聚乳酸-羟基乙酸-（PLGA-）载顺铂纳米制剂作为乳腺癌治疗方法

摘要

尽管顺铂(独联体-二胺二氯铂II)和其他铂基化疗药物治疗实体肿瘤，它们的使用受到毒性和/或获得性耐药的限制。这些副作用对重症患者来说，剂量越大，就会出现危险问题。为了克服游离药物的低治疗率，研究了一种聚合物纳米颗粒给药系统，促进顺铂给药到肿瘤。最近，纳米颗粒(NPs)的应用被强调，因为它可以促进化疗药物在癌细胞中的作用。本项目旨在评估聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米颗粒(NPs)增强抗癌药物顺铂疗效的潜力。为此，我们合成了plga -顺铂纳米颗粒，提高其生物利用度，并研究了游离顺铂和plga -顺铂对MCF-7癌细胞株和HEK-293正常细胞株的细胞毒性比较。我们还分析了plga -顺铂诱导的细胞凋亡的特征。本研究的结果为将抗癌药物递送到其特定部位提供了可能，从而最大限度地降低毒性，优化药物疗效。

1.介绍

癌症已超过心脑血管疾病，成为全世界最主要的死亡原因[1- - - - - -3.］．因此，医疗保健系统的癌症超载持续增加，这需要更多的调查，以进一步推进这种致命疾病的早期和快速识别[4，5］．特别是乳腺癌(breast cancer, BC)是女性中常见的非皮肤性实体肿瘤，与肿瘤体积较大、分级较高、淋巴结浸润频繁有关，是女性死亡的主要原因[6- - - - - -8]尽管如此，由于雌激素代谢物水平升高，产生活性氧（ROS）并促使不受控制的DNA生成，不同年龄组的BC风险持续增加[9]。BC的发病率与多种因素有关，其中最常见的是其异质性[10］．肿瘤间/肿瘤内的异质性，通常影响乳腺的物理外观和分子多样性，在其组织学和分期中显示了关键作用[11］．BC的分子分层主要是基于激素受体的表达，即雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)，以及人表皮生长因子受体2 (HER2) [10，12，13］．由于其异质性，治疗是复杂的，治疗方法应谨慎[13］．

在过去的几十年中，癌症治疗的成功发明是在偶然发现癌症后使用金属基药物独联体pt (NH_3.）₂Cl₂已被广泛研究，并一直是治疗各种实体肿瘤的一线治疗方法[14- - - - - -16］．人们普遍认为顺铂是一种高效的模型化疗药物，通过干扰转录和/或DNA复制机制诱导细胞毒性[17］．顺铂药物与DNA形成DNA加合物的相互作用导致凋亡中涉及的众多信号转导通道的激活[18］．但是，也有一定的局限性即.严重毒性、内在和外在抗性以及患者依从性[19，20］．此外，顺铂由于分子量低，能在肿瘤细胞中保留较短时间，并容易进入血液循环，对正常细胞造成损害[21］．为了克服这些问题，采用了联合治疗的新策略，以改善顺铂对癌细胞系的药物传递特性[22，23］．它提供了将某种抗癌药物靶向递送到肿瘤部位的可能性，可以最大限度地降低毒性，优化药物疗效[24］．

到目前为止，已经采用了各种基于纳米载体的递送系统，如脂质体、胶束和树状大分子，允许更直接的药物释放[25- - - - - -27］．这些纳米颗粒修饰药物释放谱，以提高药物的生物利用度，因为它们能够在对周围健康组织的毒性最小的情况下，将有效载荷释放到特定的靶域。在众多的生物可降解聚合物中，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为药物载体广泛应用于临床药物，因为它是fda批准的共聚物[24，28].PLGA具有良好的降解特性，非常适合于亲水性或疏水性药物的缓释。此外，它们可以很容易地与特定的靶分子结合，并有可能改变其表面性质，改善与特定组织或细胞的相互作用[29］．最近，Domínguez-Ríos等人分析了与游离顺铂相比，HER2靶向卵巢癌的细胞毒性显著改善以及NPs内化增强[30］．类似地，Moreno等人评估了在活的有机体内顺铂PLGA纳米颗粒给荷瘤小鼠的疗效，这提供了一个有前景的顺铂载体，避免了其副作用而不降低疗效[31］．

