文摘

三羧甲基化茯苓多糖(PCP-C1 PCP-C2和PCP-C3)羧基含量为6.13%,10.24%,和16.22%,分别获得了carboxymethylation最初的多糖(PCP-C0), 4 kDa的分子量和羧基(羧基)含量为2.54%。PCP-Cs的结构由红外光谱特征,1H核磁共振,13C NMR光谱。四个PCP-Cs表现出抗氧化活性和清除自由基的能力(羟基和DPPH)和螯合亚铁离子与carboxymethylation的程度呈正相关。PCP-Cs羧基组的内容的增加,他们的调节能力的增长草酸钙(草酸钙)晶体增强,从而抑制一水草酸钙的(COM)晶体的生长和诱导形成的二水草酸钙(COD)晶体。形成草酸钙晶体更圆钝,ζ电位的绝对值在晶体表面增加,抑制和晶体之间的聚合。热重量分析曲线表明,PCP-C0的比例,PCP-C1, PCP-C2, PCP-C3纳入晶体分别为20.52%,15.60%,10.65%,和9.78%,分别在0.4 g / L PCP-Cs的存在。PCP-C保护抵抗氧化损害人类的肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)引起的草酸,导致增加细胞生存能力和超氧化物歧化酶活性和减少活性氧水平,丙二醛含量,8-hydroxy-deoxyguanosine表达式。因此,PCP-Cs,尤其是PCP-C3,可以抑制草酸钙晶体的形成,可能有潜力成为一个替代antistone药物。

1。介绍

肾结石是一种非常常见的疾病,被认为是遗传和环境因素之间的相互作用的结果。大约80%的草酸钙肾结石的石头(草酸钙),和两个主要形式是一水草酸钙(COM)和二水草酸钙(COD) (1]。COM更有可能损害肾脏上皮细胞(2];细胞损伤会促进成核、成长、聚合和粘附的晶体表面(3),从而增加形成肾结石的风险。

多糖广泛存在于植物、动物和微生物。天然多糖具有抗氧化、抗糖尿病的抗肿瘤等生物活性。多糖的生物活性通常与他们的分子量、链结构,特别是活动组的数量(4,5]。

《生物高分子(如多糖)富含酸性阴离子组可以作为有效的抑制剂草酸钙结石的形成。Zhang et al。6发现0.5 g / L海藻多糖可以抑制COM晶体的生长和聚集,诱导形成的球形COD晶体;晶体成核和聚合的抑制率分别为69.2%和76.8%,分别。

多糖的生物活性密切相关的内容酸性组(7- - - - - -10]。徐et al。9两个多糖提取E。湿疣;中性多糖EAP-1N糖醛酸含量0.32%,和酸性多糖EAP-2A糖醛酸含量的9.46%。EAP-2A有较强的清除自由基的能力,增强抗氧化酶的活动(包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)),和抑制脂质过氧化作用。黄等。10)五种植物多糖的影响相比(pps)羧基含量为6.3%,8.9%,9.1%,13.6%,和16.1%,分别对草酸钙晶体的生长;pps的抑制草酸钙生长和聚集,诱导鳕鱼形成呈正相关,多糖中的羧基组的百分比。

化学改性多糖表现出更强的生物活性比天然多糖(11- - - - - -15]。王等人。11)修改茯苓多糖carboxymethylation和报道,最高的多糖carboxymethylation亚铁离子螯合能力最高程度最高的清除羟基自由基的能力。王等人。13准备羧甲基化多糖(CATP)银耳多糖(ATP),发现CATP抗氧化活性和改善水溶性明显高于ATP。李等人。15]hypercholesterolemic老鼠与高剂量的治疗羊肚菌angusticeps派克多糖(PMEP)及其羧甲基化多糖(CPMEP)和报道,大鼠的血清总胆固醇水平是1.54和1.29更易与L,分别;因此,CPMEP具有较强的降胆固醇活性和可以上调的蛋白表达CYP7A1 LDL-R鼠肝脏,下调表达β-,改善其降胆固醇的能力。

P。可可多糖(PCP)的一个主要组成部分P。可可(16),可以用于治疗慢性胃炎、肾病,头晕和呕吐17]。卡式肺囊虫肺炎主要由四个单糖,即葡萄糖,D-mannose, D-fucose, D-xylose [18,19]。王等人。20.)发现,卡式肺囊虫肺炎由超声波提取有能力减少电力和清除羟基和DPPH自由基。吴et al。21)表明,卡式肺囊虫肺炎可以抑制acetaminophen-induced小鼠肝损伤,降低血清肝酶的水平(ALT)、乳酸脱氢酶(LD)和炎性细胞因子(TNF -α,il - 6)。

在这项研究中,三个羧甲基化多糖(PCP-C1、PCP-C2 PCP-C3)羧基含量为6.13%,10.24%,和16.22%,分别被carboxymethylation的获得云苓多糖(PCP-C0)最初的羧基含量为2.54%。抑制草酸钙晶体形成的影响,研究了体外获得潜在anticalculus多糖药物。

2。实验方法

2.1。材料和设备
2.1.1。材料

茯苓多糖(PCP-C0)是由陕西Ciyuan生物公司,多糖 ;蛋白质Sevag呈现在多糖的方法;治疗后的多糖chloroform-n-butanol混合解决方案,免费的蛋白质变性成不溶性的物质达到分离的目的(22]。磷酸盐溶液(PBS),吩嗪1 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),邻二氮杂菲和其他常规试剂均为分析纯,购自广州化学试剂公司(广州)。细胞计数Kit-8 (CCK-8)从Dojindo购买实验室(熊本、日本)。2 ,7 - - - - - -Dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)从上海购买Beyotime生物科技有限公司(上海,中国)。malonaldehyde (MDA)装备和超氧化物歧化酶(SOD)工具包是购自建成生物技术研究所(中国南京)。人类8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OHdG)酶联免疫试剂盒被波什生物技术(中国南京)。实验是重蒸馏的水。

