肠道Microbiota-Related Tanhuo汤在急性缺血性中风的影响

文摘

急性缺血性中风(AIS)是一个获得成人残疾和死亡的主要原因。我们先前的研究证明了有效性和Tanhuo汤(THD) AIS的有效性。然而,治疗机制仍不清楚。我们招募了49 AIS患者和30名健康人们探索的影响(THD +基本治疗卒中后肠道微生物群的AIS患者使用16 s rRNA测序,其中23名患者接受了基本的治疗(对照组)和26名患者接受THD +基本治疗(THD)组)。通过比较治疗前后的数据,我们发现野组获得更好的结果比对照组临床疗效指标和肠道微生物群的特点。除了中介短链脂肪酸——(SCFA)产生两组的细菌,治疗(THD组显著减少,脂多糖(LPS)生产细菌减少有限合伙人的生物合成。此外,肠道微生物群共存的复杂性和LPS-producing细菌之间的竞争和机会性致病的细菌(THD组得到了提高。治疗(THD组也表现出了潜在的减少基因的生物合成三甲胺(TMA)、三甲胺的前体N-oxide (TMAO),并增加基因的退化TMA,特别是增加trimethylamine-corrinoid蛋白质Co-methyltransferase (mttB),异化TMA甲烷。这些结果暗示THD +基本治疗可能会发挥其功效,调节肠道微生物群和微生物代谢产物,包括有限合伙人和TMAO加剧无菌炎症和血小板聚集。此外,合身的回归模型结果在预测临床结果的改变肠道微生物群证明肠道微生物群作为一个潜在的指标AIS和提供证据的AIS患者的肠道和大脑之间的沟通。

1。介绍

急性缺血性中风(AIS)是一个主要的原因获得成人残疾和死亡的主要原因1]。将近一半的幸存者失去自理能力和忍受长期的健康保健2]。卒中后医疗保健的成本带来了巨大的经济负担,尤其是在美国,每个病人的费用一年超过人均国内生产总值(3]。大型动脉动脉粥样硬化和血栓形成的重要原因是AIS和血小板的聚集是血栓形成的一个至关重要的一步。溶栓后6小时内出现症状被证明是有效的在诊所;然而,狭窄的治疗时间窗限制的历史和其他约束,如颅内手术和凝固的异常4]。令人失望的低溶栓率已报告在许多国家,尤其是在美国(2006年是2.4%)和中国(2011年是1.6%)(5,6]。除了血小板的聚集,无菌炎症的发病和加重AIS的另一个关键步骤。急性无菌炎症会破坏血脑屏障,导致卒中后神经细胞凋亡和通常的同事的不良预后AIS (7,8]。治疗AIS,除了动静脉溶栓,抗血小板聚集(阿司匹林)(类我;证据级别)和血管内机械血栓切除术治疗,和其他药物,没有足够的证据,没有广泛采用国际中风指南(9]。

血小板聚合和无菌炎症与肠道微生物群密切相关和微生物代谢产物。异常传播的脂多糖(LPS),一个重要的微生物代谢产物,从肠道将引发系统性免疫反应的促炎细胞因子水平升高,如肿瘤坏死因子α (肿瘤坏死因子-α),核因子-κB (NF -κB)和白细胞介素- 6 (il - 6)。随后,系统将释放促炎细胞因子作用于小胶质细胞,引起神经炎症,这将加重动脉粥样硬化,导致中风的一个贫穷的结果(10,11]。此外,有限合伙人与血小板相互作用直接,然后刺激血小板的分泌和聚合协同加强血小板受体激动剂的浓度较低,因此使血栓形成显著(12]。三甲胺N-oxide (TMAO)是另一个关键肠道microbiota-derived代谢物已经证明了促进缺血性血管疾病(13]。肠道微生物群的生成三甲胺(TMA), TMAO的前兆,使用磷脂酰胆碱、卵磷脂、左卡尼汀来自肉类,海鲜,和鸡蛋,TMA后加工TMAO在肝脏。通过NF - TMAO诱发血管炎症κB信号和增殖蛋白激酶(14]。另外,TMAO可以stimulus-dependent血小板激活,激活血小板的聚集和动脉内的血栓发生后来的一代15]。机械的实验和流行病学研究支持TMAO是动脉硬化的生物标志物和高血浆浓度的TMAO中风不良结果的指标(16- - - - - -18]。炎症引起的血小板和聚合有限合伙人或TMAO相互促进(19,20.),这是潜在的促进血栓形成和缺血性损伤。作为肠道微生物群参与肠道和大脑之间的双向沟通和调节宿主的止血,microbiota-gut-brain轴完成和在脑损伤中发挥着重要作用,炎症,和脑部疾病11,21]。与知觉的实质性增强肠道微生物群的作用和微生物代谢产物在中枢神经疾病,肠道微生物群已被建议作为治疗目标在这些疾病,包括中风,导致肠道微生物的分析越来越多的研究(22]。

