文摘
动脉粥样硬化与血管内皮细胞的炎症反应密切相关。葛根素(Pue),粉末的主要活性成分分离葛根,是一种异黄酮化合物具有强抗氧化性能。虽然Pue展品承诺antiatherosclerotic药理作用,只有少数研究报告对内皮细胞的保护作用。本研究发现Pue可以一定程度上调节线粒体功能在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和减少或抑制lipopolysaccharide-induced HUVECs炎性反应和氧化应激损伤,可能通过线粒体质量控制。此外,Pue的保护作用HUVECs sirt - 1基因信号通路密切相关。Pue增加自噬和线粒体的抗氧化潜力通过sirt - 1基因表达增加,减少过度生产活性氧,抑制炎症因子的表达和氧化应激损伤。因此,Pue可能改善线粒体呼吸功能和能量代谢,增加的脆弱性HUVECs炎症状态。
1。介绍
动脉粥样硬化(AS)是一种保护性反应,动脉壁内皮细胞和平滑肌损伤,包括脂质条纹的形成和纤维损伤,和总是伴随着炎症反应1,2]。过度炎症反应时,可能引起血管内皮细胞损伤和斑块形成3,4]。内皮细胞结构和功能发挥着重要作用在维持一个平衡的微循环和血液流速,尤其是在发展(5,6]。内皮细胞是主要的细胞构成的内膜动脉壁和血液和外部组织之间的屏障。他们功能调节血液流动,血管张力,抗凝和促凝血的活动,和脂蛋白代谢(7]。内皮细胞产生细胞因子,也可以通过他们的屏障和分泌功能调节免疫反应(8]。此外,内皮细胞可以分泌生物活性物质,如一氧化氮(NO)和内皮素,并影响平滑肌的功能细胞,血小板,白细胞(9]。
内皮细胞损伤和功能障碍早期参与发起的(10]。例如,在早期阶段,内皮细胞可以产生一系列的炎症可能会进一步加剧内皮细胞功能障碍的因素,参与血栓形成,促进(的发生和发展11]。在炎症状态的压力、内皮细胞功能和基因表达开关从静止到激活状态,导致各种炎症反应(12]。内皮细胞可能受到其他细胞产生的炎症因子的影响,也影响的扩散和收缩平滑肌细胞通过旁分泌信号(13]。平滑肌细胞的增殖是最晚发展的一个重要特性14]。
迄今为止,大多数研究集中在内皮功能障碍的作用在血管炎和微循环的疾病。对这些类型的疾病,内皮功能障碍引起的炎症更可能导致(15,16]。的开发过程中,炎症反应往往与活性氧(ROS)调解的氧化应激(17]。与炎症的发生和发展,增加激活免疫细胞浸润,居民和炎症细胞,线粒体能量的需求逐渐增加,导致缺氧和线粒体质量控制(MQC)障碍。此外,ROS过度繁殖,内皮细胞表现出更严重的氧化损伤(18,19]。
线粒体氧化磷酸化的强国在真核生物20.),碳水化合物,脂肪,蛋白质氧化和分解产生能量(21,22]。丙酮酸水解形成triacyl酸,丙酮酸的线粒体。最终,H2O和有限公司2生成和三磷酸腺苷(ATP)被释放来维持细胞生理功能(23]。研究表明,线粒体参与是一个重要的环节,发展(24]。线粒体能量代谢障碍是血管内皮细胞功能障碍的早期迹象之一(25]。在进展,线粒体能量代谢障碍主要表现为呼吸功能障碍和降低能量代谢相关基因的表达和蛋白质(26]。线粒体是细胞内重要的介质,和线粒体功能障碍可以间接激活各种炎症信号转导途径,导致组织和细胞损伤。ROS-mediated氧化应激可能导致MQC障碍通过直接细胞毒性和可促进局部炎症反应的发生和发展27]。
氧化应激和炎症是相互依存的,尤其是在线粒体。过多的活性氧产量炎症网站可能导致氧化应激损伤线粒体。线粒体ROS和氧化应激的附带产品可以实现协同增强炎症因素的反应。线粒体可能是炎症的“特洛伊木马”,同时保持基本细胞功能(28]。此外,陈的一项研究显示,受损的线粒体激活炎症的尸体NLR家庭pyrin域包含3 (NLRP3) [29日]。此外,激活NLRP3时抑制线粒体自噬清除异常线粒体和受损的蛋白质(30.]。线粒体ROS的氧化效果在线粒体DNA的激活NLRP3导致局部炎症自由流通的线粒体DNA的潜力。这表明氧化应激和线粒体途径会影响MQC内皮细胞炎症反应在一个相互依赖的方式。