2.1.2。装置

研究中使用的设备包括以下:傅里叶变换红外光谱仪(美国的那些时光,ir、Nicolet);核磁共振(瓦里安力量- 500兆赫,力量,德国);超声仪(与jp - 100);乌氏毛细管粘度计(0.4 - -0.5,Qihang玻璃仪器工厂,上海,中国;热重分析仪(TGA / DSC 3 +,梅特勒-托利多(美国);D / max 2400 - x -射线粉末衍射仪(Rigaku、日本);场发射扫描电子显微镜(ULTRA55、蔡司、德国);最适条件- 2000 - dv电感耦合等离子体(ICP) (PerkinElmer ICP - aes,最适条件2000 dv, CT,美国);Zetasizer 300 hs纳米size-Zeta潜在分析仪(英国莫尔文);和酶标记工具(赛菲尔2、Tecan、瑞士)。

2.2。Carboxymethylation和表征茯苓多糖(PCP-C0)
2.2.1。Carboxymethylation PCP-C0 [23- - - - - -25]

300毫克PCP-C0悬浮在15毫升的异丙醇,在室温下搅拌15分钟,慢慢添加10毫升的30%氢氧化钠溶液,搅拌50°C水浴1 h,然后添加2.63克一氯醋酸,然后加热60°C 2 h。冷却到室温后,调整与0.5 mol / L盐酸中立,透析与蒸馏水(Mw保留3000 Da) 3天,集中和冷冻干燥得到羧甲基化多糖(PCP-Cs)与不同程度的替代。

2.2.2。PCP-Cs羧基含量的测定(26]

羧基含量PCP-Cs由电导滴定的方法决定。电导滴定曲线的绘制使用电导率值作为 - - - - - -轴,用氢氧化钠卷 - - - - - -轴。电导滴定曲线,氢氧化钠polysaccharide-COOH所消耗的体积,计算和羧基的百分比。每个实验重复三次。

2.2.3。傅立叶变换红外光谱表征PCP-Cs

多糖的红外光谱测定使用电影由2.0毫克干PCP-C样本和200毫克KBr的波数范围4000 - 400厘米1。

2.2.4。1H和13PCP-Cs C NMR表征

大约20毫克的干PCP-C样品溶解在0.5毫升的水氘(D2在一个核磁共振管O)。完全溶解后,多糖样品放入磁场核磁共振波谱仪的检测。

2.3。抗氧化活性检测PCP-Cs
2.3.1。氢氧自由基(⋅哦)清除能力

的⋅哦在体外检测多糖体外清除能力的H2O2/铁系统方法(27]。加1毫升2.5 L FeSO更易4解决方案和1毫升2.5 L更易与邻二氮杂菲解决试管,然后添加PBS(20更易/ L, 1毫升, )和1毫升20更易与L H2O2按顺序,最后用1毫升的不同浓度的多糖样品(0.15,0.5,0.8,1.0,2.0,和3.0 g / L)进试管。在37°C混合好后,孵化90分钟,用紫外分光光度计测量吸光度在536海里;平均吸光度 。每个实验重复三次。过氧化氢(H时的吸光度2O2)和多糖溶液被替换为蒸馏水 。多糖溶液的吸光度与蒸馏水代替 。抗坏血酸(VC)作为阳性对照组。清除羟基自由基的能力计算使用以下方程:

2.3.2。DPPH自由基清除能力(28,29日]

0.4更易/ L DPPH由无水乙醇,和3毫升PCP-C (0.15 3 g / L)多糖是混合着DPPH(0.4更易/ L, 1毫升)。混合物在黑暗中孕育了30分钟的25°C。吸光度检测在517海里,以反映多糖的DPPH自由基清除能力。每个实验重复三次。 在哪里 是3毫升样品溶液的吸光度+ 1毫升DPPH试剂, 是3毫升样品溶液的吸光度+ 1毫升无水乙醇,然后呢 的吸光度1毫升DPPH解决方案+ 3毫升水。

2.3.3。亚铁离子螯合能力(30.]

1毫升PCP-Cs (0.15 - -3.0 g / L)和2.25毫升蒸馏水和0.05毫升2.0更易与L氯化亚铁溶液,分别反应持续30年代。接下来,该解决方案是混合0.2毫升5.0更易/ L吩嗪和反应在室温下10分钟,混合物的吸光度测量在562海里。实验用水代替多糖溶液和氯化亚铁溶液为空白组和对照组。EDTA-2Na作为阳性对照组。低吸光度显示较强的螯合亚铁离子的能力。每个实验重复三次。 在哪里 空白组的吸光度, 样本组的吸光度, 是对照组的吸光度。

2.4。监管PCP-Cs(草酸钙晶体生长的31日]
2.4.1。草酸钙晶体的合成

草酸钙亚稳的解决方案是进行50毫升容量瓶通过添加3.0毫升10更易与L CaCl2和1毫升0.50 mol / L氯化钠;然后,添加一定量的PCP-C解决方案使多糖的最终浓度:0.05,0.1,0.2,0.4,和0.8 g / L,大约45毫升加蒸馏水,然后添加3.0毫升10更易与L Na2牛,最后稀释体积与蒸馏水规模。因此,解决方案获得 和 。水晶被0.22过滤μ米微孔膜。上面的草酸钙溶液注入结晶的50毫升烧杯和一个干净的载玻片放在烧杯的底部。为了防止过度饱和的系统由于挥发溶剂的水从驾驶晶体形成,晶体生长在静态条件下进行。晶体生长对3 d后,底物被带出干燥机和干。可溶性钙的浓度2 +浮在表面的离子是通过测量电感耦合等离子体发射光谱法(ICP)。

