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赵Zhengtao Liu表示,Wenchao王朱海,俊杰钱,帅,不要说,冯张Shengyong阴,林周,耿Lei, Shusen郑洁, ”综合网络分析揭示遗传丙酮酸激酶L / R对肝细胞增殖的影响,肝移植后移植物的生存”,氧化医学和细胞寿命, 卷。2021年, 文章的ID7182914, 31日 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/7182914
综合网络分析揭示遗传丙酮酸激酶L / R对肝细胞增殖的影响,肝移植后移植物的生存
Zhengtao刘
,1,2,3
表示赵,4
Wenchao王,2,3
海朱,2,3,5
俊杰钱,2,3
帅王,2,3
不要说什么,6
冯张,2,3
Shengyong阴,2,3
林周,1,2,3
Lei耿,1
和
Shusen郑1,2,3,7
1肝胆的分工和胰腺手术,外科学系,第一附属医院、医学院、浙江大学,310003年杭州,中国
2NHC合并多器官移植重点实验室、重点实验室的诊断和治疗器官移植、摄像头,第一附属医院、医学院、浙江大学,310003年杭州,中国
3器官移植重点实验室、浙江省第一附属医院、医学院、浙江大学,310003年杭州,中国
4国家重点实验室的诊断和治疗传染病、国家传染病临床研究中心,协同创新中心传染病的诊断和治疗,第一附属医院、浙江大学医学院,310003年杭州,中国
5肝胆管的手术、广西医科大学第一附属医院,530021年中国南宁
6定襄诊所,310 000杭州,中国
7Shulan医院(杭州),310 000杭州,中国
文摘
背景。丙酮酸激酶L / R (PKLR)已经被建议通过调节影响肝细胞的增殖的细胞周期和脂质代谢。然而,它对全球代谢物的影响及其临床意义尚不清楚。的目标是。我们旨在澄清的遗传影响PKLR对肝癌细胞的代谢组学概要及其潜在影响对移植肝移植(LT)。方法。不属预定目标的、有针对性的进行代谢组学分析在人类肝癌细胞与慢病毒载体转染造成PKLR超表达和沉默,分别。然后,我们构建了一个分子网络基于转录组和代谢组学数据的综合分析。我们也评估了生物功能的PKLR全球代谢物在肝移植的病人通过加权关联网络模型。结果。Multiomic分析显示,PKLR扰动影响丙酮酸,柠檬酸,glycerophospholipid代谢通路,脂肪从头合成的关键步骤(黑暗)。我们也证实了磷脂酰胆碱的重要性(PC)和它的导数lyso-PC供应改善肝移植患者的生存。Coexpression分析显示的有利影响PKLR超表达的预后具有重要的意义,减轻移植的花生四烯酸代谢,独立于操作风险因素。结论。这一系统性分析表明PKLR影响肝癌细胞生存能力通过对黑暗的整个过程的影响,最后从糖酵解电脑合成。PKLR也改善了预后LT后,可能通过其对有益glycerophospholipids创世纪的增加的影响。
1。介绍
肝脏作为复杂的中心器官在人体能量代谢网络(1]。脂质和葡萄糖代谢可能全面中断相关影响肝脏中许多生理和病理条件。能量代谢可以调节肝细胞炎症、增殖和凋亡的影响燃料供应和代谢网络已被证明是参与整个的发病率,从简单的脂肪变性到终末期肝脏恶性肿瘤(2]。
丙酮酸激酶(PK)是一种重要的病原反应酶调节糖酵解。PK催化的生化过程由磷酸烯醇丙酮酸磷酸基转移(PEP) ADP,产生ATP和丙酮酸(3]。丙酮酸位于十字路口的能量代谢,并提供原料三羧酸(TCA)循环支持细胞的能源生产。由不同的亚型(PK编码4),其中PKM2在肝脏和PKLR coexpressed (https://www.proteinatlas.org/)。PKLR被证明有广泛联系从脂肪变性肝损伤和炎症的频谱通过调节线粒体功能障碍和随后的肝纤维化甘油三酯积累,基于multiomic数据在系统级别(5,6]。我们还发现PKLR作为一个潜在的肝脏特异性的目标治疗肝细胞癌和非酒精性脂肪肝病(7]。转录组数据进一步显示,PKLR可能影响细胞的生存能力通过调节肝脏线粒体功能(8]。然而,其潜在影响的代谢物网络执行生物功能尚不清楚,值得进一步研究。
肝移植(LT)提供了最后的治疗终末期肝病患者和移植质量预测是一个重要的决定因素的预后具有重要的意义[9,10]。能量代谢有影响肝移植后移植物质量和术后的结果(11),乳酸和丙酮酸减少或增加/丙酮酸比预测更严重的缺血/再灌注损伤肝移植(12,13]。作为一个关键基因参与糖酵解和细胞内线粒体功能的规定(8),我们假设一个潜在PKLR和能量输出之间的联系在肝移植,这可能影响预后具有重要的意义。代谢组学分析移植可能有助于阐明这些影响的物理机制。
