缓冲20分钟在95°C。随后,我们permeabilized部分为0.1% ( )PBS-Triton x - 100(10分钟)。接下来,我们封锁了部分与10% ( )牛血清白蛋白在PBS (1 h)。幻灯片在一夜之间被孵化在4°C抗体Caspase-1 (1: 200) / NeuN (1: 400), GSDMD (1: 150) / NeuN (1: 400), LC3 (1: 200) / NeuN (1: 400), p62 (1: 200) / NeuN (1: 400), RIPK1 (1: 200) / NeuN (1: 400), RIPK3 (1: 200) / NeuN (1: 400), SYN (1: 200) / NeuN(1: 400),和MAP2 (1: 200)。接下来,我们洗的部分在一个环境温度10分钟3次,孵化他们的环境温度1 h和FITC-conjugated二级抗体。最后,我们获取和评估与荧光显微镜图像(奥林巴斯、东京、日本)在六个领域采取随机的方式在三个随机部分属于各自的样本。

2.10。统计分析

我们完成了所有使用SPSS统计调查版本。19日软件(SPSS,芝加哥,IL)和分析过程中采用双盲的方法。值表示为 平均误差(SEM)。控制不必要的变异来源、数据规范化进行研究。方差分析(方差分析)基于最小意义差(LSD)(等于方差假设)事后调查或Dunnett T3(等于方差没有任何假设)方法进行评估的两组之间的差异三个或四个组。我们使用一个独立的样本 - - - - - -测试比较两个独立的团体。的 值小于0.05显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。SCI后GDF-11促进功能恢复

他和马森染色,如果染色,足迹分析,BMS分数用来评估SCI后运动功能。受伤的脊髓病变区域评估他和马森染色,显示胶质疤痕面积显著扩张( )在SCI组与虚假的组。另外,如果染色显示减少MAP2表达式( )和小数量的SYN-positive神经元突触( )在SCI组比虚假的组。GDF-11治疗,动物有更少的胶质疤痕,更大的神经元MAP2表达水平,和神经元的SYN-positive突触数量大于SCI集团没有任何治疗( 对于所有;数据1(一)- - - - - -1 (f))。接下来,足迹调查,GDF-11组优于SCI组的功能恢复受伤(图后28天1 (g))。虚假的集团,百时美施贵宝SCI组得分显著超过1天,3、7、14、21、28程序后( 对于所有)。百时美施贵宝的微不足道的差异报告分数SCI和GDF-11组之间天1和3。GDF-11集团同样取得了更大的BMS分数在7天,14日,21日和28过程与SCI后组( ,< 0.01,< 0.01,< 0.01,分别;图1 (h))。总的来说,提到的结果证实,GDF-11 SCI后促进功能恢复。

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图1
GDF-11促进脊髓损伤后功能恢复。(a)纵向脊髓部分表示组在SCI后28天的基础上分析了马森染色,染色(规模 )。(b)的定量调查Masson-positive损伤脊髓内的各自的团体。(c)照片(×30)脊髓部分各自的组对MAP2沾抗体(规模 )。(d) MAP2光密度在28天内脊髓受到损伤。(e)照片(×150)脊髓部分受到伤害(T11-T12)和彩色28天抗体SYN / NeuN(规模 )。(f) neuron-contacting突触数量相关的定量结果。(g)老鼠脚印的照片在脊髓损伤后28天。(h)低音部鼠标规模(BMS)表示组分数和时间点。数据表示为 , 每组。 与虚假的集团。 和 对SCI组。
3.2。GDF-11变弱Pyroptosis SCI后

