文摘

丙型肝炎病毒(HCV)是一个全球肝病的主要原因。慢性丙肝病毒感染通常是与增加肝组织的氧化应激有关。氧化应激的强度可能在肝损伤和有害因素可能决定疾病的严重程度。目前的病例对照研究的目的是确定的脂质过氧化水平(TBARS)、蛋白质氧化改性(AOPP)和过氧化氢酶活性在患者感染丙肝病毒血清,与不同的HCV基因型和病毒载量。考虑到HCV慢性丙型肝炎患者(52)和控制(50)招聘,作为case-control-type研究设计。丙肝病毒RNA隔离、病毒载量和HCV基因分型是根据标准协议执行。相比显著差异控制健康受试者TBAR报道( ),AOPP ( ),和过氧化氢酶活性( )。在性别比较,明显更高层次的AOPP女性报道( )。分层的HCV基因型,最常见的是HCV-1 (HCV-1a和丙肝病毒1 b),整体参与的60%以上,其次是基因型3,至少代表了基因型2。基因型之间没有显著差异记录关于氧化应激标记,尽管TBARS水平稍高,但不显著,已经登记的病人感染1 b基因型。发现了一个显著的正相关关系在HCV基因组复制和AOPP的浓度( ; )。高水平的HCV病毒载量更可能TBARS更高,但仍然没有统计学意义( )。总之,获得的结果证实活性氧之间的不平衡生产和hcv感染患者的抗氧化防御系统。由于氧化应激可能产生深远影响疾病进展,纤维化和致癌作用,我们的结果可能满足强制性引入抗氧化剂的愿望早丙肝病毒疗法来抵消ROS的后果。

1。介绍

丙型肝炎病毒(HCV)是一个全球肝病的主要原因。据世界卫生组织(世卫组织)报告,估计患病率0.5% - -3%的全球注册。在欧洲,据估计,大约有1400万人感染(1]。丙型肝炎病毒(HCV)属于黄家庭,属Hepacivirus。丙肝病毒是一种小直径(55 - 65海里),包围,二十面体粒子。病毒的基因组是正的单链RNA与大约9600个核苷酸长度。它由两个守恒的翻译终端区域的5 和3 结束和开放阅读框(ORF)在中间。ORF分为结构基因(C、E1和E2)和非结构基因(NS2, NS3、NS4a NS4b, NS5a,和NS5b)。C基因编码核衣壳蛋白;E1和E2基因编码蛋白质糖基化的信封膜;非结构基因编码非结构蛋白,参与病毒复制的过程2]。根据级别的核苷酸序列同源性,丙肝病毒隔离分为七个基因型。隔离,属于同一基因型,进一步分为亚型(a, b, c,等)(3]。不同基因型之间的核苷酸序列的同源性程度约为65% (4]。该地区5 ,核心和非结构化病毒基因组的基因是高度保守的序列,而E1和E2基因核苷酸序列异质性很高展示隔离不同的基因型(4]。此外,丙肝病毒的一个非常重要的生物特征是其E2基因的变化域HVR1 HVR2。E2基因的突变导致丙肝病毒突变体的外观(准物种)。E2蛋白是中和抗体的目标以来,丙肝病毒的突变区域使病毒逃避体液免疫反应的消除。这是解释为建立一个持续感染的机制(5]。

丙肝病毒感染是一种严重的健康问题,因为在大多数感染者持续感染。它可能是由慢性肝病临床表现,经常与进步的过程,从慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌。约20 - 30%的慢性肝炎患者10到30年后发展成肝硬化。在这些患者中,死亡的风险从cirrhosis-related并发症是每年4%,和发展的风险在肝硬化患者肝细胞癌(HCC)是每年1%到5%。百分之三十三的肝癌患者死后一年内诊断(6,7]。负责肝细胞损伤的发病的机制包括细胞毒性T细胞免疫反应和氧化应激(8]。

慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染通常是与增加肝组织的氧化应激有关。氧化应激的强度可能是肝损伤的不利因素和可能决定疾病的严重程度9,10]。细胞ROS负责生产和解放肝细胞,nonparenchymal肝细胞,如枯氏细胞(常驻巨噬细胞),炎症细胞、肝星状细胞(hsc),和其他免疫效应细胞(11]。他们相互影响,出现恶性循环。肝损伤后,一系列的活性氧(ROS)释放整个干扰线粒体电子传递链和氧化酶的活动(12]。ROS率的增加,物种是超氧化物阴离子(O2−)、过氧化氢(H2O2),最危险的氢氧自由基(HO∙)。它可能导致严重的分裂的细胞脂质成分(磷脂膜),蛋白质的氧化改性,氧化修饰的DNA。他们可能诱导细胞损伤、蛋白质功能不足,和基因组不稳定,与细胞死亡和/或肝细胞癌的发生率增加。肝纤维化是一个复杂的过程,包括肝细胞的死亡和激活肝星状细胞(13]。

肝细胞具有对抗氧化应激的专业体系,包括酶和非酶的系统的维生素和nonvitamin起源。酶系统在肝组织中,最明显的是过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSR)及谷胱甘肽转移酶(GST)。顺向细胞损伤可能导致短期适应通过诱导肝脏再生,但很快,自适应机制是减少可能出现的两种可能的途径,即。基因组不稳定性,可能导致致癌或细胞死亡。由于改变了蛋白质合成和顺向氧化改性,抗氧化防御酶系统变得相对不足以抵御的巨大攻击解放ROS (14,15]。细胞死亡引起的替代功能纤维母细胞和肝组织的功能性肝衰竭、肝硬化开始结果。ROS可能发挥重要作用的信号分子负责stress-surviving信号通路的激活和redox-sensitive转录因子。它可能会进一步诱发炎症和顺向自由基释放下一个actor-inflammatory细胞。其中有枯氏细胞,分泌白介素- 1 (IL)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、鉴定及和释放活性氧NADPH氧化酶的活化。ROS生产诱发redox-sensitive炎性NF-B转录因子的激活。进一步释放自由基活化肝星状细胞,成为下一个球员和ROS负责进一步的重要来源肝细胞损伤和纤维化过程的归纳(16,17]。

目前的病例对照研究的目的是确定的脂质过氧化水平(TBARS)、蛋白质氧化改性(AOPP)和过氧化氢酶活性在患者感染丙肝病毒血清,与不同的HCV基因型和病毒载量。

2。患者和方法

考虑到慢性丙型肝炎患者(52)和控制(50)招聘,作为case-control-type研究设计。这项研究是医学院伦理委员会批准的(没有决定。12 - 6972 - 2/6)。所有研究受试者招募签署了知情同意。研究所的调查进行公共卫生和Niš大学医学院(塞尔维亚)。

登记病人,除了丙肝病毒阳性,被特定的合格标准,包括没有乙型肝炎病毒感染的情况下,艾滋病毒感染,其他慢性肝脏疾病,任何急性或慢性系统性免疫条件和炎性疾病,癌症,心血管疾病、肾脏疾病。对照组由50名健康的志愿者,他们遇到了同样的合格标准,即。,他们是丙肝病毒阴性,年龄和准确性。

丙肝病毒的诊断是根据标准诊断协议执行。丙肝病毒RNA隔离是由装备Ribo-virus Sacace。等离子体丙肝病毒RNA检测使用丙肝病毒REAL-TM战Sacace新版本。丙肝病毒RNA的检测浓度(国际单位/毫升血浆)病毒负荷,丙肝病毒REAL-TM定量Sacace使用新版本。丙肝病毒基因分型结果进行使用HCV基因型+ REAL-TN Sacace。所有的诊断程序根据制造商的建议进行。