上述合成草酸钙晶体的特点是傅里叶红外(ir)、场发射扫描电子显微镜(SEM), x射线衍射(XRD)和Zeta电位计。

2.4.2。特征的扫描电镜

样本处理黄金喷雾和场发射扫描电子显微镜下观察形态学分析。

2.4.3。傅立叶变换红外光谱的表征

干草酸钙样品(2.0毫克)和KBr(200毫克),其次是与玛瑙研钵研磨制锭,扫描的红外光谱仪的波数范围4000 - 400厘米1。

2.4.4。x射线衍射的表征

分析了合成晶体的x射线衍射仪的测试条件下CuKα射线、石墨单色器,30 kV, 25马,扫描范围的5-60°,扫描速度8°/分钟,一步的宽度为0.02°/ s的定性和定量分析。

COM和鳕鱼的相对比例的内容在草酸钙沉淀通过计算 值方法(31日和鳕鱼的相对比例的内容: 在哪里 和 间距的强度吗 COM和 鳕鱼的晶体。

2.4.5。电动电势测定晶体表面

草酸钙晶体(1毫克)在3.0毫升的重蒸馏的水分散。超声破碎法10分钟后,发现电动电势与Zetasizer Nano ZS90装置25°C。

2.4.6。TGA晶体测定多糖含量

根据文献[26),草酸钙晶体形成的热重分析曲线多糖的存在与否是衡量一个梅特勒-托利多热分析仪氮气氛下从25°C到900°C的加热速度10°C /分钟。晶体中的多糖含量计算的热曲线。

2.5。细胞实验
2.5.1。细胞培养和细胞毒性检测PCP-Cs

HK-2细胞培养在DMEM-F12含10%胎牛血清(32]。细胞悬液(密度: 细胞/毫升)是细胞接种到96孔板组装成一个单层;PCP-C0, PCP-C1、PCP-C2 PCP-C3最终浓度为20、40、60、80和100μg / mL被添加到细胞,分别。24小时文化后,细胞生存能力被CCK-8测量。吸光度( )被酶以450海里读者根据设备测量方法,和细胞生存能力率计算。每个实验重复5平行井。

2.5.2。细胞生存能力检测(32]

汇合成单层细胞后,实验分为3组:正常对照组(1):只有无血清培养基添加;(2)受损组:2.8毫米的草酸钠补充道,为3.5 h和细胞受损;和(3)保护组:PCP-C0 PCP-C1, PCP-C2,和PCP-C3最终浓度为20,40岁,60岁,80年和100年μ添加了g / mL preprotect细胞12 h,紧随其后的是2.8毫米草酸受伤为3.5 h。孵化后上述团体12 h,添加10μL CCK-8试剂的每个好,孵化37°C 1.5 h。吸光度( )使用酶标记测量仪器在450海里。每个实验重复5平行井。细胞生存能力是决定使用下面的方程。

2.5.3。活性氧(ROS)水平检测(32]

细胞接种到12-well文化板块的浓度 细胞/毫升,1毫升/好。实验模型和分组一样CCK-8实验,和100年μ克/毫升PCP-Cs被用来保护细胞。这些细胞被沾染了2 ,7 - - - - - -dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA) 37°C为30分钟。PBS的细胞被洗了三次删除DCFH-DA不进入细胞。荧光显微镜下观察荧光强度也被标。每个实验重复三个平行井。

2.5.4。超氧化物歧化酶(SOD)活性检测

SOD活性评估使用商用设备基于羟胺的自氧化。实验模型和分组一样CCK-8实验,和100年μ克/毫升PCP-Cs被用来保护细胞。在指定的时间点,治疗细胞均质100年更易与L Tris-HCl缓冲和在10000转离心20分钟,然后SOD活性决心使用分析工具。上层清液的吸光度被标仪直接测量与参考波长560 nm 600海里。

2.5.5。丙二醛(MDA)检测

对脂质过氧化反应试验中,我们使用一个商业工具量化MDA的生成根据制造商的协议。实验模型和分组一样CCK-8实验,和100年μ克/毫升PCP-Cs被用来保护细胞。细胞被胰蛋白酶化收获,和细胞提取物是由声波降解法在冰冷的缓冲区(50毫米Tris-HCl, ,5毫米EDTA, 1毫米德勤)。声波降解法后,细胞溶解细胞在10000转离心20分钟移除碎片。MDA的上层清液受到测量水平检测吸光度在532海里。

2.5.6。8-Hydroxy-Deoxyguanosine (8-OHdG)检测

8-OHdG是一种常用的DNA氧化损伤的标志。实验模型和分组一样CCK-8实验,和100年μ克/毫升PCP-Cs被用来保护细胞。8-OHdG的浓度测量使用商业酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。颜色变化是衡量spectrophotometrically波长450纳米。

2.6。统计分析

正态分布的实验结果分析了Shapiro-Wilk测试。使用单向方差分析测试数据评估,紧随其后的是图基的多重比较检验正态分布。实验数据所表达的 。数据提出了个人价值观和评估利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验,其次是邓恩的多重比较检验后非正态的分布。如果 ,有显著差异;如果 ,差异非常显著;如果 ,没有显著差异。

3所示。结果

3.1。Carboxymethylation和表征P。可可多糖(PCP-C0)
3.1.1。多糖Carboxymethylation

carboxymethylation反应属于双分子亲核取代反应(SN2) (33]。首先,PCP-C0的羟基与氢氧化钠反应形成一个醇盐,和羧甲基组与醇盐反应形成羧甲基化多糖(PCP-C)(图1)。


图1
Carboxymethylation反应茯苓多糖。
3.1.2。PCP-Cs羧基含量的检测

羧基含量在每个羧甲基化多糖(PCP-C)是由电导滴定法。滴定曲线如图所示2(一个)。的羧基内容PCP-C0、PCP-C1 PCP-C2, PCP-C3分别为2.54%,6.13%,10.24%,和16.22%,分别。carboxymethylation修改后,多糖的分子量增加,但没有明显的改变多糖的分子量检测(34]。