地震,il - 1β,NLRP3 NLRP1 Caspase-1 GSDMD, ASC评估脊髓内SCI后评估pyroptotic GDF-11的活动,科学,和虚假的团体。如果染色显示,相比之下,在虚假的集团GSDMD Caspase-1取得显著增加密度在脊髓内神经元病变SCI集团( 两个),而GDF-11 GSDMD和差别显示对这些Caspase-1密度相比,在SCI集团( 两个),如图2(一个)- - - - - -2 (d)。世行分析地震- - il - 1β,NLRP1 NLRP3、Caspase-1, GSDMD和ASC-expressing州(图执行2 (e))。显示的结果,与虚假的集团,SCI集团取得了更高的光密度值(OD)地震而言,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1 ( 所有)和GDF-11提到标记显示减少OD值与科学集团( ,= 0.02 < 0.01,< 0.01 = 0.04 < 0.01,< 0.01,分别;图2 (f))。这些结果表明,GDF-11可以减少pyroptosis-associated标记,表明抑制pyroptosis SCI后。

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脊髓损伤后GDF-11变弱pyroptosis。(a)免疫荧光染色Caspase-1和NeuN colocalization GDF-11的脊髓,SCI和虚假的团体(规模 )。(b)的量化平均光密度Caspase-1脊髓病变的神经元。(c)免疫荧光染色GSDMD和NeuN colocalization GDF-11的脊髓,SCI和虚假的团体(规模 )。(d)的平均光密度定量GSDMD脊髓神经元内病变。(e)免疫印迹分析的地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1三组中的表达水平。凝胶受到相同的试验条件下,与剪裁的屁股了。(f)的光学密度的地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1表达水平被量化和调查各自的组。数据表示为 , 每组。 与虚假的集团。 和 对SCI组。
3.3。GDF-11抑制Necroptosis SCI后

我们检查了necroptosis通过世行和。如果染色显示,相对于虚假的组,RIPK3和RIPK1神经元密度显著增加在SCI的脊髓损伤组( 两个),而GDF-11显示RIPK3密度降低,RIPK1-positive神经元相比,在SCI集团( 两个),如图3(一个)- - - - - -3 (d)。此外,Caspase-8的表达水平,MLKL RIPK3, RIPK1 WB(图进行分析3 (e))。相比那些虚假的集团内,RIPK1, RIPK3,在SCI和MLKL显示更大的OD值组,而Caspase-8较低( 对于所有)。SCI的那一组相比,MLKL的表达水平,RIPK3,和RIPK1 GDF-11组明显下降,而Caspase-8的表达增加( ,< 0.01、< 0.01,= 0.02;图2 (f))。总的来说,这些结果表明,GDF-11 SCI后的恢复效果一方面是由于necroptosis的抑制。

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GDF-11抑制脊髓损伤后necroptosis。(a)免疫荧光染色RIPK1和NeuN colocalization GDF-11的脊髓,SCI和虚假的团体(规模 )。(b)的光密度量化RIPK1脊髓病变的神经元。(c)免疫荧光染色RIPK3和NeuN colocalization脊髓属于GDF-11, SCI和虚假的团体(规模 )。(d)的光密度量化RIPK3脊髓病变的神经元。(e)免疫印迹试验Caspase-8, MLKL, RIPK3,和RIPK1 GDF-11表达水平,科学,和虚假的团体。凝胶受到相同的试验条件下,与剪裁的屁股了。(f)的光学密度Caspase-8、MLKL RIPK3, RIPK1表达水平量化和调查各自的团体。数据表示为 , 每组。 与虚假的集团。 和 对SCI组。
3.4。GDF-11提高SCI后自噬