葛根素(Pue)的主要活性成分葛根,这是用于传统中药。Pue是类黄酮糖苷的提取干的根源P。兜水母目(31日,32]。由于其显著的雌激素样作用,Pue有助于治疗动脉粥样硬化疾病和保护内皮细胞功能(33]。Pue也显著减少脂多糖(LPS)诱导p-NF-kappa B-p65和伯灵顿表达和bcl - 2的表达水平增加。此外,Pue可以抑制炎性细胞因子的释放和保护脐静脉内皮细胞(34]。其他研究已经表明,Pue可以减少血管内皮损伤和il - 1的表达β,引发ICAM-1, PAI-1人类脐静脉内皮细胞的上清液(HUVECs)与LPS刺激。它还可以减少LPS-induced中性粒细胞粘附HUVECs,抑制LPS-induced内皮损伤(35]。
尽管实验研究证实,Pue对内皮细胞有明显的保护作用,具体机制仍不清楚。在当前的研究中,我们调查是否Pue的抑制作用LPS-induced内皮细胞炎症和氧化应激损伤是由线粒体介导的。
2。结果
2.1。Pue LPS-Induced HUVEC活动改善炎症
HUVEC炎症模型建立了与LPS刺激HUVECs初步确认Pue的影响在HUVECs处于LPS-mediated炎症状态的功能。不同浓度的Pue (10 mg / L, 20 mg / L, 50 mg / L, 100 mg / L和150 mg / L)被用作干预治疗。HUVEC活动决心使用CCK-8化验。CCK-8分析表明,有限合伙人的活动减少HUVECs的价格相比对照组,如图1(一)。预处理Pue不同浓度提高HUVEC活力LPS处理后,细胞活性是最重要和100 mg / L Pue预处理后(图1 (b))。因此,100 mg / L Pue被选为最佳治疗药物浓度HUVECs在后续实验。分析还表明,有限合伙人HUVECs细胞凋亡水平的增加,但100 mg / L Pue抑制细胞凋亡(数字1 (c)和1 (d))。这些结果表明,Pue维护的活动HUVECs LPS-induced炎症状态下和抑制细胞凋亡。
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2.2。Pue抑制LPS-Induced HUVECs炎症反应和氧化应激损伤
我们发现Pue也可以减少LPS-induced炎性损伤。与对照组相比,LPS-induced的炎性因子的表达,TNF -α,地震是在HUVECs LPS处理显著增加(数据2 (b)和2 (c))。此外,抗炎因子il - 10的表达水平显著降低(图2(一个))。预处理的HUVECs Pue逆转LPS-induced增加TNF -α/地震- il - 10的差别水平,对这些基因的表达(图2(一个)- - - - - -2 (c))。结果证实,Pue干预可以改善HUVEC LPS引起的炎症反应。
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我们进一步研究了Pue的保护机制提高活力和减少的脆弱性HUVECs下LPS-induced炎症。探索Pue的保护作用在氧化还原状态的内皮细胞和线粒体氧化应激损伤,酶联免疫吸附测定(elisa)被用来评估抗氧化酶的活性,如谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。我们发现LPS诱导的炎症状态表现出减少谷胱甘肽、SOD、GPx活性HUVECs(数字3 (d)- - - - - -3 (f))。预处理的细胞与Pue导致增加谷胱甘肽,SOD、GPx活性(数字3 (d)- - - - - -3 (f))。这些结果表明,LPS-induced炎症可以诱发氧化应激损伤通过抑制抗氧化酶的活性,包括谷胱甘肽、SOD、GPx。然而,Pue能够扭转这一现象,进一步证实了葛根素的药理作用与氧化应激。
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2.3。下Pue监管HUVEC MQC LPS-Induced炎症