(一)
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图2
PCP-Cs的表征。(一)滴定曲线检测四种多糖,羧基含量 和 。(b)四种多糖的红外光谱。(c, d)1H NMR光谱PCP-C0 PCP-C1。(e, f)13C NMR光谱PCP-C0 PCP-C1。
3.1.3。傅立叶变换红外光谱表征PCP-Cs

图2 (b)显示了傅立叶变换红外光谱和不同程度的carboxymethylation PCP-Cs。强吸收带为3428.1厘米1对应的伸缩振动吸收峰在多糖-哦。2930.2厘米的吸收带1对应于碳氢键的伸缩振动。峰值为1600厘米1对应的伸缩振动C-H-O和切断债券。峰值为1428.6厘米1羧基的伸缩振动。吸收1500 - 1000厘米1是由于环氧振动、正侧组伸缩振动和C-O-C糖苷键振动(35]。峰值为1032.4厘米1对应的伸缩振动葡萄糖残基的吡喃糖环19]。

PCP-C0 carboxymethylation之后,一个新的吸收峰出现在1326.5厘米1的吸收峰,这属于羧甲基(ch2羧基)。根据carboxymethylation反应(图1),ch的替换2羧基发生在-哦群多糖和表现为一个新的吸收峰附近的1326.5厘米1,从而确定成功carboxymethylation [36]。

3.1.4。1PCP-Cs H NMR表征

在1H NMR谱PCP-C0(图2 (c)),δ5.14,3.98,3.67,3.58,3.81,和3.66 ppm属于信号峰值的h - 6α-D-Gal;δ4.95,3.59,3.98,3.89,4.08,和1.14 ppm属于信号峰值的h - 6α- (1 - 6)-L-Fuc(表1);δ4.95,3.88,3.75,3.89,4.08,和1.14 ppm属于信号峰值的h - 6α- (1 - 3)-L-Fuc;δ4.71 ppm的h -对应信号的峰值β- (1 - 3)-D-Glc;和δ4.59 ppm的h -对应信号的峰值β- (1 - 3)-D-Gal [37,38]。与PCP-C0相比,1H NMR的羧甲基化多糖PCP-C1没有显示出新的强烈的信号峰(图2 (d))。

表1
化学变化对应1羧甲基化多糖PCP-C0 H NMR谱。
3.1.5。13PCP-Cs C NMR表征

在13C NMR谱PCP-C0(图2 (e)),强烈的信号δ102.53,74.12,95.89,69.58,75.74,和60.75 ppm属于颈- 1的其他信号的峰值β- (1 - 3)-D-Glc(表2);δ103.7,73.5,86.9,69.1,77.0,和61.6 ppm属于颈- 1的其他信号的峰值β- (1 - 3)-D-Gal;δ73.6,67.0,70.5,和61.3 ppm属于其他信号峰值的颈- 3α-D-Gal;δ98.2,67.7,70.5,71.6,67.3,和15.8 ppm属于颈- 1的其他信号的峰值α- (1 - 6)-L-Fuc;和δ98.2,67.0,69.7,71.6,67.3,和15.8 ppm属于颈- 1的其他信号的峰值α- (1 - 3)-L-Fuc [19,37]。

表2
化学变化对应于13C NMR光谱羧甲基化多糖(PCP-Cs)。

主要的信号13C NMR谱PCP-C1 102.8(颈- 1),79.2(颈),74.8 (C - 5), 73.1 (C - 2), 69.6 (C - 4), 60.9(其他)和177.8 ppm(即)(图2 (f))。在71.2和73.1 ppm信号分配给羧甲基取代基的亚甲基碳原子。信号增加70.6 ppm和减少60.7 ppm,表明羧甲基取代的出现在其他位置36,37]。为13羧甲基化多糖PCP-C1 C NMR,一个新的信号峰值出现在177.8 ppm,这属于C = O羧甲基组(ch的债券2羧基);这一发现可以用作carboxymethylation反应的证据,与先前的报告相一致(23,36]。

3.2。抗氧化能力的PCP-Cs
3.2.1之上。清除能力⋅哦,激进分子

⋅哦,自由基可以引起组织损伤和细胞死亡,并导致许多疾病39]。因此,清除哦自由基抗氧化防御机制的重要特征之一。如图3(一个)PCP-Cs的浓度增加,删除的能力⋅哦,增加。在同一浓度,carboxymethylation程度越高,多糖就会越强。

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图3
抗氧化活性不同的羧甲基化茯苓多糖(PCP-Cs)。(一)PCP-C OH自由基的清除能力。(b) PCP-C DPPH的清除能力。(c) PCP-C螯合铁的能力2 +。
3.2.2。DPPH自由基清除能力

DPPH自由基有特征吸收峰在517海里。当DPPH DPPH-H非自由激进的形式减少了一种抗氧化剂,紫色的DPPH自由基消失,导致吸光度下降(40]。PCP-Cs的DPPH自由基清除能力也有浓度效应(图3 (b)),PCP-C3 carboxymethylation度最高的清除能力最强。

3.2.3。对亚铁离子螯合效应

过渡金属离子,如铁2 +和铜2 +,可以促进连锁反应,生成自由基,导致细胞氧化损伤(30.]。螯合金属离子可以中断链式反应,防止氧化损伤。考虑到铁2 +具有较高的活动,这个离子螯合能力常被用来评估多糖的抗氧化能力。如图3 (c),当浓度3 g / L, PCP-C0的螯合能力水平,PCP-C1 PCP-C2, PCP-C3菲2 +是46.9%、51.5%、61.9%和63.7%,分别,PCP-C3最强的螯合能力。