先进的高通量组学数据提供了一个新颖的方法揭示生物功能和分子机制参与复杂的表型,基于基因组,蛋白质组,代谢组14,15]。转录组和代谢组学数据的集成可能提供令人信服的证据,允许建设的一个可靠的网络覆盖编码基因的生物过程最终的代谢产物,相互验证(16,17]。组学数据也可以用于构建网络提高效率对特定疾病的诊断或预后预测,通过整合从个别病人临床信息17,18]。加权基因coexpression网络分析(WGCNA)是一个拓扑算法,可用于调查clinical-omics交互在无标度网络和广泛用于表达和代谢组学研究模块化coexpressed代谢物的临床研究[19,20.]。目前的研究旨在应用综合multiomics WGCNA算法调查机制负责基因PKLR对肝功能的影响,以及其潜在的意义而言,贪污的质量和效果具有重要的意义。
我们评估的分子功能PKLR全球代谢物通过集成没有针对性和有针对性的在人类肝癌细胞代谢组和转录组数据——或者underexpressing PKLR。我们也评估在LT贪污PKLR代谢物的影响,基于无标度网络模型。这项研究的结果可能澄清PKLR影响全球肝脏代谢的调控机制及其潜在影响肝移植存活率。
2。材料和方法
2.1。研究设计
提出了一种研究涌流图在图S1。HepG2细胞转染与短发卡RNA(成分)和质粒通过慢病毒粒子的沉默或过表达PKLR,分别。全球和能量代谢产物测定转染细胞。Multiomic分析当时执行的结果结合以前公布的转录组数据对HepG2细胞PKLR扰动(8]。
我们也没有针对性进行代谢组学分析肝移植和应用WGCNA算法结合患者接受肝移植的临床信息。代谢物在积极模块提取途径分析。最后,中心代谢物被定义为重叠微分基质细胞和肝脏的分类PKLR表达式。
2.2。细胞培养和建设PKLR扰动的细胞模型
修改的影响PKLR HepG2细胞表达测定。总之,rpmi - 1640年HepG2细胞培养介质(R8758;Sigma-Aldrich)包括10%胎牛血清(F8687 Sigma-Aldrich)。这些细胞被放置在一个湿润孵化器在37°C公司为5%2。
PKLR HepG2细胞表达水平改变,慢病毒转染的细胞受到后续的代谢组学分析。细胞转染与慢病毒粒子包括一个开放阅读框PKLR克隆或成分,分别根据制造商的指示(RC212337L2V过度(OV)和TL302463V PKLR沉默(SI)的表达式)(美国OriGene)。相应的控制粒子或炒shRNA空向量作为内部参考转染(PS100071V OV (OV-NC), TR30021V SI (SI-NC), OriGene)。shRNA序列用于SI表S1。
2.3。肝移植病例和临床资料
所有患者接受肝移植在1月1日圣2015年,3月1日圣,2019年。收集样本的代谢组学分析从楔形切除术进行移植前常规活检。排除标准:(1)供体/受体 年,(2)活体供肝移植,(3)分裂LT,(4)再移植,(5)multiorgan移植,(6)不可用移植组织,(7)不可用贪污RNA,和(8)损失中尉后的后续研究进行了符合赫尔辛基宣言,和研究机构审查委员会批准的协议是我们的中心。2020 - iit - 1063)。七十九例肝移植病例终于在代谢组学研究中。
供体、受体、同种异体移植物和手术从病历回顾性收集的信息为每个LT。后续访问,以评估病人的生存状态和持续时间/移植具有重要的意义是由专门的管理人员。
早期主要并发症,包括同种异体移植物功能障碍(EAD)和原发性无功能(PNF)虽然也每个收件人术后评估,基于肝脏和凝聚功能测试。更多的细节定义的含铅/ PNF一直在前面描述的(虽然21]。详细的临床资料和随访信息登记情况如表所示1。
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给出了正态分布的数据
,和数据的非正态的分布,提出了中值(差(四分位范围))。缩写:铝青铜:白蛋白;ALT:丙氨酸转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶;体重指数:身体质量指数;CIT:冷缺血时间;D:捐赠;DBD:脑死后捐赠;以便决定:心脏死后捐赠;铅:早期的同种异体移植物功能障碍; F: female; FFP: fresh frozen plasma; FIB: fibrinogen; HBV: hepatitis B virus; LT: liver transplantation; M: male; MELD: model for end-stage liver disease; PCC: prothrombin complex; PNF: primary liver graft nonfunction; R: recipient; RBC: red blood cell; RQ: relative quantity; TB: total bilirubin; WIT: warm ischemia time. |
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2.4。测量的关键基因的表达
细胞或组织解决试剂盒中的试剂(15596026;英杰公司)RNA隔离。随后的RNA样品纯化使用RNeasy迷你包(74104;试剂盒),根据制造商的指示。