线粒体ATP生产的主要地点是细胞能量代谢所必需的。研究已经证明,LPS-induced炎症反应可引起严重损害线粒体的结构和功能36,37]。在当前的研究中,我们评估HUVECs线粒体ROS生成水平和线粒体膜电位(MMP)。与对照组相比,水平的线粒体ROS生成增加(数据4(一)和4 (f)),MMP的水平显著降低(数字4 (d)和4 (e))。Pue治疗HUVECs导致显著增加MMP的水平(数字4 (d)和4 (e)),而线粒体ROS生成水平显著降低(数字4(一)和4 (f))。
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线粒体是细胞中耗氧量的主要网站和活性氧的主要来源以及活性氧攻击的主要目标。线粒体活性氧导致的过度生产的释放促炎因子的地震和TNF -α和直接影响线粒体结构和功能38- - - - - -40]。LPS-induced HUVEC炎症反应和氧化应激损伤改变线粒体的结构和功能与控制和摧毁了MMP。然而,Pue干预线粒体的活性和数量明显增加,恢复了MMP和抑制线粒体ROS生成。我们也评估线粒体呼吸配合物我和III活动ELISA(数字4 (b)和4 (c))。线粒体呼吸配合物我和III显示减少表达LPS-induced炎性损伤,但他们的活动恢复Pue干预。
2.4。Pue提升HUVEC LPS-Induced下线粒体能量代谢炎症
异常线粒体能量代谢和呼吸功能密切相关的线粒体功能障碍(41- - - - - -43]。在当前的研究中,我们调查是否Pue炎症条件下可以改善线粒体能量代谢水平和呼吸功能在HUVECs使用线粒体能量代谢试验。与对照组相比,HUVECs LPS处理表现出显著减少线粒体呼吸水平(图4(一)(图),最大的呼吸能力4 (b)(图),多余的呼吸能力4 (c)(图)和ATP生产能力4 (d));nonmitochondrial氧气呼吸水平(图4 (e)(图)和质子泄漏4 (f))显著增加。然而,Pue预处理逆转这些削减,导致显著增加水平的线粒体能量代谢和呼吸功能(数据4(一)- - - - - -4 (d)),nonmitochondrial氧呼吸(图的水平4 (e)(图),质子漏值4 (f))被抑制。
调查如何Pue HUVECs的线粒体呼吸功能改善炎症状态,使用ex - 527,这是一个有效的和特定抑制剂sirtuin-1 (sirt - 1基因)。结果表明,线粒体呼吸功能的HUVECs明显抑制ex - 527 + LPS + Pue组相比,在有限合伙人+ Pue组(数字4(一)- - - - - -4 (f))。这表明,Pue改善线粒体呼吸功能的影响被sirt - 1基因消除抑制剂ex - 527。Pue是能够改善线粒体呼吸功能的LPS-treated HUVECs和保护线粒体和HUVECs。结果显示,Pue的保护机制可能是通过sirt - 1基因介导的。
2.5。Pue监管HUVEC自噬通过sirt - 1基因处于炎症状态
Pue对抗氧化应激损伤的保护机制和线粒体功能损伤HUVECs进一步探索。选择mrna的表达水平检测的实时定量聚合酶链反应(qPCR)。qPCR分析表明,atg3的mRNA水平,atg7, sirt - 1基因,和PINK1 /帕金显著降低LPS组与对照组相比,但他们明显高于在Pue + LPS-treated HUVECs(数字5(一个)- - - - - -5 (e))。的mRNA水平atg5 atg7, sirt - 1基因,PINK1 /帕金HUVECs ex - 527 + Pue + LPS处理也显著降低。然而,atg5的mRNA水平、atg7 sirt - 1基因,帕金在HUVECs显著增加治疗sirt - 1基因活化剂SRT1720 (SRT1720 + Pue + LPS)。透射电子显微镜显示,有限合伙人治疗显著地抑制线粒体自噬,和Pue增加线粒体自噬的水平(图5 (f))。如数据所示5 (g)和5 (h)sirt - 1基因的蛋白表达,LC3-I \二世,Beclin-1, bcl - 2显著降低LPS组但在有限合伙人+ Pue组显著增加。然而,当ex527, Pue对自噬的影响被消除。然而,srt1720可能恢复和改善Pue的自噬调控能力。这些结果表明,Pue通过sirt - 1基因调控自噬信号通路。