为了在本研究中利用PLGA的优势治疗乳腺癌，我们选择PLGA纳米颗粒作为核心包封一种顺铂药物(图)1)，以便安全运送至目标地区。在体外在MCF-7癌细胞株上研究了该制剂的抗癌效果和细胞定位。我们假设给药通过调节肿瘤微环境，增加PLGA NPs对肿瘤细胞的渗透，从而提高抗癌效果。

2.材料和方法

2．1．化学物质

Poly(D, l -乳酸-co-glycolide) (PLGA, Resomer®RG 502 H Mw 7 - 17kda lactide):乙二醇50:50，酸端)，顺铂，二甲基甲酰胺(DMF)，聚乙烯醇(PVA, 9 - 10kda, 80%水解)，乙酸，对苯二胺(OPDA)，磷酸盐缓冲盐水(PBS)， 2-(N-morpholino)乙烷磺酸氯水(MES)均购自Sigma-Aldrich。细胞培养基的成分包括胎牛血清(FBS)、Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素-新霉素(PSN)抗生素鸡尾酒和乙二胺四乙酸(EDTA)，均来自Gibco (Grand Island, NY, USA)。抗体购自美国德克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotechnology和美国圣地亚哥的eBioscience。染料购自美国赛默费雪科学公司。所有其他的化学药品和溶剂(从Sigma-Aldrich公司购买的)在没有进一步处理的情况下使用。

2．2.plga -顺铂NPs的合成

通过纳米沉淀法，将27mg PLGA溶于最小量的DMF (2ml)中，通过涡流获得负载顺铂的NPs。在PLGA溶液中加入顺铂(10.5 mg)。然后，将该有机溶液滴加到早溶于去离子水(1% w/v)的PVA (20 mL)中，搅拌几分钟。多余的PVA和DMF通过10000 rpm (Thermo Sorvall Legend X1R)在20°C下离心30分钟去除。最后的颗粒在水中分散(8 mL)，然后在4°C下涡旋，直到在1小时内涂抹或冻干并保存一段时间[31］．

2．3.傅里叶变换红外光谱(FTIR)

记录FTIR光谱测量结果，以表征合成plga -顺铂中顺铂官能团的可能参与。plga -顺铂NPs的FTIR光谱由Avatar 330 FTIR光谱仪(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)在4,250-500 cm范围内获得⁻¹加入KBr颗粒后[32］．

２.４.原子力显微镜(AFM)

为了观察表面形态并测量所得PLGA顺铂NP的大小，应用AFM。将样品滴到新切割的云母片上并干燥过夜。使用配备Pico View软件的AGILENT-N9445A系列5500 AFM（AGILENT Technologies，Santa Clara，CA，USA）。

2．5．细胞培养

人胚胎肾细胞(HEK293)和乳腺癌细胞系(MCF-7)分别取自美国ATCC。这些细胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素鸡尾酒的DMEM中培养，在5% CO恒定的湿润培养基中₂在37°C。细胞播种用EDTA (0.52 mM)和胰蛋白酶(0.25%)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中完成，70 - 75%汇合。随后，将细胞置于必要浓度下，使其在进行实验前重新平衡[33］．

2.6.细胞活力的测定

MTT法[(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]测定细胞活力[34］．HEK293和MCF-7细胞以所需密度播种( 细胞/孔)在96孔板从各自的板。播种18 ~ 24 h后，细胞在0 ~ 50 (μg/mL），然后进行不同时间的初始筛选。治疗后，放置平板24小时 h在37°C的培养箱中，在加湿的CO中₂丰富的条件(5%)。孵育24 h后，96孔板每孔用PBS冲洗细胞。然后在每孔中加入MTT溶液，在培养箱中保留4 h，出现福马赞染料。然后用DMSO将福玛赞染料溶解，使用ELISA阅读器(EMax, Molecular Device, USA)在595 nm处测定吸光度[35］．从细胞活力的吸收强度来评估细胞增殖，方法如下:

在每一种情况下，plga -顺铂在细胞系中考虑之前被超声，以获得均质混合物。每次实验重复三次，以获得报道的生物学结果。

2.7。检测细胞凋亡/坏死

采用Annexin-V FITC/PI凋亡检测试剂盒(Calbiochem, CA, USA)检测坏死和凋亡细胞死亡。将MCF-7细胞置于6孔板中，然后在23时用plga -顺铂处理μ克/毫升。孵育12和24小时后，在结合缓冲液存在的情况下，用碘化丙啶(PI)和Annexin-V-FITC洗涤细胞并进行染色，按照制造商的协议[36］．使用流式细胞仪(BD LSRFortessa™San Jose, CA, USA)分析早期和晚期凋亡百分比、活细胞和坏死细胞。使用FlowJo (version 10.0)软件对采集的数据进行分析。