目标基因的表达是通过测量定量实时聚合酶链反应(存在)混合使用SYBR绿色大师(1725121;Bio-Rad),综合检测系统(CFX96;Bio-Rad)。引物序列表中列出S2。基因表达是δCt方法相比,像前面描述的那样22),与β肌动蛋白作为内部参考。
2.5。代谢组学分析肝癌细胞和肝组织
不属预定目标的代谢组学分析使用肝癌细胞和肝移植组织进行。分析了代谢分析液相色谱-光谱法(质)通过耦合的超高性能的应用液相色谱(UHPLC)和量化宽松+系统(热费希尔科学、美国)在两个电喷射ionization-positive和ionization-negative离子模式。
HepG2细胞也化验energy-specific针对性的代谢组学分析通过UHPLC质耦合QTRAP系统(美国AB Sciex)基于多反应监测(23]。化验进行基于模块由上海应用蛋白质技术公司,与覆盖31个关键代谢物途径包括糖酵解、柠檬酸、氧化磷酸化。信息包括能量代谢产物是列在表中S3。
2.6。统计比较
非正态的分布数据进行对数转换。通常被描述为分布式数据 由单向方差分析和比较。非正规的分布式数据被描述为/中位数(四分位范围),而使用非参数Mann-Whitney测试。变量之间的关系被使用皮尔逊相关性分析的评估,枪兵,肯德尔系数连续,排名,和协变量顺序,分别。生存分析使用Cox比例风险回归模型。和关键基因之间的相互作用是估算的蛋白质相互作用通过字符串(PPI)网络数据库(24]。
2.7。主成分分析(PCA)
PCA和正交偏least-squares-discriminant分析(OPLS-DA)进行评估代谢组学概要文件由关键特征的歧视使用SIMCA-P软件(版本14.1,Umetrics,瑞典)。
2.8。网络建设进行肝移植
WGCNA已被证明是适合构建生物网络模型基于基因表达和代谢组学数据集(20.]。因此,我们使用这个算法建立PKLR表达之间的联系和全局代谢组的肝移植无标度模型(25]。
LT贪污代谢物第一次被分为不同coexpressed模块,和代谢物系统树图分支被削减生产合并模块基于阈值定义为一定程度的独立为0.8。不同的模块是由不同的颜色表示的热图。
然后我们合并模块之间进行了相关分析和个体样本特征,包括遗传和表型表达。聚类分析是基于合并模块类别100年前选定的代谢物。
代谢物意义(MS)和模块成员(MM)被定义为每个代谢物的相关性与个体特征(特别是PKLR表达式)或模块eigengene,分别。MS和毫米之间的关系的重要性已经开发了一个指标来评估intramodule连接。我们也评估intermodule连接通过相关性分析。重要的模块被选中作进一步的途径和代谢物调查中心。更多细节的应用WGCNA发表之前(代谢组学数据20.]。
2.9。浓缩、路径分析、基于Multiomic数据集和网络建设
基于基因和基因组的京都百科全书(KEGG)数据库集群的潜在代谢物是丰富通过网上途径归罪工具包“MetaboAnalyst”(https://www.metaboanalyst.ca/)[26]。差异表达基因集(度)估算的转录组数据的分析与PKLR HepG2细胞改变在我们之前的研究8]。潜在通路也丰富了基因集富集分析(GSEA)使用“clusterProfiler”包基于重要候选基因检测到RNA-seq [27,28]。联合途径分析被用来组合multiomic差异表达特征数据集在细胞PKLR扰动,和道路地图整合转录组和代谢组学数据可视化使用“Pathview”(https://pathview.uncc.edu/),根据开发人员的指令(29日]。
我们也可视化管理网络和筛查中心使用Cytoscape代谢物(v 3.8.0) [30.]。基于代谢产物和重要的内部相关性( ),网络构建基于目标(细胞)和没有针对性(细胞/肝组织)代谢组学分析使用“cytoHubba”模块,分别。中心代谢物在cytoHubba然后使用适当的筛选算法模块。监管网络也将基于代谢物与之前通路分析的关键特征。
描述性的数据和他们的互动关系可视化使用的热图,条形图、维恩图、火山、泡沫、散点图。对于统计方法,更多的细节在本地网络的可用性和安装工具包,包,和算法用于数据解释表中列出S4。
2.10。High-Glucose治疗,油红O染色,生化试验
细胞模型与PKLR扰动(OV、SI和相应的数控,看到部分2。2)准备在six-well板80%融合和孵化high-glucose介质(50更易与葡萄糖/ L, G7021;Sigma-Aldrich) 48 h。脂肪变性的细胞被化验油红O染色,如前所述[31日]。脂肪变性的严重性评估定量之间的比率的脂滴和肝细胞在相同的微观领域。同时,细胞甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)测定,分别根据商业套件提供的指令(E1013, E1015 Applygen)。所有的实验都重复在一式三份。
3所示。结果
3.1。建立细胞模型改变PKLR表达式