由于不满意基本用西医治疗的有效性(WM) AIS (23),包括抗血小板药物(阿司匹林、氯吡格雷),降低脂质(他汀类药物),和改善循环(药物不良反应,Alprostadil Ureclin, Butylphthalide),人们参与开发新的药物靶向免疫反应进行神经保护治疗AIS患者(24),同时也向中国传统医学(中医)。中医可以改变肠道微生物群和表达下调炎症(25,26)和已被证明是一种有效的干预在中风自1999年甚至更早的时候27,28]。我们先前的研究证明了令人满意的结果的AIS Tanhuo汤(THD),并没有发现副作用在诊所23]。通过定量分析,我们发现野可以减少一些炎症因子的水平,包括心房纤颤(纤维蛋白原),PAgT(血小板聚集试验)、c反应蛋白(c反应蛋白)和TMAO AIS患者的血浆。尽管这项研究是一个重要的一步揭示中医对AIS的作用,治疗机制方面还存在很大差距,中医对AIS的影响。同时,中医的相关研究,包括THD,忽略了肠道微生物群。

在这项研究中,我们包含了49 AIS患者和30名健康的人作为研究对象。AIS患者随机分为对照组(使用WM基本治疗, )官和集团(THD +基本治疗, ),分别。肠道微生物群的16 s rRNA序列数据和临床信息之前和之后的治疗被用于探索的影响两个治疗AIS患者的肠道微生物群。AIS患者的临床结果指标比较两组,我们发现组对照组相比有更好的结果。的16 s rRNA序列的比较分析肠道微生物组治疗前后,我们发现肠道微生物群的集团成为接近的健康比对照组的样本。除了监管短链脂肪酸——(SCFA)生产细菌由两个治疗,基本治疗继发性胆汁细菌制造酸性物质的相对丰度下降,Dorea。相比之下,THD +基本治疗显著降低LPS-producing细菌减少有限合伙人生物合成的水平。根据定量分析预测的基因,也有可能降低生物合成的基因TMA,增加基因的退化TMA,特别是增加trimethylamine-corrinoid蛋白质Co-methyltransferase (mttB),异化TMA甲烷。此外,治疗(THD组增强肠道微生物群的同现网络的复杂性,重建SCFA-producing属之间的相关性,提升机会性致病的细菌和细菌LPS-producing之间的竞争。这些结果揭示肠道microbiota-related THD对AIS的影响并提供一个基础披露在AIS的治疗机制的角度microbiota-gut-brain轴。