上述三个实验结果表明carboxymethylation修改的原始PCP-C0提高多糖的抗氧化能力。

3.3。PCP-Cs引起的草酸钙晶体结构的表征
3.3.1。XRD表征

四种PCP-Cs的影响与不同羧基含量对草酸钙晶体的形成进行了研究。图4(一)显示了x射线衍射模式的草酸钙晶体形成的0.4 g / L PCP-Cs的存在。晶面间距的衍射峰 ,0.364、0.296和0.235 nm属于 , , ,和 水晶飞机一水草酸钙(COM),分别。的山峰 ,0.441,0.277,和0.224 nm属于的衍射峰 , , ,和 水晶飞机二水草酸钙(COD),分别为(41]。

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图4
XRD谱(a)和鳕鱼百分比含量(b)的草酸钙晶体形成的PCP-Cs不同羧基含量。(一)PCP-C0。(B) PCP-C1。(C) PCP-C2。(D) PCP-C3。多糖浓度:0.4 g / L。

根据定量计算 值方法(12,26)表示,随着PCP-Cs的羧基含量增加,鳕鱼的百分比在晶体引起PCP-Cs逐渐增加(图4 (b))。鳕鱼的比例由0.4 g / L PCP-C0 PCP-C1, PCP-C2, PCP-C3分别为45.7%,76.4%,82.7%,和100%,分别。

与PCP-C1作为代表,监管多糖浓度对草酸钙晶体形成的影响进行了研究(图5(一个))。在多糖的缺席,只有COM的衍射峰出现。添加多糖诱导鳕鱼的形成。随着PCP-C1浓度增加,衍射峰的强度由于COD晶体的不断增加,表明多糖引发的鳕鱼的比例增加。定量计算还表明,在0.05,0.1,0.2,0.4,和0.8 g / L PCP-C1,鳕鱼的内容形成草酸钙晶体的15.4%,37.4%,48.4%,74.7%,和100%,分别为(图5 (b))。

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图5
XRD谱(a)和鳕鱼百分比含量(b)的草酸钙晶体形成PCP-C1与不同浓度的存在。(一)0,0.05 (B), 0.1 (C), 0.2 (D), 0.4 (E), (F) 0.8 g / L。山峰的1、2、3、4属于( ), ,( ),和 水晶飞机的COM晶体 ,分别为0.364、0.296和0.235 nm。1的山峰 ,2 ,3 ,和图4 属于 , , ,和 COD晶体的晶体表面 ,分别为0.442、0.278和0.224 nm。
3.3.2。傅立叶变换红外光谱表征

傅立叶变换红外光谱检测进一步支持监管PCP-Cs对草酸钙晶体形成的影响(图6(一))。没有的多糖,得到了下面的山峰:羰基不对称伸缩振动 草酸钙晶体的1620厘米1、对称伸缩振动 在1316厘米1,伸缩振动峰在3492 - 3062厘米1,属于地结晶水的债券。这一发现表明,草酸钙形成的是纯COM晶体(42]。

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图6
傅立叶变换红外光谱(a)和变化的主要吸收峰波数(b)规定产生的草酸钙晶体的PCP-Cs不同羧基含量。 。

PCP-Cs被添加后, 和 不同程度的光谱图进行一个蓝色的转变与羧基含量增加PCP-Cs(图6 (b))。特别是, 从1624厘米逐渐转变1到1644厘米1和 从1320厘米逐渐转变1到1329厘米1,这表明草酸钙晶体的COM比例不断减少,而鳕鱼比例逐渐增加。考虑到 和 鳕鱼是1644和1329厘米1(41,43),分别的蓝移值 和 取决于鳕鱼的混合物的比例。

在指纹区,发现了COD晶体的吸收光谱在922和622厘米1不同于那些COM(959、887和667厘米1),其中887和667厘米1属于COM碳碳伸缩振动和O-C-O平面弯曲振动,分别为(43]。

图7(一)显示了草酸钙晶体形成的傅立叶变换红外光谱在不同浓度PCP-C1的存在。随着PCP-C1浓度的增加从0.05 g / L 0.8 g / L, 和 不断蓝移(图7 (b)), 从1619厘米1到1644厘米1和 从1316厘米1- 1329.5厘米1。PCP-C1的浓度越高,比例越高导致草酸钙晶体的鳕鱼。

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(b)
图7
傅立叶变换红外光谱(a)和变化的主要吸收峰波数(b)生成的草酸钙晶体的监管与不同浓度PCP-C1的存在。 。
3.4。监管PCP-Cs草酸钙形态

图8(一个)显示了扫描电镜的图像PCP-Cs草酸钙晶体形成的不同。在多糖的缺乏,大多数晶体形成的COM晶体(图4(一)),它有锋利的边缘和高聚合度。添加0.4 g / L PCP-Cs之后,COD晶体形成。PCP-Cs carboxymethylation度增加,不仅鳕鱼的内容增加了,而且鳕鱼的形状逐渐改变了通常的正方双锥体形状圆钝草帽形状;与此同时,鳕鱼PCP-C3引起圆盘状。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
扫描电镜的图像PCP-Cs的草酸钙晶体形成的监管。(一)PCP-Cs羧基含量对草酸钙形态的影响。(b) PCP-C1浓度对草酸钙形态的影响。PCP-C0 (a) (a)、(B) PCP-C1, (C) PCP-C2, PCP-C3 (D)。多糖浓度:0.4 g / L。0,(b) (A) (b) 0.05, 0.1 (C), 0.2 (D), 0.4 (E), (F) 0.8 g / L。

草酸钙晶体形成的形态通过调整PCP-C1浓度如图8 (b)。PCP-C1浓度的增加从0.05 g / L 0.8 g / L,鳕鱼的晶体的比例逐渐增加,晶体变得圆润,直言不讳,晶体表面变得平滑,水晶分散性提高。