细胞模型是由与慢病毒转染粒子生成稳定PKLR表达的变化。与数控样品相比,转染与开放阅读框粒子导致增加PKLP约为4.7倍,而转染shRNA引起了PKLR mRNA表达(下降大约70% ,图S2)。
3.2。肝移植患者的临床特征
肝移植病例中描述表1。简而言之,大部分手术都表现在老年成年人(年龄< 60岁)。年迈的接受者和捐助者占整个群体的7.6%和13.9%。平均随访时间为10个月(308天)。大多数人(79%)和14%的捐助者是肝炎B-positive。
3.3。没有针对性在肝癌细胞代谢组学分析
整个代谢物轮廓HepG2细胞被不属预定目标的代谢组分析化验。如图1,PCA OPLS-DA情节透露,代谢组学概要文件可以基于PKLR表达式(数据清楚地分开1(一)和1 (c))。这是验证通过排列分析( 机汇集团 圣莱科特的人物1 (b)和1 (d))。调整后的质量控制(QC)样本,960年和954年代谢物从人类代谢组匹配数据库(HMDB)在OV和SI组,分别。
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的差别,/对这些PKLR对代谢组学的角度没有显著的影响( ,图1 (e))。规范化的数量确定微分代谢物在OV和SI组和他们的十字路口聚集和在热图(数字1 (j)- - - - - -1(左))。总的来说,潜在的细胞内代谢物的变化改变了PKLR表达不同于那些在数控样本。我们还演示了(褶皱变化/意义值)为每个代谢物在火山的阴谋。值得注意的是,著名的海拔( , )观察在更少的细胞内代谢物(差别PKLR对这些16和72代谢物之间增加和减少的水平,图吗1 (n))。进一步相关分析发现,大约一半的前20名代谢物之间的积极联系了( ,51.6%、48.9%和50% OV,如果,和重叠组件,分别数据1 (o)- - - - - -1(问))。
当分类根据KEGG数据库,维恩图发现12个代谢物重叠的关键分子OV和SI组(图1 (f)、表S5)。路径分析表明之间的重叠代谢物OV和SI组参与glycerophospholipid新陈代谢( ,影响 ,数据1 (g)和1 (h)),有5个代谢物与PKLR一致/反方向变化(图1(右))。
3.4。针对HepG2细胞能量代谢的代谢组学分析
有针对性的代谢组学分析的分子参与能量代谢(表S3)是使用一套由上海应用蛋白质技术公司开发的。如图2,主成分分析表明,样品可以清楚地分开PKLR表达式OPLS-DA模型(数据显示2(一个)和2 (c))和主成分分析结果的意义被置换验证测试( 机汇集团 圣莱科特的人物2 (b)和2 (d))。
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提出了所有入学代谢物在集群的热图(数字2 (e)- - - - - -2 (g))。有显著负相关在OV和SI组的代谢变化对整个代谢物概要文件( ,图2(左))。相关的热图显示百分比的积极的链接( )只有22.1%的代谢物(图2 (h))。
六个分子(延胡索酸酯、alpha-ketoglutarate AMP、PEP L-malic酸、丙酮酸)显示肝细胞的重要协会PKLR表达式。候选人的FCs组件呈现在图2 (p)。积极联系中观察到84%的候选人代谢物之间的链接。AMP与其他五个组件呈负相关(图2(我))。
我们进行浓缩候选人代谢物(图的分析2 (j)),表明,柠檬酸循环和丙酮酸代谢是最涉及候选人代谢物途径( ,图2 (n)、表S6)。丙酮酸和PEP重叠在柠檬酸循环,丙酮酸代谢和糖酵解途径(图2(问))。进一步评估的动态综合指数的能量代谢产物显示显著增加丙酮酸/ PEP和细胞内ATP / ADP比率PKLR upregulation ( ,数据2(米)和2 (n))。
3.5。转录组数据和综合途径分析基于Multiomic PKLR表达数据集分类
基于从RNA-seq度数据,GSEA确认10和15 KEGG通路显著相关PKLR表达式,分别为( )。PKLR改变后,有关代谢通路,甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢,过氧物酶体proliferator-activated受体信号中的butanoate和刺激神经组织的交互显示重叠的候选人有一致的趋势在OV和SI组(表S7,数据S3和S4,图3)。
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分子途径估算和可视化使用在线工具(MetaboAnalyst和Pathview) [29日,32),基于微分的集成相关代谢物和基因PKLR HepG2细胞组学数据的变化。