自噬活动评估脊髓内病变SCI后,我们决定自噬基质蛋白的表达谱(p62) autolysosome-related标记(CTSD), autophagosomal标记(Vps34、Beclin1和LC3II)。如图4(一),如果染色显示p62表达在神经元损伤。根据定量调查,SCI后,p62神经元密度显著增加( );然而,GDF-11集团取得了相对较低的神经元中p62密度与科学集团( ;图4 (b))。如图4 (c)脊髓显示更大的百分比LC3II-positive神经元在SCI组比虚假的组( );与科学组相比,GDF-11治疗调节LC3II-positive神经元( ;图3 (d))。世行执行确定的数量CTSD, VPS34, Beclin1 LC3II, p62(图3 (e))。显示的结果,而在虚假的集团VPS34, Beclin1, LC3II, p62 OD在SCI集团( ,< 0.01,< 0.01,< 0.01,分别),较小的OD值在SCI CTSD集团( )。与科学组相比,GDF-11组显示增加CTSD VPS34 Beclin1, LC3II水平,但减少p62水平( 对于所有;图3 (f))。这些结果总结发生的自噬现象衬底积累SCI后,尽管自噬小体,upregulation autophagolysosomal-related标记。此外,正如上述结果所显示的,GDF-11可能上调自吞噬泡,自噬衬底autophagosome-associated标记和缓解压力,这可能会导致一个完整的改善SCI后自噬流量。

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GDF-11提高脊髓损伤后自噬。(一)免疫荧光染色p62和NeuN colocalization脊髓损伤后脊髓损伤(规模 )。(b)中p62神经元的数量平均光密度相应脊髓病变的组织。(c)基于免疫荧光染色的colocalization NeuN和LC3II在脊髓损伤后脊髓损伤(规模 )。(d)的百分比LC3II-positive神经元在脊髓损伤的神经元各自的团体。CTSD (e)免疫印迹分析,VPS34, Beclin1, LC3II,和p62表达水平的骗局,SCI, GDF-11组。凝胶受到相同的试验条件下,与剪裁的屁股了。(f)的光学密度CTSD、VPS34 Beclin1, LC3II, p62表达水平量化和调查各自的团体。数据表示为 , 每组。 和 与虚假的集团。 对SCI组。
3.5。抑制自噬逆转影响GDF-11 Pyroptosis和Necroptosis SCI后

马3、自噬抑制与GDF-11 coadministered GDF-11是否有利影响评估结果SCI后产生的自噬的激活。神经元colocalization分析,如果显示的upregulation p62密度的差别,对这些LC3II阳性神经元的百分比 组相比,GDF-11组( 两个;数据5(一个)和5 (b))。世行是用来检测CTSD的表达水平,VPS34, Beclin1 LC3II, p62(图5 (c))。与GDF-11组相比,CTSD, VPS34, Beclin1和LC3II组OD值内 集团( ,≤0.01 < 0.01 = 0.01,分别),与大中p62 OD值 集团( ;图5 (d))。因此,马3显著抑制自噬与GDF-11共同服用期间。

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图5
抑制自噬逆转影响GDF-11 pyroptosis和necroptosis脊髓损伤。(一)神经元colocalization和免疫荧光染色p62和LC3II脊髓损伤后脊髓损伤(规模 )。(b) p62量化平均光密度和LC3II-positive神经元的数量在脊髓损伤的神经元各自的团体。(c)为CTSD免疫印迹分析,VPS34, Beclin1 LC3II, p62表达水平在各自的团体。(d)的光学密度CTSD、VPS34 Beclin1, LC3II, p62表达水平量化和调查各自的团体。(e)神经元colocalization和免疫荧光染色Caspase-1 GSDMD每组(脊髓的规模 )。(f) Caspase-1量化平均光密度和GSDMD脊髓病变的神经元。(g)免疫印迹分析的地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1表达水平在各自的团体。(h)的光学密度的地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1表达水平被量化和调查各自的组。(我)神经元colocalization和免疫荧光染色RIPK1和RIPK3每组脊髓(规模 )。(j)量化RIPK1的光密度和RIPK3脊髓病变的神经元。(k)免疫印迹试验Caspase-8, MLKL RIPK3, RIPK1表达水平在各自的团体。(l)的光学密度Caspase-8、MLKL RIPK3, RIPK1表达水平量化和调查各自的团体。数据表示为 , 每组。 和 与GDF-11组。