2.8.DNA片段分析

用不同浓度（0-40）的PLGA顺铂纳米粒处理细胞 μg/mL)，静置24 h。然后，根据制造商的程序，使用商业上可获得的试剂盒在405 nm处计算合成的片段DNA [37］．

2.9。评估细胞内ROS

细胞内线粒体ROS已按照先前报道的协议计算[38］．为了采用细胞间ROS，我们将处理过的MCF-7细胞与10μ米2 ，7 -二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA) 25分钟。然后用DAPI反染色10分钟，用延长抗褪色试剂(Molecular Probe, Eugene, OR, USA)固定玻片。随后，对载玻片进行共聚焦激光扫描显微镜(FV 10i, Olympus, Japan) [39］．DCF-DA荧光的变化用作细胞培养基础抗氧化试验中ROS形成的荧光指标。

2.10。顺铂体外释放

的在体外在pH为5.5、pH为10的条件下进行顺铂释放实验μg/mL含PLGA的顺铂。1 将mL PLGA顺铂装入透析袋中，然后分散在50%的溶液中 pH值的PBS毫升数 7.4在37°C下。此外，整个系统在130°C下转移 24转/分 h、 从上述分散液中提取2 h间隔，500 μ取L等分，用等量的新鲜PBS溶液替换，以保留相同的释放介质。在510 nm分光光度法测定顺铂的释放量[40］．

2.11。统计分析

数据表示为 多个数据点。使用OriginPro(8.0版)软件进行方差分析(ANOVA)计算差异的统计学显著性 被认为意义重大。

3.结果和讨论

3．1.plga -顺铂NPs的表征

将弱溶性和毒性药物包埋在聚合NPs中可提高其治疗和药效学性能，并减少其副作用[41］．顺铂易溶于水(0.23 g/100 mL水)，有机溶剂使其很难制备生产NPs所需的浓缩溶液。虽然众所周知DMSO是顺铂的良好溶剂，但也有报道称它会损害药物的细胞毒效，因此选择DMF作为有机溶剂制备NPs。

报道了顺铂包封后样品的红外光谱(图)2）.在3062-3465厘米处发现了两个高峰^－1(与-NH群的不对称和对称拉伸有关)和1600-1300厘米^－1(与HNH不对称和对称弯曲有关)。有些峰出现在500 - 1300厘米之间^－1(即956厘米^－1-OH弯曲)，这是PLGA的特征峰。

然后，我们通过原子力显微镜研究了PLGA顺铂纳米粒的大小和形状3.)提示plga -顺铂呈纳米球状。我们已经计算了大概的尺寸 nm的AFM图像。

3.2.PLGA顺铂纳米粒诱导的细胞毒性

通过MTT法检测PLGA顺铂纳米粒对乳腺癌细胞系（MCF-7）的细胞毒性作用₅₀，浓度在0到50之间μg/mL plga -顺铂NPs，治疗期24 h。MTT试验结果表明，plga -顺铂NPs浓度增加，细胞死亡增加。我们还评估了在相同浓度范围内顺铂的细胞毒性。通过MTT实验，我们获得了集成电路₅₀plga -顺铂NPs值为 μg/mL，而仅顺铂时IC₅₀值是 μg/mL。MTT试验数据表明，PLGA-顺铂纳米粒的细胞毒性优于单纯顺铂（图4(一)）.我们还在HEK-293细胞系中检测了NPs的细胞毒性。数据表明，40岁以后μg/mL，细胞死亡明显(图4 (b)）.