通路归罪最初是由综合评价集群显著代谢物组学数据和基因OV和SI组,分别通过在线工具包MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/;表S8-S11),估算通路被依法合并数据集从OV和SI组(表S12和向)。对不属预定目标的代谢组学数据,glycerophospholipid和亚油酸的新陈代谢是重要的途径包括代谢物在OV和SI组。值得注意的是,C00157 (glycerophospholipid)作为一个重叠的潜在代谢物参与选择途径基于数据从OV和SI组(数字3(一个)- - - - - -3 (d)、表S12)。
同样,PKLR表达显著相关的五个途径,包括糖酵解,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,精氨酸生物合成,和butanoate新陈代谢,将候选人代谢物被multiomic分析OV和SI组有针对性的代谢组学数据(数据3 (e)- - - - - -3 (n)、表向)。
所有参与糖酵解代谢产物和丙酮酸代谢包括柠檬酸的过程。有趣的是,AMP,唯一相反的方向影响的分子代谢物,并没有参与任何集成的途径。进一步聚类分析表明,支持代谢物精氨酸生物合成不同的化合物参与三羧酸循环、糖酵解,和丙酮酸代谢,而alpha-ketoglutarate扮演着重要的角色,连接这两种不同途径集群(图3 (o))。最后,选择的途径是使用Pathview可视化(https://pathview.uncc.edu/)。细节的关键路径图所示3。
3.6。代谢组学在LT验证移植
PKLR的遗传影响肝移植的临床和代谢组配置文件在图所示4。围手术期的特征,包括失血/输血、手术持续时间、凝固/肝功能指标,显示关闭相互联系( ,图4(一))。详细的遗传和临床指标之间的相关性呈现在图S5。有弱关联PKLR PKM,作为另一个PK-encoding基因在肝脏( ,图4 (b))。生存分析还表明,PKLR(但不是11)负面影响预后具有重要的意义(HR PKLR: 0.39(95%置信区间:0.22—-0.71), ;人力资源PKM: 1.05(95%置信区间:0.59—-1.86), ;数据4 (c)和4 (d)),PKLR与含铅的发生负相关(51%比75%高与低PKLR表情,人物4 (e))。
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更高的风险比率(小时)PKLR表达式的患者和移植物的生存具有重要的意义(p / g)是0.37(95%可信区间(CI): 0.24 - -0.64)和0.49(95%置信区间:0.32—-0.81),分别,而较高的风险降低了患者的移植(PS / GS PKLR表达式 / 0.49、表S14系列)。移植的进一步代谢组学分析分类的中位数PKLR表达式。使用OPLS-DA PCA模型显示清楚分离跨组与高和低PKLR表达式(图4 (g))。
中发现的2513种代谢物HMDB id、45微分代谢物(14调节和表达下调31日)有重要关联PKLR表达式在火山图( ,图4(我))。潜在的代谢物似乎分散和独立的组间关联较少(21.5%的顶级重要的代谢产物,积极联系数据4 (h)和4 (j))。根据KEGG身份,PC (C00157)和2-lysolecithin (C04230)明显重叠的组件在细胞和肝移植(图据PKLR表达式4 (k))。高PKLR(但不是11)表达与C04230降低,增加C00157(图4(左), )。这些趋势被证实在散点图( ,数据4(米)- - - - - -4 (p))。
3.7。加权代谢物Coexpression网络分析的LT移植
我们构建了一个网络模型的代谢物WGCNA LT移植的,作为一个无标度模型。七个模块检测到基于预定义的截止值为0.8(图5(一个))。连接在eigengenes被聚类分析检查。棕色,绿色,黑色,蓝色模块有区别,但显示与相对较高的相互作用密切相关指数( ,图5 (c))。
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我们也评估代谢物模块之间的关系和临床指标(图5 (b))。棕色、黑色和蓝色模块明显与血液相关产品输血和随后发生的筒子,增加代谢产物在绿松石模块指示输血的血液制品和更严重的铅。值得注意的是,有一个逆相关性PKLR表达和筒子,发生在绿色模块,这是独立的输血的血液制品。散点图显示模块成员之间显著的相关性和代谢物意义基于所有登记分子在绿色,棕色,绿松石模块( ,分别为0.34和0.43, )。进一步的分析还表明,代谢产物包括绿色模块丰富的花生四烯酸(ARA)代谢途径(数字5 (e)和5 (f))。
3.8。筛选中心代谢物与PKLR表达式
进一步网络潜在的候选人与微分表达细胞代谢物和移植组织根据PKLR变化是可视化使用Cytoscape软件(30.]。
对不属预定目标的代谢组学数据,2216明显coexpressed积极代谢物之间的联系在OV和SI组肝细胞被估算相关测试( ,表S15)。coexpression网络使用前20名的跨国公司算法构造节点,包括C00157和C04230(图5 (j))。我们还构建了一个coexpression网络使用MCC算法基于顶部代谢物在肝移植(表139年积极的联系S16)。与细胞的数据一致,C00157和C04230验证的关键角色在组织。
