文摘

罗莎damascena机(大马士革玫瑰),属于蔷薇科的家庭,以药用目的的传统医学体系。然而,其抗癌活性尚未研究。在此,我们旨在调查的细胞毒性效应r . damascena己烷(RA-HE)和methanolic (RA-ME)提取物对人体乳房(MCF-7),肺上皮(a - 549),子宫颈癌细胞(海拉)。RA-HE和RA-ME显示对海拉细胞细胞毒性效应和更有效819.6和198.4的μ分别g / ml。此外,细胞毒性的浓度最有效的提取(RA-ME)被用来评估细胞毒性的机制参与海拉细胞。浓度诱导的脂质过氧化反应和还原谷胱甘肽(GSH)的海拉细胞治疗250 - 1000μ克/毫升RA-ME证实氧化应激的协会。我们还发现一个值得注意的增加活性氧(ROS)生产和线粒体膜电位的下降(MMP)水平RA-ME-exposed海拉细胞。仪数据流之间的细胞周期分析显示强大的剂量反应关系subG1阶段海拉细胞和RA-ME治疗。同样,增加浓度和膜联蛋白V化验记录海拉细胞凋亡晚期。总之,我们的研究表明,RA-ME-induced细胞毒性和细胞凋亡在海拉细胞被氧化应激介导的。

1。介绍

全球癌症死亡的第二大原因,是全球主要的健康问题,因为不受控制的细胞生长(1]。癌症阐述控制正常细胞的增长引发的基因变化和可变性,后续生产的恶性细胞,最初的发展二级恶性增生(2]。这些基因的变化可能是由于接触杀虫剂,吸烟致癌化学物质的吸收,或改变免疫系统和激素平衡3]。癌症通常是发现在一个高级阶段,穷人诊断和治疗主要是失败的(4]。早期检测的不足和缺乏有效的治疗药物的最重要的原因是贫穷的癌症控制和诊断(5]。癌症的治疗包括化疗、手术和/或辐射。各种化疗药物常被发现更有效,与严重的副作用,如损害正常细胞(6]。因此,寻找替代治疗有效的代理需要用更少的副作用。后在全球范围内,乳腺癌和结肠癌、宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤(7]。宫颈癌是女性最常见的癌症之一,生活在低收入国家(8]。尽管发病率和死亡率已经下降在过去的几十年,但由于人口老龄化,新发病例和死亡的人数增加了0.5% /年(9]。由于人口老化,估计新病例的数量预计将增加2025,如果事件在2002年保持不变(10]。进一步,为了广泛的报告这严重的健康问题,初步识别和医学与临床疗效是必需的。自然产物研究领域已成为最有趣的科目之一小说发展的治疗药物(11]。植物在旧系统中扮演主要角色的补救特别细长的历史在治疗癌症的疾病(12]。植物提取物等cotinus coggygria(13),马兜铃摔跤(14),Tabernaemontana叉开(15),而青蒿(16)已报告对海拉细胞具有细胞毒性作用。早期的研究表明,细胞毒性植物化学物质能够诱导细胞凋亡/坏死妨碍不同的信号通路,从而导致细胞周期阻滞和细胞死亡17]。癌细胞有几个分子机制来改善和抑制细胞凋亡,在癌症的发展中扮演重要角色18]。因此,诱导细胞凋亡/坏死细胞毒性剂可以是一个基本的有益方法对癌症化疗(19]。罗莎damascena机L(大马士革玫瑰),称为Gole穆哈马迪,是最重要的一种蔷薇科的家庭。r . damascena观赏植物,主要是培养使用在食品行业和香水20.]。除了这些以外,这种植物也被用于药用目的在传统医学系统[21]。一些产品和独立选民从种子、花和花瓣r . damascena研究了在不同在活的有机体内和在体外模型系统(22]。的有利影响r . damascena提取管理建立了月经出血和消化问题[23,咳嗽24],温和的泻药[25],止痛剂[26),大脑功能(27),和心血管功能28]。抗氧化剂(29日),抗菌30.),抗艾滋病毒(31日,抗糖尿病的32),耐水(33),和抗炎34)的活动r . damascena也被记录。很少有报道显示,r . damascena提取和油诱导细胞毒性效应对各种癌症细胞系(35- - - - - -38]。在另一项研究中,细胞毒性的嫩叶和花提取物的潜力Crataegus microphylla蔷薇科的植物家族对海拉细胞也被报道(39]。但是一直只有有限的调查对细胞毒性的影响r . damascena;然而,详细的机械的研究尚未进行。因此,本研究调查引起的细胞毒性的机制(s)r . damascena对三种不同癌细胞系。,human breast (MCF-7), human lung epithelial (A-549), and human cervical (HeLa). In this study, firstly, we screened the cytotoxicity of hexane (RA-HE) and methanolic (RA-ME) extracts ofr . damascena使用MTT测定、中性红吸收试验和形态学变化。其次,最有效的提取的细胞毒性浓度是用来评估机制参与肿瘤细胞的细胞毒性敏感,海拉。