2。材料和方法

2.1。伦理批准

这项研究是宣武医院的伦理委员会批准首都医科大学,和所有参与者签署知情同意。

2.2。包含和排除标准

2018年6月16日,6月8日,2019年,49 AIS患者和30名健康受试者招募了。AIS患者都包含在以下标准:(a)与缺血性脑血管病的诊断标准在第四届全国脑血管病会议;(b)诊断为头部CT或MRI检查中风的发病后3天内;(c)与大型动脉动脉粥样硬化相关定义的审判组织10172年急性中风治疗(面包);(d)超声检查颈动脉和经颅彩色双工(TCCD)超声波;(e)生命体征稳定,正常心脏、肝脏和肾脏功能;(f)注册7天内发病的症状;(g)和完整的临床资料。AIS患者也会遇到以下排除标准:(a)诊断为颅内出血或非缺血型疾病基于CT或MRI;(b)适应症抗凝治疗(心原性栓塞,如心房纤颤,心肌炎); (c) receiving intravenous thrombolytic therapy or interventional therapy after the onset this time; (d) with contraindications to Aspirin; (e) used antibiotics or other drugs known to affect gut microbiota for coinfection after enrollment; (f) arrangement for recanalization (interventional surgery or vascular surgery) within 3 months; (g) pregnant, lactating women or women of childbearing age who have a pregnancy plan within 3 months; (h) severe heart, liver, and kidney dysfunction; (i) with imperfect clinical data and specimen collection; and (j) participated in clinical research of other drugs and equipment simultaneously. The healthy participants included in this study met the following criteria: (a) free of any organic diseases or underlying diseases; (b) examined by carotid ultrasound; (c) match AIS patients with regard to basic characteristics, such as gender, age, and height weight; and (d) no antibiotics or probiotics intake during the sampling period.

2.3。治疗方法

在这个前瞻性观察性研究,49 AIS患者承认在我们医院从2018年6月到2019年6月被录取。30人会议健康受试者的入选标准包括在健康组。所有患者随机分为两组。一组接受基本的治疗(对照组, ),和另一个被THD +基本治疗(THD)集团 )。基本治疗包含抗血小板药物(阿司匹林和氯吡格雷),降低脂质(他汀类药物),和改善循环(药物不良反应,Alprostadil Ureclin, Butylphthalide)。每单位(THD包含9 g Coptidis根茎,5 g Rhei根和根茎,淡竹叶9克、连翘9克、和9 g胆汁Arisaema。在当前的研究中使用的所有这些草药是购自国药控股集团北京Huamiao制药有限公司有限公司草药的主要化学成分是由国药控股集团北京Huamiao制药有限公司,有限公司,通过高效液相色谱法。批号和内容的主要化学物质补充表中列出了每一种药草1。所有的草药都符合满足中国药典的标准(2015年版)。

(THD的煎煮野集团,这是由宣武医院首都医科大学根据标准生产过程如下:(a)将每单位(THD草药放入砂锅;(b)加入600毫升冷水(1:15日 ),和浸泡20 - 30分钟;(c)煮草药浸泡2小时,使用纱布和滤液汤;(d)增加10倍的残留物质重量的温水,煮沸混合物,和三次用纱布过滤粗声粗气的,另一个2小时;和(e)混合过滤煎煮两次。每一剂量的飞了100毫升煎煮。AIS患者(THD组每天服用1剂量煎煮,一半一半早上和晚上,7天口服药。我们收集的临床特征AIS患者治疗前后和健康的参与者。

2.4。结果测量

美国国立卫生研究院的中风尺度(署)分数,改良Rankin规模(夫人)分数,Barthel指数(BI)分数,火热的分数记录之前和之后两个治疗方法。AIS患者的神经功能障碍与署量化,一个工具得分从0到42岁中风造成的损伤的地方 代表没有症状或轻度和赤字 代表中度或严重的赤字。AIS患者的残疾和能力来衡量和BI夫人,分别。夫人从0到6,代表健康状况没有症状。BI范围从0到100,占总依赖到独立的个人活动。此外,火热的分数被用来评估火热的症状包括便秘、口干,尿黄,红色的舌头在中医23]。中风的临床结果被减少署表示,夫人,火热的分数和BI的增量(署、夫人,火热的分数,BI +)。