为深入验证自噬的主要因素允许GDF-11 SCI后促进神经功能恢复,我们钻研3 ma necroptosis和pyroptosis施加的影响。如果分析所示,相比之下,那些在GDF-11集团内GSDMD和Caspase-1神经元的密度超过那些在 集团( 两个;数据5 (e)和5 (f))。pyroptosis-related蛋白质的表达水平(地震、il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1)更高 组比GDF-11组( 对于所有;数据5 (g)和5 (h))。如果还显示,RIPK1 RIPK3神经元密度明显增加 组相比,GDF-11组( 两个;数据5(我)和5 (j))。的OD值necroptosis-related蛋白(MLKL、RIPK3 RIPK1)更高 组比GDF-11组( ),Caspase-8 OD值较低 集团( ;数据5 (k)和5(左))。这些结果表明,共同服用3 ma的GDF-11导致削弱效应的GDF-11 pyroptosis和necroptosis GDF-11因此底层autophagy-enhancing示范效应的机制抑制pyroptosis necroptosis。

3.6。自噬抑制反转GDF-11在SCI的神经保护作用

受伤的脊髓病变区域评估他和马森染色,显示扩大面积胶质疤痕( ,数据6(一)和6 (b)) 组比GDF-11组。另外,如果染色显示减少MAP2州( ,数据6 (c)和6 (d))和少数SYN-positive神经元突触( ,数据6 (e)和6 (f)) 组比GDF-11组。损伤后28天,GDF-11组显示明显恢复后腿行动,协调爬行,虽然 集团继续拖他们的后腿(图6 (g))。一个微不足道的区别是BMS GDF-11之间的分数和报道 组1和3。在 集团BMS分数明显低于GDF-11组SCI后7天,14日,21日和28日( ,< 0.01,< 0.01,< 0.01,分别;图6 (h))。因此,autophagy-improving GDF-11可能占的影响优化结果与GDF-11 SCI后治疗。

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图6
抑制自噬逆转影响GDF-11施加于脊髓损伤后功能恢复。(a)纵向脊髓部分表示组28天的基础上分析了马森染色,染色(规模 )。(b)的定量调查Masson-positive损伤脊髓内的各自的团体。(c)照片(×30)脊髓部分各自的组对MAP2沾抗体(规模 )。(d) MAP2光密度在28天内脊髓受到损伤。(e)照片(×150)脊髓部分损伤后28天(T11-T12)和彩色的抗体SYN / NeuN(规模 )。(f)相关的定量结果neuron-contacting突触的数量。(g)老鼠脚印的照片在脊髓损伤后28天。鼠标(h)低音部规模(BMS)指定的组分数和时间点。数据表示为 , 每组。 和 与GDF-11组。
3.7。GDF-11促进自噬通过上调TFE3活动,随后降低了Pyroptosis Necroptosis SCI后

然后我们探讨TFE3表达式在细胞质和细胞核是否GDF-11 TFE3监管影响。如数据所示7(一)和7 (b)GDF-11治疗后,TFE3神经元中表达明显增加( )。接下来,根据世行的结果,在细胞核内的TFE3 GDF-11组表达明显上升,而TFE3在细胞质中表达下降( 两个;数据7 (c)和7 (d))。深入确认TFE3激活促进自噬的影响和抑制pyroptosis necroptosis通过GDF-11,我们沉默TFE3活动使用TFE3成分和设计了一个试验来比较以下三组:GDF-11, 成分, 成分。结果表明,两种细胞质TFE3表达式和核TFE3表达式TFE3成分组明显低于在集团的争夺中,而一个微不足道的差异报告的核TFE3 GDF-11和表达状态 组( 对于所有;数据7 (e)和7 (f))。这些结果表明,TFE3 shRNA转染抑制TFE3表达式和核易位。