3.5。PCP-Cs对晶体的电动电势的影响

粒子表面电荷密度高的有一个很大的ζ电位的绝对值和粒子之间的静电斥力,它很难聚合,它是在溶液中稳定43]。生成的草酸钙晶体的ζ电位不同的PCP-Cs如图9(一个)。PCP-Cs与羧基含量从2.54%增加到6.13%,10.24%,和16.22%,从-4.66 mV电动电势下降到-5.82 mV, -8.35 mV,和-12.7 mV;即。,the higher the -COOH content of polysaccharides is, the larger the absolute value of the Zeta potential on the surface of the CaOx crystal induced. This finding indicated that the more negatively charged PCP-C molecular weight was adsorbed on the crystal surface. For the same polysaccharide PCP-C1, the absolute value of the Zeta potential increased with increasing concentration (Figure9 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
ζ电位的形成草酸钙晶体由PCP-Cs规定。(a)的羧基含量PCP-Cs电动电势。(b)在电动电势PCP-C1浓度的影响。
3.6。PCP-C增加可溶性钙2 +浓度和减少草酸钙沉淀

如图10 ()草酸钙沉淀的摩尔量( )生成的不同PCP-Cs低于空白组(22.5μ摩尔), 在PCP-C3最少(9.8μ摩尔)。在不同的PCP-Cs,可溶性钙的浓度2 +离子( )在上层清液大于空白组(16.5μmol / L)(图10 (b))。羧基的多糖含量越高,就越大 在上层清液。

(一)
(一)
(b)
(b)
图10
羧基含量的多糖对草酸钙沉淀的摩尔量和可溶性钙的浓度2 +在上层清液。(一)摩尔量的草酸钙沉淀。(b)可溶性钙离子浓度。 。

验证结果在图的可靠性10,我们计算摩尔的可溶性钙量的总和2 +在上层清液( )和摩尔的Ca2 +在草酸钙沉淀( )(表3)。获得的总摩尔量的Ca2 +离子在每组是30.7 ~ 33.1μ摩尔,摩尔总额一致的钙在反应物(30.0μ摩尔)。

表3
PCP-Cs对草酸钙晶体的影响阶段,可溶性Ca2 +在溶液中离子浓度、草酸钙沉淀的质量。
3.7。草酸钙晶体的热重量分析

如图11,空白组中获得的草酸钙晶体的分解没有多糖分为三个步骤,和体重百分比是12.18%(阶段),8.33% (C阶段),和28.99% (D)阶段,符合理论重量损失值的12.33%,19.17%,和30.12%的COM (CaC2O4·H2O)分解成CaC2O4,CaCO3和曹44]。


图11
草酸钙晶体形成的热重分析曲线0.4 g / L PCP-Cs,分别。

然而,TGA曲线的草酸钙晶体形成后添加0.4 g / L PCP-C1不同于空白组由于COD晶体的形成引起PCP-C1和合并的PCP-C1晶体。多糖的草酸钙晶体诱导失去自由水和水晶25°~ 128°C(节)。当温度继续上升到200°~ 400°C(部分B),多糖分子吸附在晶体将进行热分解(45]。当温度达到741°C(部分E),草酸钙样品基本上是分解,和最后的重量百分比残留的草酸钙晶体受PCP-C0, PCP-C1, PCP-C2, PCP-C3分别为28.72%,29.60%,30.95%,和31.16%,分别。

空白组获得的晶体没有多糖表现出热重损失在200°~ 400°C (B),而引起的晶体PCP-Cs进行热分解;因此,减肥在这个阶段可以被认为是多糖损失(45),也就是说,多糖的重量纳入水晶。基于阶段B图11PCP-C0的比例,PCP-C1、PCP-C2 PCP-C3纳入晶体分别为20.52%,15.60%,10.65%,和9.78%,分别和分解温度分别为205.10°C, 212.00°C, 212.67°C,分别和212.05°C。PCP-C3 carboxymethylation程度最高,最低的比例纳入晶体和分解温度高于原来的卡式肺囊虫肺炎,表明PCP-C3更具体与晶体的交互和更强的约束力。鉴于PCP-Cs的掺入使“PCP-C水晶”样品的分解温度高于纯COM示例中,“PCP-C水晶”加热的稳定性高于纯水晶,而多糖。

3.8。毒性的评估PCP-Cs HK-2细胞

CCK-8方法被用来检测PCP-Cs的毒性不同羧基含量HK-2细胞(图12(一个))。HK-2与PCP-Cs互动24 h后,细胞生存能力100%以上。因此,PCP-Cs HK-2上没有造成细胞毒性细胞,促进细胞生长。

(一)
(一)
(b)
(b)
图12
CCK-8方法检测HK-2细胞生存能力。(一)PCP-Cs与不同浓度的细胞毒性。(b)草酸HK-2细胞受到的可行性有或没有PCP-C保护。NC:正常对照组;DC:损伤对照组。草酸浓度:2.8毫米。受伤时间:3.5小时。保护时间:12 h。与损伤组相比: ; 。
3.9。PCP-C HK-2保护细胞免受伤害

图12 (b)显示了HK-2细胞生存能力的变化与不同的羧甲基化PCP-Cs preprotection之前和之后。2.8毫米草酸氧化损伤后,细胞活性下降从对照组的100%到56.6%。然而,不同浓度的PCP-C preprotection,受伤的细胞生存能力组显著高于受伤的组。

同样的多糖 ,的preprotection PCP-Cs显示浓度效果;即。,the higher the concentration of PCP-Cs is, the better the protection effect will be.