2.5。粪便样本收集、DNA提取和16 s rRNA测序

收集粪便样本来自30个控件和49 AIS患者治疗前后。微生物群落基因组DNA的新鲜粪便样本使用E.Z.N.A.提取®土壤DNA工具包(ωBio-tek,共同协助,乔治亚州,美国)按照制造商的指示。DNA的浓度和纯度在1%琼脂糖凝胶监控。引物对338 f (5 - - - - - -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 )和806 r (5 - - - - - -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 )选择放大16 s rRNA V3-V4区域的基因中提取DNA。16 s rRNA的PCR扩增程序设置如下:95°C 3分钟(初始变性);27日周期30年代的95°C(变性),55°C 30 s(退火)和72°C 45 s(扩展);10分钟和72°C(扩展),和储存在4°C。然后,PCR生产paired-end测序在Illumina公司MiSeq PE300平台(美国圣地亚哥Illumina公司)。

2.6。16 s rRNA扩增子数据处理

去复用paired-end序列导入Qiime2版本2020.8.0 (Qiime2) [29日]。质量控制和施工特性表的扩增子序列的变异(ASV)进行DADA2管道使用以下参数设置:295年-p-trunc-len-f -p-trunc-len-r 295,其他参数的默认值。asv分类学的注释使用朴素贝叶斯分类器pretrained身份99%绿色煤电rRNA数据库(13.8.99版)(30.]。之后,丰度矩阵在门的水平,创建类,秩序、家庭、和属为每个样本(31日]。大量的细菌治疗前后比较使用Wilcoxon等级和测试。我们使用肠道微生物群健康集团的代表肠道微生物群的健康状况和特点的健康程度的肠道微生物群AIS患者之间的欧几里得距离AIS病人的肠道微生物群的相对丰度矩阵和质心的健康组。欧几里得距离意味着较低的健康程度就越高。为了描述的改善肠道微生物群状态使用两个治疗,我们计算的增量欧几里得距离(IED)后治疗。消极的IED代表了积极的改善肠道微生物群。α多样性(香农多样性和Chao1)在一个示例计算使用phyloseqR包(1.32.0版)(32]。而Chao1指数反映了丰富的肠道微生物群,香农指数措施丰富度和均匀度。计算细菌之间的共存与面向SparCC [33使用SparCC相关方法)工具。与绝对SparCC共存和相应的相关系数大于0.4 被认为是显著的。同现网络可视化使用Cytoscape(3.8.0版)(34]。中心的细菌被确定使用Cytohubba插件(35基于最大小团体中心(MCC)算法。正极连接,负极连接、复杂性和度的节点被用来描述的拓扑特征共存的网络(36,37]。探索的功能能力参与者的肠道微生物群,我们应用PICRUST2管道(38]预测KEGG Orthology (KO)概要文件为每个样本asv的相对丰度。在特定细菌贡献KO PICRUST2也输出。KEGG通路概要从KO聚合概要。线性判别分析效应大小项目(LEfSe;http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)[39)是用来确定KEGG通路显著不同的之前和之后的治疗。科斯获得直接相关的新陈代谢TMA没有遗漏,R包KEGGREST(特南鲍姆d KEGGREST:客户端访问KEGG休息。R包版本1.30.1)使用。所有与蓝玉KEGG反应反应物或产品追踪,然后是科斯利用在每个跟踪反应收集。每个KO的丰度比较之前和之后的治疗和测试使用成对Wilcoxon等级和测试。多元线性回归与特征选择,使用套索处罚最大似然方法,进行“glmnet”R包(版本4.0.2)(40]。所有的数据都使用R(版本4.0.2)绘制。

2.7。统计分析

连续变量所代表的 (SD)。双尾学生的 - - - - - -测试韦尔奇的校正是用于比较连续变量正态分布,而Wilcoxon等级和测试是用于非正态的分布的连续变量。离散变量卡方检验比较或双尾确切概率法。一个变量的比较之前和之后的治疗是一个配对的测试。的本研究价值输出的统计检验和错误发现率调整( )。 统计上显著的表示。