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(右)
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图7
GDF-11增强被上调自噬和抑制pyroptosis necroptosis TFE3活动。(一)免疫荧光检测TFE3脊髓内病变(规模 )。(b)的光密度量化TFE3表达神经元。(c)核TFE3免疫印迹试验和胞质TFE3表达式。光密度(d)量化结果与核TFE3和细胞质TFE3。(e)免疫印迹试验报告核TFE3和细胞质TFE3 GDF-11表达水平, 和 shRNA组。(f)量化结果光学密度与核TFE3和细胞质TFE3。(g)基于免疫荧光染色的colocalization NeuN和LC3II脊髓内病变(规模 )。(h)的百分比LC3II-positive神经元在各自的脊髓损伤组。(i)为CTSD免疫印迹分析,VPS34, Beclin1, LC3II,和p62 GDF-11表达水平, ,和 shRNA组。(j)光学密度CTSD、VPS34 Beclin1, LC3II, p62表达水平量化和调查各自的团体。(k)免疫荧光染色GSDMD和NeuN colocalization脊髓病变(规模 )。(左)量化的平均光密度GSDMD脊髓神经元内病变。地震(m)免疫印迹分析,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1每组中表达水平。(n)的光学密度的地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD ASC, NLRP3 NLRP1表达水平被量化和调查各自的组。(o)免疫荧光染色RIPK1和NeuN colocalization脊髓病变(规模 )。(p)的光密度量化RIPK1脊髓病变的神经元。Caspase-8 (q)免疫印迹分析,MLKL RIPK3, RIPK1表达水平在三组。(r)的光学密度Caspase-8、MLKL RIPK3, RIPK1表达水平量化和调查各自的团体。数据表示为 , 每组。 和 对SCI组。 和 与GDF-11组。 和 与 组。

随后,我们进行研究来确定TFE3核易位引起GDF-11自噬的规定,负责pyroptosis, necroptosis。如果显示一个微不足道的区别在神经元的百分比LC3II GDF-11和阳性 组,而这个比例在 shRNA组明显下降( 两个;数据7 (g)和7 (h))。同样,根据世行结果,p62的表达水平,LC3II, CTSD, VPS34, Beclin1 GDF-11之间没有明显不同 组织和表达水平的VPS34、Beclin1 CTSD, LC3II明显降低 shRNA组比 p62集团,而相反的结果( 对于所有;数据7(我)和7 (j))。TFE3 shRNA治疗pyroptosis-associated标记的表达水平增加(ASC,地震,il - 1β,Caspase-1 GSDMD NLRP3和NLRP1)和necroptosis-related标记(RIPK1, RIPK3 MLKL,相反Caspase-8),如图7 (k)- - - - - -7 (r)( 对于所有)。的 shRNA集团扩大面积胶质瘢痕( ,数据8(一个)和8 (b)),减少MAP2表达式( ,数据8 (c)和8 (d)),和更少的SYN-positive突触( ,数据8 (e)和8 (f))神经元与SCI后GDF-11组。在损伤后28天, shRNA集团还拖他们的后腿(图8 (g))。一个微不足道的差异报告GDF-11 BMS分数, ,和 shRNA组天1和3。在 shRNA集团BMS分数明显低于GDF-11和 组天7、14、21、28 SCI后( ,< 0.01,< 0.01,< 0.01;图8 (h))。在一起,这些结果表明TFE3激活和核易位GDF-11增加自噬的主要机制和抑制pyroptosis necroptosis。

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图8
自噬抑制反转GDF-11在SCI的神经保护作用。(a)纵向脊髓部分表示组28天的基础上分析了马森染色,染色(规模 )。(b)的定量调查Masson-positive损伤脊髓内的各自的团体。(c)照片(×30)脊髓部分各自的组使用一个抗体染色MAP2(规模 )。(d) MAP2光密度在28天内脊髓受到损伤。(e)照片(×150)脊髓部分损伤后28天(T11-T12)和彩色的抗体SYN / NeuN(规模 )。(f)相关的量化结果neuron-contacting突触的数量。(g)老鼠脚印的照片在脊髓损伤后28天。鼠标(h)低音部规模(BMS)分数的表示组和时间点。数据表示为 , 每组。 和 与GDF-11组。 和 与 组。
3.8。通过AMPK-TRPML1-Calcineurin GDF-11激活TFE3 SCI后信号通路