分析,早上丙型肝炎患者和对照组的血液样本和离心机3.000转;血清样本保存在−80°C。

TBARS-reactive化合物的浓度(MDA)进行描述的方法显示Sahreen et al。18),测定丙二醛(MDA)的基础上,这与硫代巴比土酸发生反应,形成一个粉红色的复杂。反应混合物中含有0.2毫升的血清,0.2毫升的抗坏血酸(100毫米),0.58毫升的磷酸钾缓冲(0.1 M; ),0.02毫升的铁chloride-FeCl3(100毫米),1毫升CCl3COOH(10%),和1毫升的稍后通知(0.67%氢氧化钠溶解在0.1)和在沸水浴加热30分钟(100°C)。在4000转离心10分钟后,粉红色的吸光度是读535海里。的浓度TBARS表达μMDA mol / L。

AOPP的浓度决定了分光光度法测定的方法Witko-Sarsat et al。19]。200的数量μL血清稀释1:5在PBS和chloramine-T标准解决方案被放置在一个96 -微量滴定板,其次是20μL醋酸。10毫升1.16 KJ的补充说,其次是20μL的冰川醋酸。后黄色是阅读在340纳米微型板块读者对一个空白。AOPP的浓度是表达μmol / L氯胺T。

过氧化氢酶活性在血清使用分光光度法赫et al。20.]。简单,反应混合物包含0.5毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值5.0),1.5毫升的5.9毫米H2O2和0.1毫升的血清。这是孵化为5分钟;之后,反应停止通过添加0.1毫升的20%柠檬酸和1毫升4%钼酸铵。样本离心机,吸光度的变化计算在240 nm,通过减去标准样品,0.1毫升蒸馏水代替血清添加。猫的活动被定义为Kat / L,这意味着一个吸光度变化0.01 /分钟为单位。

在SPSS统计数据分析程序,20个版本。的正常数据分布由Kolmogorov-Smirnov测试测试。对比组是由学生的 - - - - - -检验和方差分析的正态分布数据。在数据分布不正常时,Mann-Whitney 测试或使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验。变量之间的相关性是由皮尔森系数的线性相关性。统计学意义是考虑 。

3所示。结果

表1显示了患者HCV基因型分布。分层的HCV基因型,研究人口的分布如下:最常见的是HCV-1 (HCV-1a和丙肝病毒1 b),与整体参与HCV-1超过60%,紧随其后的是基因型3,至少代表了基因型2。

表1
丙肝患者基因型分布。

表2显示了氧化应激水平的参数(TBARS AOPP)和过氧化氢酶活性在丙肝病毒患者和健康者的控制。所有参数检查显示显著差异控制健康受试者相比,这TBAR一样 ,为AOPP ,对过氧化氢酶和 。

表2
氧化应激之间的参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性和控制健康的丙型肝炎患者组。

表3显示了氧化应激的性别比较参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性在丙肝患者组。AOPP的水平明显高于女性被报道,这是 。此外,性别分布显示,男性更有可能TBARS更高水平和过氧化氢酶的活动,但没有统计学意义。

表3
性别比较氧化压力参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性在丙肝患者组。

氧化压力参数的值(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性在不同患者感染HCV基因型总结表4。基因型分布显示,HCV1b患者更有可能有更高的TBARS与别人相比,丙肝病毒3 AOPP患者更有可能有一个高一级的,而患者感染HCV1a更可能有一个低的过氧化氢酶活性,但没有统计学意义。

表4
氧化压力参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性对丙肝病毒基因型。

表5显示了HCV病毒载量和氧化应激的相关参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性。病毒基因组之间显著正相关关系被发现浓度和AOPP(副本 ; ),这意味着增加浓度的基因副本AOPP的水平显著提高。相关分析表明,高水平的HCV病毒载量更可能TBARS更高,但没有统计学意义( )。