2。材料和方法

2.1。化学品和培养基

细胞培养基(DMEM)高葡萄糖,碳酸氢钠,麻省理工,中性红,罗丹明(Rh123),和2 ,7 - - - - - -dichlorofluorescin (DCF-DA)染料从西格玛奥德里奇采购,美国。胎牛血清(的边后卫)antibiotic-antimycotic (100 x的解决方案)(猫。15240 - 062号Gibco)和胰蛋白酶从Gibco采购,生活技术,美国。流仪套件从后方Coulter购买,美国。其他指定的化学药品和试剂从西格玛奥德里奇,美国,除非另有指示。

2.2。细胞培养

人类乳房腺癌(MCF-7),人类肺上皮(a - 549),和人类宫颈癌(海拉)细胞系来自美国类型文化集合(写明ATCC),美国。细胞系的生长在DMEM和10%的边后卫和1%的抗生素的解决方案。细胞系都保持在25厘米²烧瓶在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。

2.3。工厂收集和提取

新鲜的r . damascena花儿从玫瑰农场,塔伊夫,沙特阿拉伯。玫瑰被切成小块,风干在25°C,树荫下,转换成粉末。提取是由浸渍。简单地说,10 g的粉r . damascena分别提取了己烷和甲醇。然后,滤液收集过滤和干燥的烧杯40°C在旋转蒸发器。提取物分别获得,干己烷提取被任命为RA-HE和methanolic RA-ME提取。提取都储存在4°C到进一步使用。提取物稀释在二甲亚砜(DMSO)生物。最后DMSO浓度用于化验是0.02%。

2.4。细胞毒性实验

的在体外细胞毒性的RA-HE和RA-ME MCF-7, - 549, MTT比色和海拉细胞,中性红,和细胞形态学分析(40]。

2.5。MTT试验

简单地说,细胞被播种到96孔培养板 每个细胞。细胞暴露于不同浓度(0 - 1000μg / ml) RA-HE RA-ME。盘子放在一个湿润5%有限公司₂24小时的孵化器。然后,麻省理工的解决方案(10μl 5毫克/毫升MTT股票)添加到每个和孵化4 h。形成的彩色水晶甲瓒是溶解在二甲亚砜。最后,吸光度测量在550 nm使用标(40]。

2.6。NRU化验

协议后(40),NRU化验。简而言之,所有的细胞都是镀在96孔板的密度10000细胞/。然后,细胞暴露于不同浓度(0 - 1000μg / ml) RA-HE和RA-ME 24 h。细胞培养3 h与50中补充μ克/毫升的NR染料。孵化后,盘子都洗和染料在乙醇提取:乙酸:水(50:1:49)。最后,吸光度测量使用标在550海里。所有的分析都是在为每个RA-HE和RA-ME浓度复制。三个复制检查在每个实验。细胞生存能力的百分比计算如下:

2.7。形态学分析

分析引起的细胞形态学RA-HE RA-ME MCF-7, a - 549,和海拉细胞 细胞被播种到96孔培养板。经过24小时的曝光,改变细胞形态观察20 x放大使用光学显微镜(奥林巴斯、CKX41、日本)。

2.8。法律流程外包和谷胱甘肽氧化压力测量

衡量法律流程外包和谷胱甘肽含量、海拉细胞被镀在6-well板块 在每一个细胞。然后细胞暴露于250年,500年和1000年μ克/毫升RA-ME 24 h。治疗后,控制和治疗细胞收获和洛瑞用和总蛋白测定et al。41]。法律流程外包内容在海拉细胞被TBARS测量(硫代巴比土acid-reactive物质)方法(42称,谷胱甘肽含量测定的方法钱德拉et al。43]。