据报道,有一个重要的钙信号通路调节TFE3: AMPK-TRPML1-calcineurin信号级联。我们的研究结果表明,GDF-11增加p-AMPK表达式和TFE3核易位,虽然p-mTOR抑制( 对于所有的人,人物9(一个)和9 (b))。下游信号分子、免疫印迹分析显示表达式TRPML1和钙调磷酸酶显著增加( 同时,数据9(一个)和9 (b))。进一步调查TFE3激活GDF-11治疗后是否被AMPK-TRPML1-calcineurin调制信号通路,我们研究了复合C (CC)的影响,AMPK拦截器,在GDF-11组。这里,p-AMPK表达式和TFE3核易位是低的 组比GDF-11组( 两个),而p-mTOR表达更高的 集团( ,数据9(一个)和9 (b))。同样,TRPML1和钙调磷酸酶的表达水平明显下降( 和 ,分别的数据9(一个)和9 (b))。我们进一步评估AMPK-TRPML1-calcineurin轴是否也参与的机制GDF-11调制pyroptosis, necroptosis和autophagy-related蛋白质。世行的结果表明Caspase-1的表达水平,GSDMD, RIPK1, RIPK3, p62明显较高 组比GDF-11组,而LC3II表达水平显示了相反的模式( ,< 0.03 0.01 = 0.04,=,< 0.01 = 0.01,数字9 (c)和9 (d))。在一起,我们的研究结果证实,GDF-11激活TFE3 AMPK-TRPML1-calcineurin信号级联。

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图9
通过AMPK-TRPML1-calcineurin GDF-11激活TFE3信号通路。(一)免疫印迹试验显示p-mTOR细胞质表达水平,mTOR, p-AMPK, AMPK, TRPML1,磷酸酶,GAPDH作为内部控制规范化;核表达TFE3,标准化的组蛋白H3作为内部控制。(b)的光学密度TRPML1、p-mTOR mTOR, p-AMPK, AMPK,磷酸酶、核TFE3。(c)免疫印迹试验显示Caspase-1的表达水平,GSDMD, RIPK1, RIPK3, p62, LC3II规范化GAPDH作为内部控制。(d)的光学密度Caspase-1、GSDMD RIPK1, RIPK3 p62, LC3II。数据表示为 , 每组。 和 对SCI组。 和 与GDF-11组。

4所示。讨论

明显的脊髓损伤可以导致感觉运动障碍或永久瘫痪(49]。SCI后再生能力下降(神经元死亡)能够扰乱持续四肢和大脑中的信号传输特性,以及阻碍功能恢复(50,51]。因此,必须抑制神经元死亡和促进神经再生,这是能够形成小说继电器电路代替电路破裂。GDF-11中枢神经系统形成的是一个重要的监管机构和命运的一生中(52]。在以前的研究中,GDF-11发挥神经保护和neurorestorative对脑缺血性损伤的影响(39,53]。程序性细胞死亡,包括pyroptosis necroptosis,发现自噬,促进神经赤字(54- - - - - -57]。因此,我们假设GDF-11调节pyroptosis, necroptosis, SCI后自噬。在这项研究中,我们的研究结果表明,GDF-11是由于活动的治疗效果通过AMPK-TRPML1-calcineurin TFE3信号通路,随后进一步增强的自噬和减毒pyroptosis和抑制necroptosis。