表5
HCV病毒载量和氧化压力参数之间的相关性。

4所示。讨论

我们的研究证明,在所有的HCV基因型检测,基因型1 (a和b)代表的最普遍的基因型的分布超过60%,紧随其后的是基因型3(表1)。这个频率分布是报道世界范围内(4]。

本研究进一步涉及评价氧化应激标记(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性在患者感染HCV基因型1,1,2,3。获得的结果表明,不同基因型患者感染下改变平衡ROS生产和抗氧化防御系统,减少生产过剩的活性氧和抗氧化防御。TBAR-reacting物质水平,表示为MDA水平,几乎是两倍的未感染,健康对照组(表2)。氧化应激的性别比较参数(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶的活动组的丙型肝炎患者透露AOPP的水平明显高于女性,而男性更有可能TBARS更高水平,但无统计学意义(表3)。

基因型之间没有显著差异记录,尽管TBARS水平稍高,但不显著,在患者感染基因型1 b(注册表4)。我们的结果符合安萨里et al。21)和Limongi et al。22),只有细微变化组MDA水平1 a和1 b基因型有记载21]。

丙肝病毒基因型的研究主要面向的评价与疾病的严重程度相关,纤维化的外观,致癌作用,抵抗治疗。ROS增加生产及其对脂质过氧化的影响和蛋白质氧化改性机制已被卷入丙肝病毒感染后的终末期肝硬化(23- - - - - -25]。作为我们的研究表明,病毒载量和氧化应激的相关性参数AOPP显示显著正相关(表5)。这一结果表明,病毒载量可以直接负责ROS生产和解放和顺向细胞损伤。自相关分析表明,高水平的HCV病毒载量更可能TBARS更高,这可能表明,病毒载量也可以影响膜损伤和脂质过氧化作用。

丙肝病毒可能genome-encoded非结构蛋白在发病的机制有一个角色负责过多活性氧在肝细胞释放。NS5A其中,最好的解释是,这是一种多功能蛋白,它有助于丙肝病毒复制。除了中央NS5A丙肝病毒复制的作用,它能够诱导干扰素的阻力,通过镇压PKR函数。ROS的触发机制解放NS5A是复杂的,最后导致顺向激活炎症,redox-sensitive NF -κB, AP-1转录因子。促炎的转录因子NF -κB已经宣布中央中介细胞免疫和炎症反应。其活跃的子单元,包括NF -κB1 (p50施敏原著),NF -κB2 (p52 p100), RelA (p65) RelB,:,诱发许多基因的表达,随之大量炎性细胞因子的合成,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、il - 1、il - 6、地震-淋巴毒素CXCL4,干扰素-γ、趋化因子、TGF -β(26,27]。很有趣的ROS生成尽管HCV NS蛋白反应产物,反过来,可能抑制丙肝病毒复制(23]。最近出版记录,丙肝病毒核心蛋白可能诱发inflammasome激活和il - 1β从肝巨噬细胞释放28]。确切的机制已经被使用一个记录在体外Huh-7细胞培养模型,与NS5A转染,untransfected组织担任控制。通过研究现有的NS5A三个领域参与活性氧的生产,据报道,除了全身NS5A蛋白,其域我可能只诱导活性氧的生产(29日]。NS5A-induced释放活性氧的可能机制是直接NS5A-induced损伤细胞内的膜组件,包括ER、过氧化物酶体和线粒体。协会与膜组件后,它诱发ER压力,同时流出的Ca2 +离子从ER。他们可以被线粒体,在这样一个跨膜电位改变,其次是减少分子氧,导致不稳定的超氧化物阴离子自由基(O的积累2−在线粒体。在这个通路,线粒体氧化磷酸化链位于内线粒体膜是自由基生成的主要来源30.- - - - - -32]。