2.9。活性氧(ROS)测量

海拉细胞的细胞内ROS水平是由DCF-DA荧光染料在前面描述的方法(44]。简单地说,海拉细胞被播种到24-well板的密度 细胞/在完全培养基。然后,细胞暴露于250 - 1000年μ克/毫升RA-ME 24 h。之后,细胞被冲洗与PBS然后孵化20μM DCF-DA染料在黑暗的1 h。定性ROS水平是在显微镜下检查,和定性荧光的细胞被荧光测量读者在485/530 nm激发/发射(Fluoroskan崛起、热电电子、芬兰)。

2.10。线粒体膜电位(MMP)分析

基于罗丹明123 -荧光测量被用来分析MMP的改变在海拉细胞接触后RA-ME使用方法[44]。简单地说,海拉细胞被镀在24-well板的密度 每个细胞。然后,细胞治疗250 - 1000μ克/毫升RA-ME 24 h。在那之后,细胞孵育10μ克/毫升Rh123黑暗和荧光染料60分钟的MMP的荧光显微镜下分析。MMP在海拉细胞的定量测量是通过测量在485/530 nm激发/发射板。

2.11。细胞周期分析

分析RA-ME诱导的细胞周期阻滞,海拉细胞( 细胞/)被播种在24-well文化。细胞被暴露于250 - 1000年μ克/毫升RA-ME 24 h。治疗后,细胞与PBS和固定在70%冷乙醇冲洗1 h。此外,细胞包含50和分散染色溶液清洗μg / ml propidium碘(π)和50μg / ml核糖核酸酶a孵化后在室温下1 h,细胞分布在每一个阶段的细胞逮捕了PI染色用贝克曼库尔特史诗XL-MCL流式细胞分析仪。

2.12。细胞凋亡检测

海拉细胞凋亡分析RA-ME曝光后进行使用商用膜联蛋白V-PI凋亡工具包(美国贝克曼库尔特)。短暂,海拉细胞被镀在培养板和处理0,250,500,1000μ克/毫升RA-ME 24 h。治疗后,细胞与冷冻PBS收集和清洗。离心后,细胞颗粒控制,细胞在1×resuspended绑定公开缓冲区包含10μl的膜联蛋白V和π在黑暗中为20分钟。细胞凋亡/坏死细胞的分布记录通过流式细胞分析仪(贝克曼库尔特史诗XL-MCL)。

2.13。统计分析

数据分析是由单向方差分析(方差分析)使用Dunnett的测试。统计分析水平的选择 除非另有指示。结果表示为 从三个独立的实验。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞毒性

三个癌的细胞生存能力的细胞系,MCF-7, a - 549,和海拉,被麻省理工评估和NRU化验RA-HE和RA-ME曝光后0 - 1000μg / ml 24 h。结果表明,所有的细胞系对细胞毒性的影响RA-ME以浓度依赖方式(图1)。然而,RA-HE没有显示细胞毒性影响MCF-7和a - 549细胞,减少对海拉细胞相比RA-ME细胞毒性的影响。在500年和1000年RA-MEμg / ml显著降低MCF-7和a - 549细胞的可行性。细胞的生存能力在MCF-7记录为81%和70%,72%和48% - 549细胞,分别在500年和1000年μRA-ME g / ml。然而,显著减少甚至海拉细胞被记录在100的可行性μ克/毫升以上浓度。细胞生存能力是记录为71%、37%、25%,100年13%,250年,500年和1000年μ克/毫升RA-ME分别。RA-HE也发现减少海拉细胞的细胞生存能力在500年和1000年的75%和39%μ分别g / ml。NRU化验还透露类似的细胞毒性反应RA-HE与MCF-7 RA-ME, a - 459、海拉细胞。结果表明,RA-ME减少的可行性这三个细胞浓度的方式(图2)。细胞的生存能力被发现在MCF-7 83%和72%,70%和45% - 549年,27%和15%,分别在500年和1000年μRA-ME g / ml。然而,RA-HE被发现noncytotoxic MCF-7和- 549细胞,但是生存能力是减少到73%和42%在500年和1000年海拉细胞μ克/毫升。相比之下,RA-HE和RA-ME被发现只在海拉细胞系诱导细胞毒性,但RA-HE显示细胞毒性效应略少比RA-ME海拉细胞即使在较高的浓度。因此,RA-ME海拉细胞被选作进一步分析。半最大抑制浓度( )值RA-HE RA-ME获得MCF-7, a - 549,提出了海拉细胞表1。这些发现也证实了形态学观察。如图3,RA-ME MCF-7相比最大的海拉细胞密度下降和a - 549细胞。在这项研究中,我们使用MTT和NRU化验来评估潜在的细胞毒性RA-HE RA-ME MCF-7, a - 549、海拉细胞。这些化验是经常被用来屏幕植物提取物对癌细胞的细胞毒性潜能行(45]。活细胞减少肝癌和黄色到紫色水晶甲瓒线粒体脱氢酶酶(46]。中性红是一种微弱的阳离子染料,在活细胞溶酶体积累而不是死细胞的非离子被动扩散(47]。染料被细胞的数量被认为是相对于活细胞的总数。我们的研究结果表明,MTT和NRU化验显示浓度RA-HE和RA-ME癌症细胞株的细胞毒性。结果表明,RA-ME享年100岁μ克/毫升以上浓度抑制海拉细胞的细胞生存能力。我们的结果与先前的报道是一致的,表明酒精提取的罗莎damascena诱导细胞毒性效应对海拉细胞线100 - 1000的范围μ克/毫升浓度(36]。在我们的研究中,methanolic提取R。damascena(RA-ME)显示最高的海拉细胞与细胞毒性反应~ 200μg / ml,符合Artun et al。13),表明methanolic提取的r . damascena表现出对海拉细胞与细胞毒性的影响265年μ克/毫升。其他报告也显示细胞毒性的活动罗莎damascena及其成分对人类前列腺癌、肺癌和乳腺癌细胞系(35]。Hagag et al。48也表明罗莎damascena表现出对MCF-7和HepG2细胞抗癌潜力。