在同一浓度,不同多糖保护组织的细胞生存能力之后的顺序PCP-C0 < PCP-C1 < PCP-C2 < PCP-C3;即。,PCP-C3 with the highest -COOH content had the best protection effect. At 100 μg / L, PCP-C3保护下的细胞活性达到90.3%。

3.10。PCP-C保护减少活性氧(ROS)生产草酸所致

图(13日)显示了HK-2细胞ROS水平变化前后PCP-C preprotection。在正常组织细胞越来越紧密,ROS最低的荧光强度,减少ROS。草酸ROS荧光在细胞受到的强度明显提高。100年之后μg / mL四PCP-Cs preprotected,细胞内ROS的荧光强度弱,这是在正常组和保护组(图13 (b)),这表明PCP-Cs后从草酸可以抵御氧化损伤的保护。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图13
之前和之后PCP-Cs保护对活性氧的影响在HK-2细胞表达。(a, b) PCP-Cs羧基含量的影响。多糖浓度:100μ克/毫升。(c) PCP-C1浓度的影响。NC:正常对照组;DC:损伤对照组。草酸浓度:2.8毫米。受伤时间:3.5小时。保护时间:12 h。

同时,preprotection效应与不同浓度PCP-C1 HK-2细胞也被标(图13 (c))。与PCP-C1浓度的增加,细胞的活性氧水平逐渐降低,表明PCP-C1具有保护细胞浓度的影响。

3.11。PCP-C保护增加抗氧化能力,减少氧化损伤

降低SOD活性的生物意味着自由radical-induced损伤机体抵抗能力降低。oxalate-damaged组中的SOD活性下降 控制的价值。PCP-C0保护后,PCP-C1、PCP-C2 PCP-C3, SOD活性增加到49.22%,64.78%,74.57%,和84.18%,分别为(图(14日))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图14
前后PCP-Cs保护对SOD活性的影响(a), MDA含量(b),和8-OHdG表达在HK-2细胞(c)。NC:正常对照组;DC:损伤对照组。草酸浓度:2.8毫米。受伤时间:3.5小时。保护时间:12 h。与损伤组相比: ; 。

MDA含量的变化通常揭示体内脂质过氧化水平,间接反映出细胞损伤的程度。草酸后被用来损害细胞,MDA含量增加到222.84%的对照组。PCP-C-protected组MDA含量明显降低;发布内容是降低到197.97% (PCP-C0), 164.84% (PCP-C1), 132.68% (PCP-C2)和117.65% (PCP-C3对照组(图)14 (b))。PCP-C3羧基含量最高的能力最强的抑制MDA释放。

8-OHdG的浓度被认为是氧化DNA损伤的标志。8-OHdG表达式很低在正常控制细胞(80.65 pg / mL)。oxalate-damaged组,8-OHdG表达明显增加到223.61 pg / mL。的表达水平8-OHdG PCP-C-protected组oxalate-damaged组相比明显减少。8-OHdG浓度下降到195.31 - -130.25 pg / mL(图14 (c))。PCP-C3羧基最高的内容提出了最优DNA保护能力。

4所示。讨论

4.1。Carboxymethylation修改P。可可多糖
以下4.4.1。反应条件的影响

Carboxymethylation PCP-C0包括两个步骤。首先,氢氧化钠与-哦多糖分子反应生成醇盐组PCP-C0;然后,羧甲基组成立于多糖醇盐和一氯醋酸(ClCH2羧基)的SN2反应(14,15]。的因素影响多糖的取代度carboxymethylation包括反应物浓度、温度和反应时间(表4)。在这个实验中,三羧甲基化多糖PCP-C1 PCP-C2, PCP-C3得到60°C通过改变反应时间和反应物浓度。羧基含量为6.13%、10.24%和16.22%,分别大于2.54%的初始多糖PCP-C0。段et al。33羧甲基化的天然多糖RNP提取黑醋栗水果。随着温度的增加从50°C到70°C,取代度增加从0.57到1.10,这可能是由于温度提高多糖醇盐的溶解度增加,导致多糖醇盐和ClCH之间更好的联系2羧基。当温度进一步上升,取代度下降,这是由于这一事实过高温度有利于副反应的发生。刘等人。46)修改Sarcandra glabra多糖通过carboxymethylation,发现反应时间的延长,carboxymethylation程度先增加,然后降低。延长反应时间有利于扩大和促进ClCH多糖2羧基进入多糖分子。然而,太长时间在高温下反应时间有利于副反应的形成产品,如羧甲。

表4
Carboxymethylation PCP-Cs条件和羧基含量的多糖。
4.1.2。羧甲基化多糖的结构鉴定

从1H NMR和13C NMR光谱(图2),PCP-C0是由葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、多糖主要残留α-D-Gal,α- (1 - 6)-L-Fuc,α- (1 - 3)-L-Fuc,β- (1 - 3)-D-Glc,β- (1 - 3)-D-Gal基本上是符合报告的结构Meikuang et al。47和王et al。19]。carboxymethylation之后,13C NMR PCP-C1显示一个新的吸收峰在177.8 ppm,这表明羧甲基组(ch的特征吸收峰2羧基)[23,48]。

傅立叶变换红外光谱表明,四个羧甲基化多糖的主链结构是相似的,但羧甲基化多糖有一个新的特征吸收峰在1326.5厘米1,这是归因于ch2羧基组。实验结果是一致的13C核磁共振的结果。

4.1.3。增强Carboxymethylation后多糖的抗氧化活性

Carboxymethylation改性可以提高多糖的抗氧化活性,这是与下列因素有关:(1)取代基的引入ch组2羧基多糖的配置变化,这会削弱氢键在多糖分子的离解能49),提高多糖的氢供应能力(2)多糖的生物活性水溶解度呈正相关。Carboxymethylation修改可以增加水溶性多糖(50),因此多糖的自由度增加,活动和发挥的能力更强(3)多糖有两种抗氧化活性的机制。一个是多糖抑制自由基的生成螯合过渡金属离子(如铁2 +和铜2 +离子)[51,52]。其他多糖可以提供单一的电子或氢原子的自由基,从而终止自由基连锁反应的目的,实现清除自由基。羧甲基化多糖的羧基含量显著增加,其螯合过渡金属离子的能力,并提供单电子或氢原子的增加,从而增加了抗氧化活性