Pyroptosis指促炎的程序性细胞死亡形式,是管理过程中激活caspase-1, caspase-4/5/11, GSDMD-regulated信号通路和多种炎症介质的释放,如il - 1β和地震58- - - - - -61年]。通过装配inflammasome-related传感器蛋白(NLRP1, NLRP3、AIM2 pyrin),脚手架蛋白apoptosis-related speck-like蛋白质膜卡(ASC)和促炎的半胱天冬酶(caspase-1和人类-4/5)inflammasomes,半胱天冬酶的autoactivating过程和随后的蛋白水解gasdermin D (GSDMD)乳沟可以提升,从而引发细胞pyroptosis [12]。评估pyroptosis GDF-11活动,我们执行如果染色评估Caspase-1在神经元和GSDMD密度,发现GDF-11密度减少脊髓损伤。根据世行的结果,GDF-11治疗后,IL-1B, il - 1β,GSDMD Caspase-1 NLRP1 NLRP3, ASC表达水平都下降了,因此,示范GDF-11 pyroptosis的有效抑制在鼠标SCI模型。

Necroptosis是由古典necrosomes组成mixed-lineage激酶域蛋白质(MLKL)和receptor-interacting蛋白激酶1/3 (RIPK1/3)通过TNF / TNFR1信号或其他刺激(18]。RIPK1,坏死的上游中介,是先天免疫反应的关键调节器参与炎症和细胞死亡(33]。RIPK3扮演关键的角色MLKL的招聘和磷酸化的遗嘱执行人necroptosis招募Ca2 +和钠+质膜离子通道,形成孔隙,导致细胞破裂(62年]。因此,他们可能是理想的目标降低中枢神经系统的细胞死亡和炎症(63年]。因此,我们假设GDF-11可能抑制necroptosis SCI后。在这项研究中,我们通过展示如果和世行GDF-11 MLKL表达水平降低,RIPK3,和RIPK1, Caspase-8表达增加。因此,我们的研究结果表明,GDF-11可以抑制在SCI necroptosis。

自噬,降解细胞内的主要过程浪费,有一个重要的角色在维持细胞内稳态64年]。SCI后,溶酶体损伤和功能障碍可以发生在细胞的影响,导致自噬流量缺陷,自噬小体的积累,和活跃的细胞死亡,这不利于神经元的生存(65年]。一项研究表明,自噬被击出ATG5基因抑制,进一步证明功能恢复后可通过阻断自噬有限SCI (66年]。这里,从Beclin1增加表达式的结果,VPS34, CTSD, LC3II,和减少通过如果和世行p62表达式,我们发现GDF-11充当的有效激活自噬通过改善自噬流量的状态。

神经元死亡通过pyroptosis或necroptosis监管通过宿主蛋白,诱导不同生物的活动的结果(67年]。自噬,prosurvival机制,发现抑制pyroptosis和necroptosis降解各种蛋白质(如NLRP3, ASC和RIPK1) (35,36,68年]。SCI的先前的研究已经证实自噬的诱导起神经保护作用通过抑制细胞凋亡(69年]。然而,很少有研究调查的影响自噬cosuppression pyroptosis和necroptosis SCI后。在目前的研究中,我们使用3 ma抑制自噬在SCI GDF-11治疗证明GDF-11抑制pyroptosis并通过自噬增强necroptosis。自噬抑制后,pyroptosis-associated necroptosis-associated标记部分调整和功能恢复被抑制在SCI GDF-11治疗。然而,特定的连接和生化机制需要进一步研究。总之,这些结果表明GDF-11抑制pyroptosis和necroptosis通过激活自噬,也发挥了至关重要的作用GDF-11 SCI后的治疗效果。

阐明GDF-11操作系统以及它如何促进自噬在SCI,我们还探讨了上游自噬活动的机制。先前的报道表明,自噬被TFE3监管,这是麻省理工学院的一个成员/ TFE bHLH-LZ转录因子家族的亚科(70年,71年]。因此,在这项研究中,我们调查了组织TFE3和自噬活动之间的关系。从机械的角度来看,在一个正常的生理环境,磷酸化TFE3与14-3-3胞质陪伴形成TFE3-14-3-3复杂;如果细胞接收从环境刺激信号(饥饿、缺氧或毒素),TFE3脱磷酸作用抑制mTOR的活动,使其独立于TFE3-14-3-3复杂(72年]。在我们的研究中,我们发现GDF-11 TFE3表达增加。同时,激活TFE3明显增强的自噬,减毒pyroptosis,抑制necroptosis,提升科学组的功能恢复。综上所述,这些研究结果表明,GDF-11的治疗效果是由推动TFE3核易位。