3.2。法律流程外包和谷胱甘肽氧化压力测量

氧化应激是著名的有关生物活性的分子机制是诱导细胞凋亡和细胞毒性49]。研究氧化应激的作用RA-ME-induced海拉细胞死亡,我们已经完成了法律事务外包,谷胱甘肽化验(图4)。我们的结果从法律流程外包试验表现出显著的增加存在剂量依赖的相关性在法律流程外包RA-ME-exposed海拉细胞。35%,55%,93%在法律流程外包增强海拉细胞被记录在250年,500年和1000年μ克/毫升RA-ME分别(图4(一))。我们的研究结果清楚地表明,海拉细胞RA-ME显著诱导法律外包水平。许多研究也表明,植物提取物表现出氧化stress-mediated癌症细胞死亡通过增加法律流程外包和减少谷胱甘肽活动(50,51]。谷胱甘肽在细胞的防御中起着重要组成部分氧化应激(52]。它也证明,细胞谷胱甘肽水平是一个重要的组件的活动抗癌药物(53]。在这项研究中,我们发现谷胱甘肽水平显著降低在RA-ME-treated海拉细胞。最多是观察到1000年减少64%μ克/毫升RA-ME紧随其后在500年和250年的30%和8%μ克/毫升RA-ME比未经处理的控制(图4 (b))。在海拉细胞谷胱甘肽的耗竭内容可能会导致由于增加细胞间氧化谷胱甘肽或抑制谷胱甘肽合成的植物提取物。这些发现表明,减少谷胱甘肽水平RA-ME可能导致增加的ROS生成细胞产生氧化还原不平衡导致生物分子的氧化造成细胞死亡。同样,Wageesha et al。54)报道,海拉细胞治疗与“Le Pana Guniya”(液化石油气),一个著名的抗癌中药,导致谷胱甘肽耗竭水平。

3.3。ROS测量

增加活性氧的生产已被报道为肿瘤细胞凋亡的主要原因之一,被公认为癌症治疗的一个有前途的治疗方法55]。在此,我们测量了定量和定性ROS生产RA-ME的海拉细胞暴露在细胞毒性浓度。如图5(一个)在海拉细胞,RA-ME显著诱导活性氧生成由荧光显微镜检查。增加了29%、68%和101%,ROS生成是观察到250年,500年和1000年μg / ml,分别在海拉细胞暴露于RA-ME 24小时以使用荧光分光光度计(图5 (b))。基于获得的数据显示增加活性氧生成表明RA-ME-induced细胞毒性和细胞凋亡在海拉细胞通过ROS介导的一代。增加的ROS水平生产也被报道参与潜在抗癌药物的抗癌机制的过程(56)和植物extract-induced人类前列腺细胞凋亡(CA-2B),人类乳房(MCF-7)和肺(中冲)癌细胞57]。