3所示。结果

3.1。更好的结果(THD治疗相比,基本治疗

49招募了AIS患者进行了随机化(23基本治疗进入对照组;26日(THD +基本参加飞集团)的治疗。此外,30人的入选标准健康样本都包括在健康组。两治疗组通常在基线特征匹配( ,补充表2)。

无偏治疗期间,患者(THD组取得更好的结果比基本治疗中风的临床结果和改善肠道微生物群(图1)。中风的临床结果被减少署表示,夫人,火热的分数和BI的增量(署、夫人,火热的分数,和BI +)。(THD组署、夫人,火热的分数和BI + , , ,和 ,这都明显大于对照组( , , ,和 ,数据1(一)- - - - - -1 (d))。此外,为了描述健康的变化程度的肠道微生物群的AIS患者两种治疗方法后,我们计算简易爆炸装置(材料和方法)的每个AIS病人。虽然在对照组是积极的简易爆炸装置,简易爆炸装置(THD组是消极和显著降低。简易爆炸装置的结果在属(图是一致的1 (e)(图)和家人1 (f))的水平。我们因此推断,THD +基本治疗更好的改善肠道微生物群社区的健康程度。除了简易爆炸装置,我们调查了变化占主导地位的细菌(最高5丰富家庭/在每个样本组属),这对IED的贡献超过细菌丰度较低。我们计算的绝对丰度的差异AIS患者和健康之间的占主导地位的细菌样本的变化相比,两者之间的绝对差异治疗后治疗组(补充图1)。我们发现治疗(THD组可以缩小这种差异最丰富的细菌,包括Prevotellaceae(家庭)类杆菌(家庭)普氏菌(属),拟杆菌(属),AIS患者与健康之间的样品;然而,对照组的治疗起到了相反的作用。值得注意的是类杆菌,包括拟杆菌,是重要的LPS-producing细菌。此外,α多样性(香农多样性和Chao1)的肠道微生物群在对照组降低,显著提高(THD组(数字1 (g)和1 (h)),这意味着THD +基本治疗可能导致更丰富和更平衡的肠道微生物群社区相比,基本治疗。

3.2。改变肠道微生物群的对照组

发生重大变化的细菌丰度与基本治疗。基本治疗后,属的数量减少,有14属消失和8个属(补充图2)。丰富的17个属改变显著,基本治疗( ),在七属增加和10属减少(图2)。两个LPS-producing属(拟杆菌和Oscillospira)显著改变。虽然主要属,拟杆菌增加了,Oscillospira与相对较低丰度降低。此外,九SCFA-producing属的显著改变。没错,butyrate-producing属变化不一致,两个属(Anaerostipes和Gemmiger)增加和三个(Coprococcus,Roseburia,毛螺菌属)降低。propionate-producing属,Phascolarctobacterium增加,而acetate-producing属,包括双歧杆菌属和链球菌同时,减少。此外,Dorea,与二次胆汁酸合成和葡萄糖代谢41),基本治疗后下降。

细菌丰度的变化在对照组简化了细菌(图中共存3)。基本治疗后对照组,同现网络组成的显著相关性(材料和方法),被削弱,包含19个积极和9消极共存与预处理降低复杂性相比网络(259.287和418.706)(补充表3)。网络是由一系列预处理中心属(补充表4、5),包括梭状芽胞杆菌,枸橼酸杆菌属,Faecalibacterium,Eggerthella,瘤胃球菌属,Blautia,普氏菌,Alloscardovia,Roseburia,Coprococcus。在治疗后的网络连接的明显减少,链被打破了。同现网络基本治疗后重建,成为主导组成的闭环瘤胃球菌属,Dorea,毛螺菌属,Roseburia,Eggerthella,双歧杆菌属,Faecalibacterium,真细菌,SCFA-producing属大比例(6/8)。此外,同现循环与其他SCFA-producing属,包括Odoribacter,Blautia,Gemmiger,链球菌。闭环及其连接SCFA-producing细菌可能作为一个官能团。此外,拟杆菌LPS-producing细菌基本治疗后显著增加,与不同的细菌cooccurred预处理和后处理网络。在预处理网络拟杆菌消极与两个属,枸橼酸杆菌属和Granulicatella,并积极与Parabacteroides。在治疗后的网络拟杆菌只与另一个属呈正相关,瘤胃球菌属。提出的一项研究[42),积极的和消极的相关性代表代谢互补和竞争,分别,这可能暗示有更少的竞争LPS-producing细菌基本治疗后。