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2.6。sirt - 1基因的抑制信号通路废除Pue-Mediated保护
进一步确定Pue能否诱导线粒体和保护HUVEC sirt - 1基因信号通路,我们使用ex - 527和SRT1720干预Pue + LPS-treated HUVECs。Pue是通过评估验证的具体调控机制的细胞生存能力,细胞凋亡水平,抗氧化酶活性、抗炎能力,和各种HUVEC组线粒体功能。如图6(一),CCK-8透露ex - 527治疗显著降低HUVECs Pue + LPS处理的活动。此外,ex - 527治疗消除Pue的线粒体的保护作用HUVECs处理有限合伙人以及Pue的炎症反应的抑制作用和氧化应激损伤(数据6 (b)- - - - - -6 (j))。同时,SRT1720消除Pue的能力调节炎症反应和HUVECs氧化应激损伤(数字6 (b)- - - - - -6 (j))。myosin-VI激光扫描共焦图像还显示,myosin-VI迅速的表达减少,增加了有限合伙人和Pue分别;ex - 527可以消除Pue的监管效果,和SRT1720可以进一步恢复Pue的监管效果(图6 (k))。这些结果证实,Pue改善HUVECs的线粒体活动和抑制LPS-induced炎症反应通过sirt - 1基因和氧化应激损伤。
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3所示。讨论
炎症和氧化应激的主要风险因素是患者的心血管损害。Pue是天然抗氧化剂,可起到关键作用在调节炎症反应和氧化应激损伤。然而,很少有研究,旨在揭示底层机制Pue减少内皮细胞易受炎症条件。在当前的研究中,我们发现一个LPS-induced HUVECs炎症反应导致线粒体ROS增加生产和更大的MQC障碍和严重氧化应激造成的损害。Pue调节MQC,提高线粒体自噬,抑制LPS-induced HUVECs炎症和氧化应激损伤。Pue也增加了MMP和HUVECs的能量代谢,增加SOD等抗氧化剂激酶的活性,抑制了过多的活性氧产量和inflammation-induced氧化应激损伤,削弱了LPS-induced炎症反应,减少了HUVEC脆弱到炎症状态。
此外,它被发现,干预ex - 527,选择性sirt - 1基因抑制剂,中和Pue的监管MQC和HUVECs Pue的保护作用。然而,干预和sirt - 1基因活化剂SRT1720 Pue的保护作用恢复正常,甚至高于正常水平。因此,我们得出结论,Pue HUVECs免受炎症通过sirt - 1基因。这些结果表明,Pue,作为一种天然抗氧化剂,监管MQC通过sirt - 1基因信号通路和减少的脆弱性HUVECs到炎症状态。
损伤内皮细胞由于膜结构的变化导致的生产antiarterial抗体和补体系统的激活,加重血管内皮损伤和促进发展44]。细胞分裂素、炎症因子和线粒体功能障碍环境中都可以调节内皮细胞的活动和功能通过改变氧化应激产品的浓度(45,46]。大量的血管内皮细胞衰老在先进的动脉斑块。在细胞衰老、线粒体功能障碍加剧和细胞内ROS水平显著增加。ROS异常升高的细胞进一步诱发血管损伤时细胞衰老和加剧病变(47]。
在目前的研究中,我们发现,与氧化应激有关的指标显著调节HUVECs处理有限合伙人,而mitophagy-related基因和抗氧化压力激酶的表达显著下调。这表明,炎症可能会增加氧化应激损伤和抑制mitophagy。在氧化应激损伤,线粒体蛋白质的折叠和无用的细胞器不能及时清除因为mitophagy抑制,和正常的能量代谢水平和线粒体呼吸链的功能可能被中断,导致线粒体活动的迅速减少和MQC障碍。MQC真核生物是一个重要的机制来维持一个相对稳定的数量和线粒体的功能(48]。MQC确保线粒体网络的正常运行,进一步调节线粒体的及时更新,并保持相对稳定的数量和质量在内皮细胞线粒体,或者它可能参与(的发生和发展49,50]。