3.4。MMP的分析

去极化在MMP的被称为细胞凋亡过程的特性之一(58]。确认这个过程中,我们测量了在海拉细胞线粒体膜电位。细胞暴露在RA-ME在250 - 1000μg / ml 24 h。鉴于,如图6全盛时期的图像显示,浓度降低MMP(图6(一))。定量数据还展出,RA-ME MMP的16%,下降38%,250年71%,500年和1000年μ分别为g / ml(图6 (b))。观察到这里,降低染料的强度表明破坏MMP表明海拉细胞死亡引起RA-ME是依赖于线粒体的。细胞毒性和细胞凋亡反应通过中断MMP在其他肿瘤细胞也被调查59]。大量研究也揭示了罗莎的凋亡财产的物种,这样狗牙蔷薇提取人类结肠癌(60和人类肺癌和前列腺癌的细胞61年通过线粒体膜电位去极化。

3.5。细胞周期分析

海拉细胞的细胞周期阻滞治疗r . damascena分析了提取(RA-ME)流式细胞分析仪。如图7,有一个强大的海拉细胞subG1剂量反应关系阶段和RA-ME治疗。使用的所有RA-ME的浓度显著增加细胞数量在subG1阶段(凋亡细胞)。经过24小时的治疗,subG1阶段细胞的百分比是4.21%,74%,84.6%,88.6%,控制在250年,500年和1000年μ克/毫升RA-ME分别(数字7(一)- - - - - -7 (d))。我们的研究结果表明,RA-ME诱导剂量依赖性的积累在G1期细胞。与我们的结果一致,Kilinc et al。61年在狗牙蔷薇提取逮捕人类肺癌和前列腺癌细胞的细胞周期subG1 / G0期。同样,上升的主要组件之一,Geraniol-treated胰腺癌细胞,也表现出剂量依赖性增加细胞的百分比subG1 / G0期细胞周期和减少细胞出现在G2 / M期(62年]。

3.6。细胞凋亡检测

对凋亡的影响进行调查r . damascena海拉细胞提取物(RA-ME),流仪进行了分析。细胞凋亡分析使用膜联蛋白V-PI细胞凋亡测定。如数据所示8(一个)- - - - - -8 (d)增加存在剂量依赖的相关性,晚期凋亡的比例(象限2)细胞在海拉细胞被发现。凋亡细胞的百分比在未经处理的控制和RA-ME-treated细胞(象限2)分别为1.21%,59.3%,81.3%,88.9%,0,250,500,1000μg / ml,分别为(数字8(一个)- - - - - -8 (d))。我们的研究结果表明,RA-ME诱发细胞凋亡在人类宫颈癌(海拉)细胞浓度增加。这些细胞凋亡细胞显示膜联蛋白V的增加表达阳性细胞在RA-ME-exposed海拉细胞相比,控制。最大的凋亡细胞被发现在1000年μRA-ME g / ml。我们的研究结果也支持哈提卜et al。63年),显示r . damascena油诱导胃癌细胞株的细胞毒性(MKN45)通过细胞凋亡机制。图兰等。60也证明了狗牙蔷薇提取展品浓度对人结肠癌细胞的细胞毒性效应诱导细胞凋亡。诱导癌细胞凋亡的广泛研究,使其抗癌药物发展的一个重要指标(55]。先前的报告也表明,细胞毒性植物化学物质诱导细胞凋亡或阻断信号通路,从而导致细胞周期阻滞或细胞死亡64年]。癌症细胞具有细胞凋亡的分子机制,减轻这方面扮演着重要的角色在癌症的发展19]。因此,感应细胞毒性药物诱导细胞凋亡可能是癌症化疗的重要治疗方法的方向。

4所示。结论

总之,目前的研究证实的机理r . damascena针对肿瘤细胞在体外。我们的研究结果显示,RA-ME-induced在海拉细胞凋亡和细胞毒性与氧化应激相关的形成,ROS生产、线粒体去极化和细胞周期阻滞。根据目前的调查结果,我们可以假定RA-ME在海拉细胞诱导的细胞死亡是由于氧化应激。的细胞毒性作用r . damascena这项研究提供了一个详细地观察了解知识。然而,需要进一步的研究来理解具体机制参与r . damascena全身癌细胞死亡。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

科学研究的作者感谢院长以来,沙特国王大学资助通过科研副院长职椅子。