有一个逆相关性C00157和C04230肝细胞和肝组织。此外,我们还创建了代谢物coexpression模型集中在C00157和C04230重叠的分子细胞和肝组织(数字5 (k)和5(m))。大约34%的代谢物变化的相关C00157 C04230,同时(表肌力),这些在代谢物cocorrelations更常见(80%)从移植移植(表S18)。
3.9。细胞脂肪生成与PKLR表达式
不同PKLR HepG2细胞表达水平在high-glucose中孵化。和high-glucose水平导致强烈的脂肪变性和更高的细胞细胞内TG, TC水平overexpressing PKLR ( ,图6)。同样,减少脂肪堆积,降低TG, TC水平也提出了与抑制PKLR细胞( )。
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从代谢组和转录组数据结合的结果,我们估算和描述的潜在作用PKLR DNL的过程。
与意义同时,关键基因转录组数据DNL过程也验证与PKLR中存在扰动的测试。进一步PPI网络分析还显示PKLR之间的紧密联系和大多数选择基因在黑暗与过程(图6)。
4所示。讨论
4.1。在HepG2细胞组学研究
我们之前发现PKLR表达式之间的正相关和HepG2细胞生存能力(8];然而,代谢物的作用在这个连接还不清楚,值得进一步研究。在目前的研究中,我们系统评估的生物功能和临床意义PKLR转录组和代谢组学分析相结合的肝细胞和组织。
Glycerophospholipid和亚油酸的新陈代谢被当成通路影响PKLR表达肝细胞根据全球转录组和代谢组分析。glycerophospholipid分子(C00157)也与PKLR表达呈正相关。目标能量代谢的研究还发现,微分代谢物在柠檬酸和丙酮酸代谢途径丰富。减少反应是观察与过表达PKLR候选人在细胞代谢途径。综合RNA-seq和代谢组学数据的分析也表明,PKLR机制可以扩展到包括糖酵解,精氨酸生物合成,和butanoate代谢通路,而alpha-ketoglutarate施加一个关键作用在调节coexpression网络与PKLR调制通过候选人能量代谢产物有关。
4.2。肝移植和肝细胞系的结果
关于肝移植,供体PKLR表达式有保护作用的预后具有重要的意义,并降低发病率的筒子,移植失败,病人死亡。进一步网络分析WGCNA发现贪污PKLR表达的影响是独立于手术因素的影响,如输血的血液制品在代谢组学的角度。代谢物在PKLR-related模块(绿色)被浓缩在ARA新陈代谢,和PC (C00157)和2-lysolecithin (C04230)提出了枢纽相关代谢物PKLR表达肝细胞和肝组织。
4.3。PKLR Glycerophospholipid和亚油酸代谢的影响
我们之前发现肝细胞中细胞生长加快overexpressing PKLR [8]。电脑是生物膜的重要组成部分33),需要和电脑合成细胞增殖和分化34]。作为PC的autotaxin,增加lyso-PC也影响细胞周期的进程35]。我们结合相应的转录组和代谢组学分析表明积极PKLR对细胞生长的影响可能是由于其upregulation glycerophospholipid代谢,特别是通过增加个人电脑(C00157)及其deacylated导数2-lyso-PC (C04230)。PKLR函数的广泛研究表明PKLR之间的因果关系和加速细胞生长可能涉及生成所需的脂质细胞膜的创建。
4.4。通过有针对性的代谢组学分析PKLR对能量代谢的影响
鉴于PKLR的至关重要的作用在调节能量代谢、细胞改变了我们进行有针对性的代谢组学分析PKLR表达式。不出所料,PK被激活的细胞中丙酮酸/ PEP比率增加overexpressing PKLR [36]。同时,更高的ATP / ADP比率表明改善有氧线粒体功能和在细胞氧化磷酸化调节PKLR [37]。增强合成代谢和合成代谢通量似乎主要受PKLR细胞特性。三羧酸循环和丙酮酸代谢途径确认为最有可能的途径受到PKLR表达式在肝癌细胞的影响。作为糖酵解催化底物通过PK, PEP和丙酮酸都是参与PKLR相关的潜在途径。有趣的是,网络分析表明alpha-ketoglutarate充当中心集群中的代谢物的潜在候选人coexpressed PKLR。谷氨酸和谷氨酰胺的先驱38),alpha-ketoglutarate是一个关键分子确定规范柠檬酸循环的速率(39]。PKLR可能因此决定细胞命运通过调节代谢燃料供应的生产集中在alpha-ketoglutarate。
4.5。好责难他人的PKLR对细胞代谢的影响机制
代谢组和转录组分析的结果可以与脂肪从头合成(黑暗),和PKLR可能参与肝细胞激活DNL的过程。黑暗代表碳水化合物的过程涉及转换循环形成的脂质在肝脏40]。目前肝细胞脂肪生成的化验结果证实PKLR可能参与DNL high-glucose-induced氧化应激(图下激活6)。