在内皮细胞线粒体的分布也能影响细胞信号转导。在生理条件下,内皮细胞线粒体动力学稳定的动态平衡状态(51,52]。Inflammation-induced细胞核周围的聚合的线粒体会导致线粒体活性氧积累,影响血管内皮生长因子基因的转录水平(49]。内皮细胞中线粒体的主要功能是传递细胞应对环境信号和参与保护机制下的内皮细胞氧化应激和炎症(53- - - - - -55]。
许多天然产物的植物能保护内皮细胞通过调节线粒体功能和减少内皮细胞压力下的脆弱性(56,57]。我们的研究直接证实了天然抗氧化剂对内皮细胞的保护机制通过MQC。我们还发现,Pue可以调节内皮细胞的mitophagy和维持正常的细胞活动。自噬/ mitophagy不仅控制血管的内稳态,而且在线粒体能量代谢和线粒体的抗氧化系统功能维持线粒体的基本生理功能(56,57]。这还需要进一步的研究来确定机械的相互作用自噬/ mitophagy在炎症和氧化应激状态。此外,Pue的机制影响线粒体质量通过调节自噬水平尚不清楚。
sirt - 1基因是高度保守的河畔+端依赖组蛋白脱乙酰酶。近年来,sirt - 1基因已被证明在许多生物过程中扮演着重要角色,包括细胞分化、衰老、凋亡,生理节奏、代谢调节、转录调节、信号转导和氧化应激58,59]。sirt - 1基因存在于细胞核和血管内皮细胞中高度表达。此外,心血管疾病患者的血清sirt - 1基因水平显著高于健康人(60,61年]。ex - 527是一种有效的选择性抑制剂sirt - 1基因和常被用来阻止sirt - 1基因的调控。我们发现在当前的研究中,ex - 527可以在HUVECs抵消Pue的保护作用。然而,在干预SRT1720, HUVECs Pue的防护效果是恢复,作为对MQC及其监管的影响。这些结果间接证实,Pue HUVECs通过sirt - 1基因和调控自噬可能进一步保护HUVECs免受炎症反应和氧化应激损伤。然而,动物研究还需要确认是否Pue直接影响血液流动和通过sirt - 1基因调节MQC和内皮细胞。
总之,我们发现细胞生存能力和HUVECs MQC监管sirt - 1基因信号通路。有限合伙人治疗减少sirt - 1基因信号,诱导氧化应激损伤和细胞凋亡。Pue是由移植能够调节MQC sirt - 1基因信号,改善HUVECs自噬的水平,进一步减少脆弱性和HUVECs在炎症条件下的氧化应激损伤。应该注意的是,本研究只检查是否Pue改善氧化应激损伤HUVECs通过调节MQC处于炎症状态。结果并不意味着Pue也可以施加相同的保护作用HUVECs其他压力条件下(如高葡萄糖和缺氧)。
尽管这种限制,缺氧和高葡萄糖应力与氧化应激有关,MQC障碍。本研究的特点Pue作为天然抗氧化剂;进一步的临床和基础研究将证实MQC Pue的监管机制和氧化应激。在未来,Pue可能是开发成一个候选药物的临床治疗。我们预计Pue可能成为治疗策略被广泛用于治疗各种心血管疾病。
4所示。材料和方法
4.1。细胞培养和治疗
HUVECs购买的基础医学研究所,中国医学科学院(中国,北京)。有限合伙人从收购Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。SRT1720和ex - 527买来MedChemExpress(美国普林斯顿,纽约)。Pue ( )购自中国医学资源中心、中国中医科学院(中国,北京)。
细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(美国卡尔斯巴德DMEM, Gibco)含10%胎牛血清(Gibco)和100年μg / mL penicillin-streptomycin (Gibco)。细胞通过使用trypsin-EDTA (Gibco)。这些细胞被孵化在37°C,湿度95%,和5%的公司2。媒介是每2天更新。HUVECs使用到通道5 (62年]。与10 HUVECs被激活μ为24小时(g / mL有限合伙人63年),使用10、20、50、100或150 mg / L Pue LPS诱导前24小时。表示,HUVECs孵化ex - 527 (MedChemExpress) 6 h与SRT1720活动或抑制sirt - 1基因(MedChemExpress) 6 h激活sirt - 1基因。