接下来,我们还调查了GDF-11如何监管TFE3状态。AMPK,能够应对低能量状态和饥饿,可以激活的比率AMP / ATP, Ca2 +激活钙2 +/ calmodulin-dependent激酶(CaMKII),转化生长因子-β活化激酶1 (TAK1) [73年]。AMPK-mTOR通路的激活也可以促进钙的释放2 +通过TRPML1通路,从而激活钙调磷酸酶(74年,75年]。在过去的几年中,据报道,PPP3 / calcineurin-activating过程和细胞内钙增加2 +州可能刺激TFE3脱磷酸作用和易位TFE3 SCI后核(76年,77年]。在这里,我们的研究结果表明,AMPK-TRPML1-calcineurin信号通路在SCI GDF-11治疗后被激活。使用CC,抑制AMPK-TRPML1-calcineurin信号通路可以减少影响GDF-11施加于自噬,pyroptosis, necroptosis。

这项工作也有一些局限性,需要深入分析。具体地说,在以前的研究中,TFE3激活在SCI被发现部分由AMPK-SKP2-CARM1和AMPK-mTOR信号通路(2,68年]。深入调查可以深入研究GDF-11是否还可以通过AMPK-SKP2-CARM1和AMPK-mTOR信号通路在SCI和它们之间的差异。GDF-11的表达逐渐减少随着年龄的增长,和更多的工作应该执行调查不同年龄的患者的复苏是否取决于GDF-11的表达。的最佳剂量和疗程GDF-11需要深入评估改善其治疗价值。

我们也有几个GDF-11进一步研究的前景。之前的研究已经表明TFE3和TFEB有部分共同机制(70年]。因此,我们推测,GDF-11也可能激活自噬通过TFEB SCI后增强但细节需要进一步研究。发现治疗中枢神经系统损伤GDF-11承诺(53,78年]。然而,缺乏相关的临床实验报告GDF-11在中枢神经系统损伤。因此,临床转化的可能性GDF-11 SCI需要进一步的研究。许多其他的机制也可能导致神经元死亡SCI后,如parthanatos。Parthanatos有着密切的关系,描述了神经系统疾病和神经系统疾病和神经系统肿瘤(79年]。GDF-11在parthanatos SCI的影响值得进一步讨论的是一个问题。

总之,我们的研究表明,GDF-11促进核易位激活AMPK-TRPML1-calcineurin TFE3的信号通路,这些增强的自噬。随后,自噬增加减毒pyroptosis和抑制necroptosis。最终的影响GDF-11 SCI后评估促进功能恢复。总之,我们不仅集中在GDF-11对自噬的影响,pyroptosis, necroptosis但还演示了它们之间的连接。我们的研究结果表明,补充GDF-11可能是一种新颖的治疗方法具有广阔的临床潜力SCI患者的治疗。

数据可用性

使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突存在。

作者的贡献

于徐和新利胡写手稿文本。于徐,飞达李Haojie张表示卢,Xingyu Wang和回族王准备收集的数据和样品。Wenfei倪,即将香港,襄阳王分析数据。徐姚李、周Kailiang和回族设计实验。徐Kailiang周和回族修订后的手稿。所有作者进行审核和批准最终的手稿。于徐和新利胡锦涛的贡献同样这项工作。

确认

本研究支持由浙江省中医药科学技术项目(批准号徐2021 zb183回族),中国的自然科学基金(批准号82072192周Kailiang和格兰特没有。李姚82102674),浙江省公益性技术应用研究项目(批准号LGF20H150003 Kailiang周),温州科技局(没有基础。Y20210438 Kailiang周)。