同时,PC的一代,作为主要细胞膜组件和黑暗的最终产品,提供了进一步的基质细胞生长和增殖。黑暗的效率取决于柠檬酸循环(41,42]。我们之前发现PKLR coexpressed与脂肪酸合成酶(FASN) DNL的关键基因在肝脏7),和当前综合multiomic分析证实,PKLR本身也参与了黑暗。这个猜测也进一步证实了脂肪生成的化验(图6)。PKLR施加积极影响,移植PC的疲惫的合成中间体在线粒体三羧酸循环的消费。的潜在影响PKLR DNL机制如图6 (f)。
4.6。WGCNA LT的移植
我们构建了一个网络模型PKLR对移植物的影响在LT情况下代谢和生存。PKLR显示保护作用的结果具有重要的意义。临床上,术中出血和输血的血液制品在移植物的生存有着重要的影响。Coexpression网络分析也显示,功能模块(绿色)PKLR是有别于模块操作风险特征。基于代谢组学的角度来看,我们的数据表明,PKLR可能有独立影响预后具有重要的意义,无论手术风险协变量。
路径分析表明,代谢物在PKLR-related模块被浓缩在ARA新陈代谢,与分子包括前列腺素G2被激活在移植overexpressing PKLR。膜磷脂作为一种多不饱和脂肪酸的组成部分,ARA扮演至关重要的角色作为基质细胞生存,发展,和扩散43,44]。ARA通过复杂的监管也可能缓解炎症反应相关细胞因子(45),和激活PKLR ARA新陈代谢表明抗炎作用的肝脏,作为一个更复杂的系统。
有趣的是,PKLR表达式重叠与PC (C00157)方向一致,表明PKLR提升PC细胞和移植组织的内容。然而,网络集中在重叠代谢物(C00157和C04230)之间的不同细胞和肝移植。综合电脑对移植肾功能的影响已经总结了之前(46]。目前的结果表明,PKLR可能提高移植术后生存质量和积极调节电脑,是细胞膜的主要成分。还需要进一步的研究来阐明PKLR表达式之间的互联,肝脏炎症和细胞生存。
4.7。PKM和PKLR基因功能
PK是四个同功酶与不同的器官特异性和由不同的基因编码(11 / PKLR),与肝脏表达基因(3]。最近的一项研究回顾了PKM的多方面的功能基因在支持细胞生长和致癌作用,也指出其特异性的发生在人体(47]。相比之下,我们以前可能表明,PKLR肝脏特异性疾病治疗的目标,PKLR抑制可能有更多的优点和更少的并发症治疗肝癌(7]。当前的研究表明PKLR可能发挥其独特的对肝脏代谢组独立于PKM2的影响。然而,还需要进一步的研究来探讨不同的PK同功酶的性质。
4.8。这项研究在临床应用方面的力量
目前的研究有几个优势。首先,机械的通路PKLR来自基于转录组和代谢组学数据的综合分析,从而提供共同确认的结果。第二,目标的结果,不属预定目标的代谢组学数据的功能概述PKLR DNL的过程,从碳水化合物利用(TCA)电脑组成。第三,肝细胞和肝组织的代谢组学数据证实潜在的代谢产物通过交叉验证在不同的可靠性水平。最后,网络模型构造了综合调整手术指标澄清后的内在基因功能人工干预。
4.9。潜在的局限性和未来的发展方向
本研究的一些潜在的局限性也应该指出。首先,作为一个基于整个分子资料综合分析,multiomic数据识别最重要的候选路径;然而,功能实验需要验证分子间连接的详细信息。第二,WGCNA不能用于集成从肝细胞株组学数据相对较少的样本和表型性状。第三,一些像孟德尔随机化算法(MR)可能有用的说明因果关系在转录组和蛋白质组数据PKLR扰动(48- - - - - -50]。然而,蛋白质组学数据的缺乏限制了进一步使用先生在澄清这些伤亡。第四,PKLR的基因功能不能在移植后植入道德原因,并进一步在活的有机体内分析使用肝移植模型(例如,在大鼠或小鼠)可能有助于阐明潜在的机制。当前研究的结果显示,PKLR可能影响肝癌细胞增殖通过其对脂肪生成的影响,但进一步在体外和在活的有机体内实验是需要澄清的监管机制PKLR上述途径。否则,转录翻译是复杂的,N4-acetylcytidine的角色(ac4C)作为一种重要的信使rna调节器PKLR遗传效应的发挥也值得进一步调查(51]。
4.10。结论
总之,这个综合综合转录组和代谢组学研究表明,PKLR可能促进细胞生长和增殖的调节黑暗。PC和lyso-PC发挥着核心作用通路中的关键调解人PKLR影响肝癌细胞和肝移植。PKLR可能通过激活从而促进移植物存活率ARA代谢和缓解炎症。与之相反,PKLR可能促进肿瘤细胞生长的发展但也可能改善移植后的生存中尉的影响改变PKLR表情肝癌细胞的代谢组学概要文件和移植表明在特定的场景中需要评估其功能。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
建立了研究方案根据赫尔辛基宣言的伦理准则和人类伦理委员会批准的第一附属医院,浙江大学医学院。
同意
书面知情同意了从个人或监护人的参与者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