4.2。CCK-8化验
HUVECs决心是处于良好状态,总细胞覆盖率超过90%。细胞被洗的磷酸盐(PBS, Gibco),然后用胰蛋白酶消化。消化是通过添加新鲜完整的DMEM终止,然后细胞数。细胞被播种到12-well板(50000个细胞/)和孵化12 h。中被丢弃,PBS的细胞被冲洗两次,然后粘附细胞在倒置显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。细胞代谢活动作为细胞生存能力的指标是衡量CCK-8文章。
4.3。线粒体膜电位(MMP)
MMP的HUVECs测量使用JC-1染料(MedChemExpress)。与PBS HUVECs洗了三次,然后沾JC-1染料30分钟在黑暗的房间里。HUVECs然后用PBS洗了三次,和线粒体膜电位的图像捕获使用尼康A1激光共焦显微镜(尼康,千代田,日本)。
4.4。激光共焦显微镜
HUVECs与4%多聚甲醛固定10分钟,用PBS三次,和阻塞在冰上PBS 30分钟。HUVECs被孵化主要抗体(myosin-VI Abcam,剑桥,英国)在4°C对Tom20过夜。与PBS三次洗涤后,这些细胞被沾Alexa萤石- 594共轭山羊anti-mouse二级抗体在4°C 1% BSA / PBS 1 h。核沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),使用尼康A1共焦显微镜图像被抓获。
4.5。ELISA定量分析
细胞与0.25%胰蛋白酶消化PBS根据制造商的指示。草皮,谷胱甘肽,GPx、il - 10的地震,TNF -α内容被发现使用分析工具。
4.6。定量实时聚合酶链反应
总RNA隔绝HUVECs使用Quick-RNA Microprep工具包(Zymo研究、欧文、钙、美国)。iScript cDNA合成装备(美国Bio-Rad大力神,CA)用于反向转录150 - 250 ng总RNA为互补DNA(互补)。ddH的互补脱氧核糖核酸样本稀释10倍2啊,和实时定量PCR (qPCR)进行LightCycler 480仪器使用2μL的互补。使用2相对基因表达进行了计算−ΔΔCt方法(64年]。
4.7。细胞呼吸化验
XFp细胞外磁分析器(美国海马生物科学、北Billerica MA)按照制造商的指示使用分析完整细胞的耗氧速率(OCR)。短暂,HUVECs接种 细胞/。结果归一化到实际的细胞数量确定后立即获得OCR录音。
4.8。统计分析
所有统计分析使用统计产品与服务解决方案(SPSS) 22.0软件包(美国、IBM公司,纽约Armonk)和GraphPad Prism 7.0版(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有的数据表示为 由方差分析评估; 被认为是具有统计学意义。正态分布的数据证实了Shapiro-Wilk测试。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
残雪,WX搜索相关文章。ZT型和残雪主要开展实验工作。MQY、YPZ LDZ, LD整理所有的相关文章。CX和ZXT写的手稿。所有作者评论的手稿。兴城古城和tianzhang co-first作家,本文做出了相同的贡献。
确认
我们要感谢Editage (https://www.editage.cn)英语编辑。这项研究得到了广东省自然科学的基本项目,研究“钙化悖论”通过SphK1 / S1P机制,四氢呋喃,(2020 a1515010245)和中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委,Nos。82004233)。兴城古城和Tianzhang co-first作者和本文做出了相同的贡献。