施等。34)提取原始原油浒苔prolifera多糖(PE)的分子量1400 kDa,退化它获得一个低分子量多糖分子量的DPE 44 kDa,和羧甲基化DPE获得CDPE。DPPH的清除能力,羟基自由基清除能力,减少能力的三种多糖CDPE > DPE >体育。李等人。53)还表明,自由基清除能力和羧甲基化的总抗氧化能力退化海藻fusiforme多糖(CDPSSF)明显高于退化的多糖(DPSF);DPSF更高的抗氧化活性比nondegraded多糖(PSF)。

4.2。羧甲基化多糖具有较强的调节草酸钙晶体生长的能力

羧甲基化多糖可以显著抑制COM晶体生长,诱导COD晶体的形成,抑制晶体聚合(图15)。


图15
模型图的羧甲基化生物活性多糖(PCP-Cs)和监管对草酸钙晶体的影响。

首先,carboxymethylation之后,羧基在多糖含量的增加,复杂的大量的Ca2 +系统中离子抑制钙的结合2 +和牛2 -形成草酸钙沉淀。carboxymethylation的程度越高,抑制能力越强。

第二,Ca2 +高纯度离子多糖表面,形成一个高能源接口因为羧甲基化多糖增强能力,复杂的Ca2 +离子(54]。Ca后2 +离子吸附,其自由度减少和增加钙的能量状态,这有利于促进鳕鱼的形成(26]。

第三,热重分析的结果(图11)表明,PCP-Cs调节过程中草酸钙的生长,PCP-Cs被吸附或纳入草酸钙晶体(表5)。的吸附PCP-Cs导致高密度表面负电荷的积累的草酸钙晶体,导致电动电势的绝对值增加(图9),从而抑制草酸钙晶体的聚集。Zhang et al。6)表明,海藻多糖(SGP)可以显著抑制COM晶体的聚集;SGP的浓度的抑制率0.5 g / L的聚合COM晶体高达76.8%。

表5
TGA曲线分析,草酸钙晶体形成的0.4 g / L PCP-Cs和空白组,分别。

第四,Ca2 +离子,顶部边缘的水晶很容易协调与羧基多糖在溶液中由于dissociation-precipitation大量羧基团体之间的平衡在羧甲基化多糖和草酸钙晶体形成的。连续dissociation-precipitation终于使草酸钙晶体(图8)。鉴于锋利的COM晶体的损伤程度肾上皮细胞比生硬的鳕鱼的水晶和COM之间的亲和力与带正电的表面和受损的肾上皮细胞带负电荷的表面是高于COD晶体(53,54),鳕鱼更容易与尿液排泄出的身体。PCP-Cs诱导更甚至所有COD晶体的形成,从而减少草酸钙肾结石形成的风险。

如图8对照组明显的晶体粒度较小的最大过度饱和草酸钙在控制系统没有多糖和最大的晶体成核速率。修复草酸钙的总量的情况下,快速成核减少每个晶体的平均大小。这一发现也解释了为什么PCP-C3已经与草酸钙络合能力最强的,但引起的晶体粒度PCP-C3不减少;即。,the number of formed crystals is small, but the size is still large.

4.3。羧甲基化多糖具有较强的草酸防止肾上皮细胞毒性的能力

高层ROS可能与细胞内大分子反应迅速,损害正常细胞的功能,甚至导致细胞死亡(51]。增加SOD活性的生物意味着高能力抵制自由radical-induced损伤机体。MDA含量的变化揭示了脂质过氧化水平,间接反映出细胞损伤的程度。8-OHdG的浓度被认为是氧化DNA损伤的标志。后保护HK-2细胞不同程度的羧甲基化PCP-Cs,从草酸可以减轻氧化损伤,从而增加细胞的生存能力(图12 (b)(图)和超氧化物歧化酶的活动(14日)(图)和减少ROS水平13(图),MDA的内容14 (b)(图),8-OHdG表达式14 (c))。因此,PCP-Cs草酸可以保护HK-2细胞免受氧化损伤,提高细胞的抗氧化能力。PCP-C carboxymethylation更高程度有更强的保护能力。

Zhang et al。55]用凝血酶诱导炎症大鼠内皮祖细胞(EPC)和发现黄芪多糖(APS)对受伤的内皮祖细胞有保护作用。APS可以阻止核因子(NF -κBκB)信号在EPC,移植的表达血管内皮生长因子(VEGF)及其受体,抑制细胞间粘附的表达molecule-1 (ICAM-1)引起的凝血酶,从而保护细胞免受破坏。李等人。56]发现韭菜多糖(CCP)可以抑制氧化损伤小鼠的肾脏慢性肾功能衰竭(CRF)。硫酸多糖的松藻属脆弱多糖对H (CFCE-PS)保护作用2O2全身的细胞氧化stress-damaged [57]。被CFCE-PS保护后,细胞活力增强,细胞内ROS水平降低,抑制细胞凋亡。

我们的研究结果表明,羧甲基化PCP-Cs有能力抑制草酸钙草酸形成和抵御氧化损伤的体外。然而,更深入的分子机制和验证体内将来需要进一步研究。

5。结论

Carboxymethylation PCP-C0的羧基含量为2.54%,和三羧甲基化多糖与羧基含量为6.13%,10.24%和16.22%。与PCP-C0相比,羧甲基化多糖(PCP-Cs)可以显著增强其抗氧化能力,保护肾上皮细胞免受氧化损伤,抑制COM生长,诱导鳕鱼的形成,抑制晶体聚合,增加可溶性钙的浓度2 +离子在系统中,所有这些都有利于抑制草酸钙肾结石的形成。PCP-Cs carboxymethylation度增加,其生物活性逐渐增加。这项研究表明,carboxymethylation多糖是一种有效的方法来提高生物活性和anticalculus能力。carboxymethylation的程度越高,多糖的活性越强。

数据可用性

所有的数据支持本文中所示的结果,可以提供相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(21975105)和研发项目的项目关键字段的湖南(2020号sk2112)。