通过分析KEGG Orthology (KO)和KEGG途径预测使用PICRUST2(从16 s rRNA序列38](材料和方法),我们发现7个通路的浓缩或英国人改变显著基本治疗后对照组(线性判别分析(LDA) )(图4(一))。值得注意的是,“脂多糖生物合成蛋白质”KEGG闪亮(BR: ko01005)浓缩在治疗后的样本,这暗示基本治疗可能不会抑制bacteria-derived有限合伙人的生物合成。分析的贡献属“脂多糖生物合成的蛋白质“闪亮,我们发现拟杆菌贡献最多的预处理和后处理。增加的“脂多糖生物合成的蛋白质“闪亮水平治疗后样品与增强的贡献三个显著增加属,包括拟杆菌,Phascolarctobacterium,Meganomas(图4 (b))。

总之,上述结果表明,基本治疗减少继发性胆汁细菌制造酸性物质,Dorea,监管几个SCFA-producing细菌。这些是重合的前研究中使用的医学基本治疗。antiplatelet-aggregation药物,阿司匹林,据报道,减少Dorea(43]。降胆固醇药物,如阿托伐他汀和普伐,据报道增加SCFA-producing属(44]。二次胆汁酸的减少将下调胆汁酸的重吸收。和短链脂肪酸能降低肠道免疫调节和抗炎(45,46]。所以,减少继发性胆汁细菌制造酸性物质,调节几个SCFA-producing细菌是可能的流程基本治疗缓解中风。然而,随着主要LPS-producing细菌,拟杆菌门,“LPS生物合成蛋白质“闪亮的水平增加,争夺LPS-producing细菌减少后处理;这可能暗示,基本的治疗方法是低效率的抑制LPS和相关的无菌炎症,需要定量分析在未来的研究。

3.3。官改变肠道微生物群的组

细菌还在治疗后发生的重大变化(THD组。属的数量增加而13属出现和四个消失(补充图2 b)。丰富的20属显著改变( ),在11属增加和9属减少(图5)。值得注意的是,拟杆菌门LPS-producing属,显著降低。另一个LPS-producing属,Oscillospira,也减少了( )。此外,14日的20个微分属是短链脂肪酸的生物合成有关。几个butyrate-producing属显著改变。而Anaerostipes,Gemmiger,Coprococcus增加,真细菌,毛螺菌属,Odoribacter降低了。Phascolarctobacteriumpropionate-producing属,显著减少。相对地,acetate-producing属,包括双歧杆菌属,Blautia,瘤胃球菌属,链球菌同时,增加。

比较肠道微生物群的转移组和对照组中,我们发现四个属发散思维转移( )在两个治疗组(图6A1和A2)。值得注意的,拟杆菌(LPS-producing属)改变了面对面的两组。结果暗示可能效果更佳(THD +基本治疗表达下调有限合伙人相比,生物合成的基本治疗。然而,推断需要进一步证明了有限合伙人相关途径和实验数据的分析。同样发生在Phascolarctobacterium(propionate-producing细菌),Coprococcus(butyrate-producing细菌),Dorea。此外,我们比较AIS患者健康的肠道微生物群样本。我们专注于有限合伙人,SCFA-producing细菌,和聚合成LPS-producing acetate-producing propionate-producing, butyrate-producing细菌。有趣的是,与对照组治疗后的样品相比,LPS-producing细菌的大量资金,acetate-producing细菌,官和propionate-producing细菌在治疗后的样本组接近的健康组(图6 (b))。此外,治疗后,butyrate-producing细菌的丰度和拉力测量组的增加,当他们在某种程度上减少在对照组。另外这些比较结果证明了在肠道微生物群的积极作用。每个有限合伙人的详细比较的结果——/ SCFA-producing细菌补充图所示3。