ZTL SSZ构思和设计研究;WCW JJQ, SW执行实验,提取信息;ZTL JSZ,赫兹,SPQ分析数据;ZTL SPQ写手稿;FZ、SYY LZ, LG, SSZ对稿件;SSZ提供资金支持。所有的作者批准提交的手稿的最终版本。Zhengtao Liu表示赵、王Wenchao和海朱的贡献同样这项工作。所有作者都批准发布。
确认
支持这项研究的国家自然科学基金委创新研究群体项目的中国(81721091)、中国国家自然科学基金重大项目(91542205)、国家科技重大项目(2017 zx10203205),中国国家自然科学基金(81902813),浙江国际科技合作项目(2016 c04003),浙江省自然科学基金(LY18H030002),授予浙江医学会(2019 zyc-a81),国际青年交流项目由中国科学技术协会(2019年),专业肝病研究基金会(TQGB20200114),医疗卫生科技项目的卫生委员会浙江省(2021 ky145),和开放的重点实验室基金High-Incidence-Tumor预防和治疗(广西医科大学)属于教育部。
补充材料
表S1: shRNA PKLR SI的序列。表S2:对目标基因的引物序列。表S3:注册信息能量代谢的代谢产物。表S4:用于数据可视化工具包。表S5:重叠代谢物的细节在OV和SI组不属预定目标的代谢组学在肝细胞中。表S6:投机途径基于丰富能量代谢产物与PKLR相关变化。表S7: KEGG通路富集差异基因从HepG2细胞由GSEA PKLR扰动。表S8:投机通路在肝细胞中PKLR转录组和不属预定目标的代谢组数据的综合分析。表S9:投机通路在肝细胞表达下调PKLR转录组和不属预定目标的代谢组数据的综合分析。表S10:投机通路在肝细胞中PKLR转录组和有针对性的代谢组学数据的综合分析。 Table S11: speculative pathways in hepatocytes with downregulated PKLR by integrative analysis of transcriptomic and targeted metabolomic data. Table S12: potential pathways overlapped between transcriptomics and nontargeted metabolomic data in the OV and SI groups. Table S13: potential pathways overlapped between transcriptomics and targeted metabolomic data in the OV and SI groups. Table S14: impact of graft PKM and PKLR expression on posttransplant prognosis. Table S15: positive coexpressed links in hepatocytes with PKLR perturbation. Table S16: positive coexpressed links in grafts for liver transplantation. Table S17: coexpressed links centered by C00157 and C04230 in hepatocytes categorized by PKLR perturbation. Table S18: coexpressed links centered by C00157 and C04230 in grafts categorized by PKLR expression. Figure S1: flow diagram of study design. Figure S2: construction of hepatocytes with PKLR perturbation. Figure S3: KEGG pathway enrichment on differential genes from HepG2 cells with overexpressed PKLR by GSEA. Figure S4: KEGG pathway enrichment on differential genes from HepG2 cells with suppressed PKLR by GSEA. Figure S5: correlation analysis for interconnection in matrix with inclusion of PKLR/PKM gene and all enrolled clinical indicators.(补充材料)
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