3．3.plga -顺铂NPs诱导MCF-7细胞凋亡

为了检测plga -顺铂纳米球是否参与了细胞凋亡/坏死，采用Annexin-V-FITC/PI染色，通过分析细胞外膜丝氨酸磷脂酰水平的升高，进行了流式细胞术评估。如图(图5)很明显，凋亡（早期和晚期）细胞的百分比以时间依赖性的方式增加（11.3%EA/17.7%LA持续12天） h和19.8%EA/24.7%在LA中持续24小时 h） 经治疗23例 μg/mL的plga -顺铂NPs，相对于对照细胞(1.38% EA和0.64% LA)。这些结果提示plga -顺铂nps诱导的细胞死亡与细胞毒性和凋亡直接相关。

3．4．评估细胞内ROS的生成

顺铂是一种著名的ROS诱导剂[42］．因此，我们通过共聚焦显微镜确定了plga -顺铂NP治疗后ROS的生成(23μg/mL），以时间依赖的方式（12和24 h） 使用DCF-DA染料作为活性氧的指示剂。DCF-DA荧光发射增加（595 nm）表示活性氧增加（图6）.这里，DAPI被用作细胞核染色剂。如图所示5，显微图像显示，经过23处理后绿色发射呈时间依赖性增加μg/mL plga -顺铂NPs。以上数据证实plga -顺铂NPs在mccf -7细胞系中增加ROS。

3．5．DNA损伤检测

ROS过载还会导致细胞生物大分子的氧化损伤，最终导致细胞功能障碍和死亡。在高水平时，ROS可通过DNA细胞损伤导致生理功能受损。因此，对顺铂和plga -顺铂NPs分别在0-40时进行了DNA片段分析μ克/毫升浓度。为此，我们选择了在405 nm处处理后的OD值(图)7）.OD值表明，随着顺铂和plga -顺铂NPs浓度的增加，DNA片段增加。然而，在plga -顺铂NPs的情况下，发现DNA碎片更高。这一观察清楚了ROS的增加正在破坏DNA。这些数据表明，ros介导的DNA损伤与plga -顺铂np诱导的MCF-7癌细胞凋亡相关。

3.6。plga -顺铂NPs中顺铂的释药研究

我们还通过透析膜技术检查了PLGA顺铂纳米粒在pH-5.5的缓冲液中顺铂的释放情况，在4 h间隔，并延长至24小时 h、 据了解，16岁以后 h几乎50%的顺铂已被释放，这证实了PLGA顺铂纳米粒的生物利用度优于仅顺铂（图1）8）.

4.结论

在本研究中，我们通过多步骤获得了具有化疗性质的顺铂载PLGA NPs。采用AFM和FTIR技术对plga -顺铂NPs进行了表征。MTT法测定了纳米颗粒与顺铂对MCF-7的细胞毒性。采用紫外-可见比色法定量缓冲样品中的顺铂。在周围介质上观察到NPs的ph依赖性药物释放谱，有利于顺铂在酸性环境下的释放。通过这种方式，我们证实plga -顺铂NPs的生物利用度已经提高。与plga -顺铂相比，plga -顺铂的抗癌疗效更高，可降低严重生理障碍的风险。我们还发现，在plga -顺铂纳米颗粒处理后，MCF-7中的ROS生成呈时间依赖性增加。在此之后，我们检查了随着ROS生成数据而产生的DNA损伤，因此我们可以说，ROS的生成是plga -顺铂诱导的细胞凋亡中DNA损伤的原因。因此，plga -顺铂NPs作为一种抗癌药物在未来克服癌症流行病学方面具有巨大的潜力。

缩写

PLGA:	保利lactic-co-glycolic酸
公元前:	乳腺癌
ROS:	活性氧
呃:	雌激素受体
公共关系：	孕激素受体;
HER2:	人表皮生长因子受体
DMF:	二甲基甲酰胺
PVA:	聚乙烯醇
OPDA:	Orthophenylenediamine
OD:	光密度
市场经济地位:	Ethanesulphonic酸clorhydrate
红外光谱:	傅里叶变换红外
AFM:	原子力显微镜
PSN:	Penicillin-streptomycin-neomycin
DCF-DA:	2 ，7 -二乙酸二氯荧光素。

数据可用性

本文中生成或分析的数据在网上公开，无需请求。

的利益冲突

作者宣称不存在竞争利益。

作者的贡献

Mohammed Al-Zharani、Gadah Albasher和Hani Alothaid进行了细胞培养和治疗。Norah Saad AL-Johani评估了细胞毒性。Nada H. Aljarba、Mohammed H. Almarzoug和Norah M. Alhoshani检测到细胞凋亡和坏死。Mohammed Al-Zharani和Abdullah A. Alkahtane测定了氧化应激并进行了统计分析。Saad Alkahtani和Saud Alarifi参与了研究的概念和设计、数据解释和手稿的关键修订。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者感谢沙特国王大学科学研究系主任通过研究小组(RG-1441-018)资助这项工作。

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