这些微分属加强同现网络(THD组(图7)。网络分析证明方面的相当大的利润属的共存。后处理的同现网络包含32个积极和13 - 382.379996共存的复杂性增强,预处理相比网络(313.282)(补充表3)。值得注意的是,与重要的几个属的丰度的变化,尤其是那些标识为中心属(补充表4、5集团)预处理和后处理,包括瘤胃球菌属,梭状芽胞杆菌,Parabacteroides,乳酸菌,Blautia,同现网络改变了的梭状芽胞杆菌- - - - - -瘤胃球菌属- - - - - -Parabacteroides集群主导网络更加分散的偏见主要属。在梭状芽胞杆菌- - - - - -瘤胃球菌属- - - - - -Parabacteroides主导网络的预处理样品,三属美国的大多数SCFA-producing属中包含的网络,包括Coprococcus,Gemmiger,Butyricimonas,双歧杆菌属,Oscillospira。此外,LPS-producing属,拟杆菌,一些致病的属,包括志贺氏杆菌,肠球菌,克雷伯氏菌被包含在梭状芽胞杆菌- - - - - -瘤胃球菌属- - - - - -Parabacteroides集群。此外,其他SCFA-producing属,包括Megasphaera和Akkermansia,也加入了Pyramidobacter另一个中心属程度较低和中间状态。在治疗后的网络集群了梭状芽胞杆菌- - - - - -瘤胃球菌属- - - - - -Parabacteroides被削弱的显著增加瘤胃球菌属和之间的共存瘤胃球菌属和三个属(梭状芽胞杆菌,Gemmiger,志贺氏杆菌)逆转预处理相比网络。所有的共存拟杆菌(一个LPS-producing属)消失。此外,Pyramidobacter改进的程度和MCC的分数,与聚结SCFA-producing属,包括Akkermansia,乳酸菌,Blautia,Roseburia,醋酸杆菌属。两个acetate-producing属,Blautia和醋酸杆菌属(THD)治疗后出现一个属),不包含在预处理网络;然而,他们与其他细菌在治疗后的网络。有趣的是,这两个属预测提供mttB基因可以使异化TMA甲烷。的Pyramidobacter——关注集群可能是功能集群,acetate-producing细菌被其他连接SCFA-producing细菌低载噪音水平。此外,一个新的集群出现,一些致病的属和LPS-producing属,包括Eggerthella,Collinsella,Alistipes,韦永氏球菌属,Olsenella,Oscillospira,相互竞争,可能扮演一个角色在表达下调有限合伙人的水平。

探索功能的变化能力组的肠道微生物群,我们LEfSe进行分析和确定18通路显著改变( ,图8(一个))。值得注意的是,“脂多糖生物合成蛋白质”KEGG闪亮(BR: ko01005)和脂多糖生物合成“KEGG路径(路径:ko00540)浓缩预处理样品(“脂多糖生物合成蛋白质”KEGG闪亮: , ;“脂多糖生物合成”KEGG途径: ),这暗示bacteria-derived有限合伙人的生物合成(THD组中表达下调。分析的贡献细菌脂多糖生物合成的蛋白质“闪亮和脂多糖的生物合成途径,我们发现拟杆菌最之前和之后的治疗起到了推波助澜的作用。生物合成的降低水平有限合伙人的后处理样本有关的贡献就越少拟杆菌,Meganomas,普氏菌,梭状芽胞杆菌,Dialister相比,预处理(数据样本8 (b)和8 (c))。此外,我们收集了TMA代谢反应和科斯。八科斯在六个反应是包含在我们的数据中。我们比较每个KO治疗前后的丰度,发现大多数(5/6)参与退化TMA的科斯集团的增加在一定程度上,尤其是K14083 (mttB),它是调节显著 (表1)。科斯的生物合成TMA略有减少( )官的组。然而,没有明显的变化在所有相关的科斯在对照组。在我们之前的研究中,我们发现AIS患者的血浆TMAO水平显著降低(THD +基本治疗后与定量分析(23),这是我们当前研究的基础和有效的证据。因此,它是合理的推断,调节肠道菌群是一个可能的方法中拉力降低TMA和TMAO水平。仔细看看THD的监管在肠道细菌参与的生物合成或降解TMA,比较细菌贡献TMA-related科斯之前和之后的治疗是必需的。在这里,我们进行了这样的分析mttB显著的基因调节拉力测量组,作为一个例子(图8 (d))。Blautia(acetate-producing属)属的主要捐赠者之前和之后的治疗。属是大大增加,捐赠更多mttB基因(THD +基本治疗后。醋酸杆菌属,另一个acetate-producing属,唯一出现在post-THD集团也起到了推波助澜的作用mttB基因。值得注意的是,这两个Blautia和醋酸杆菌属被包含在Pyramidobacter主导共存集群post-THD组和连接其他SCFA-producing细菌(图7)。