除了上述的线粒体机制NS5A-induced释放活性氧,NADPH氧化酶的表达家庭(NOX1和NOX4)和环氧合酶2 (cox - 2)同时发生。在线粒体途径的情况下,据报道,领域我可以诱导NOX1。特定的级联效应导致的结论是,所有系统都可以符合一个特定的顺序,其中包括TGFβ1、NOX1 cox - 2和NOX4。在这种背景下,下一个玩家参与活动ROS生成似乎是细胞色素P450 2 e1 (CYP2E1)在ER膜有一个典型的本地化。除了NS5A,影响NOX4也可能发挥丙肝病毒结构蛋白(29日]。NADPH氧化酶的重要性和CYP2E1记录在慢性炎症的发展,肝细胞死亡。自激活成纤维细胞迁移和过多的胶原蛋白沉积克服肝脏再生能力,顺向肝纤维化似乎是一个必要的伤害(29日,33,34]。

释放活性氧可能损伤易感细胞生物分子和相关的细胞结构,如不饱和的游离脂肪酸膜磷脂、蛋白质结构和功能的细胞组件,如酶和受体和DNA。如涉及细胞膜,生成的活性氧可以改变细胞细胞器的结构和功能,外层细胞膜,导致膜磷脂过氧化分解。溶酶体水解酶的释放可能进一步加剧肝细胞损伤。释放破坏粒子可能会进一步充当潮湿的分子(有关分子模式),激活肝星状细胞增殖和属于转换成myofibroblast-like细胞。转换后,他们发挥纤维发生的的潜力,通过分泌胶原蛋白I型,III, IV,纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、转化生长因子-β(TGF -β)。通过这种方式,他们填补不可逆的死亡的肝细胞的空的空间。炎性细胞因子,从周围的炎症细胞释放,可能会进一步产生活性氧(35,36]。ROS可能减少肿瘤抑制p53蛋白表达(14,15),刺激一个可能的致癌作用。氧化压力参数的值(TBARS和AOPP)和过氧化氢酶活性在不同HCV基因型(表4)可能表明基因型分布,HCV1b患者更有可能有更高的TBARS与别人相比,丙肝病毒3 AOPP患者更有可能有一个高一级的,而患者感染HCV1a更可能有一个低的过氧化氢酶活性,但没有统计学意义。没有统计上的显著差异的情况下生产活性氧之间的基因型可以用这一事实来解释类型的病毒蛋白质不同基因型之间有高度的同质性。

考虑到过氧化氢酶的活性与单一的基因型,过氧化氢酶活力显著降低的趋势在每个基因型。肝细胞培养不同的保护机制防止活性氧的影响。证据确凿的,抗氧化的酶,过氧化氢酶的活性非常高在肝组织中。通过这种方式,它提供了抗氧化防御酶系统的第一行。在慢性丙型肝炎的情况下,一个记录的结果数减少抗氧化防御系统,表示为总抗氧化能力或减少谷胱甘肽的低水平。抗氧化能力下降的过氧化氢酶活动带来了肝组织无力对抗氧化应激或持续和慢性组织损伤(21,23]。

这样,既增加活性氧的生产和减少抗氧化防御工作符合炎症细胞损伤和肝基因组不稳定。我们的研究结果与其他研究结果一致,关于非酶的水平的抗氧化防御水平(谷胱甘肽)33]。抗氧化活性的酶可能会有所不同,这取决于保存补偿机制。一些报道讨论活动的增加抗氧化酶MnSOD和过氧化氢酶在丙肝病毒感染(37- - - - - -39]。

总之,获得的结果证实活性氧之间的不平衡生产和抗氧化防御系统在HCV感染的患者中,有明显增强的脂质过氧化作用和蛋白质氧化改性,其次是过氧化氢酶活动的减少。由于氧化应激可能产生深远影响疾病进展,纤维化和致癌作用,我们的结果可能满足强制性引入抗氧化剂的愿望早丙肝病毒疗法来抵消ROS的后果。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者,(VD)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由塞尔维亚教育部,科学和技术发展的塞尔维亚,格兰特Nis大学医学院;内部项目大学医学院Nis没有7。