一般来说,治疗(THD组有几个对AIS患者的肠道微生物群的积极影响。它可以显著下调有限合伙人的生物合成途径抑制LPS-producing细菌。除此之外,它减少了蓝玉的生物合成基因和基因的退化TMA的增加,尤其是的显著增加mttB基因降解TMA甲烷。此外,它显著增加acetate-producing细菌,主要贡献者mttB基因。治疗也可以增加肠道微生物群之间的共存和促进LPS-producing细菌和致病的细菌之间的竞争。(THD组,除了基本的治疗,患者(THD,主要包含Coptidis根茎,Rhei根和根茎,淡竹叶,连翘,胆汁Arisaema,活性成分包括黄连素和大黄酸。小檗碱在Coptidis根茎可以降低血糖的水平和有限合伙人,抑制一些致病的细菌,并增加几个SCFA-producing属,包括acetate-producing属瘤胃球菌属和Blautia(47- - - - - -49]。据报道,大黄酸在Rhei基数和根茎减少血清尿毒症毒素和表达下调全身炎症和氧化应激50]。大黄酸还可以增加SCFA-producing细菌和抑制致病的细菌在肠道51]。除了这些证据支持我们的分析结果,我们之前的研究中,发现THD的抑制等离子体TMAO水平的定量分析,是另一种有效的证据肠道microbiota-related拉力的影响。所以,官是合理的建议可以通过几种可能的方法,减轻中风包括LPS-producing细菌的抑制,acetate-producing细菌的增加,增强肠道细菌之间的共存。

3.4。改变肠道微生物群可以用作AIS的预后指标

在本部分中,我们探讨了AIS的临床结果之间的相关性和大量的肠道微生物群的变化。我们进行了多元线性回归与特征选择,使用套索处罚“glmnet”R包中最大似然法(版本4.0.2)。22细菌家庭选择适合署的变化与调整 - - - - - -的平方0.83,这意味着结果高度相关,可以有效地反映肠道微生物组(图的变化9(一个))。此外,我们发现减少火热得分也完全符合了细菌的丰度的变化。火热的减少可以安装了23个家庭或27属(数字9 (b)和9 (c))调整 - - - - - -方分别为0.75和0.85。这些结果进一步表明,肠道微生物群是一个潜在的指标AIS的结果。值得注意的是,LPS-producing属的系数拟杆菌和它的家人类杆菌-在所有线性分析,说明AIS的加重LPS-producing细菌。这些结果另外提供理性的假设它是一个可能的方法(THD + AIS的基本治疗实现好的结果通过抑制LPS-producing细菌。

4所示。讨论

AIS是一种疾病与高死亡率和伤残率高。疾病的治疗和医疗保健成本给患者带来沉重的经济负担。溶栓和西医是不令人满意的23)在一些约束下,人们求助于中医,发现中医导致一个好的结果。然而,中医的治疗机制,包括THD, AIS尚不清楚。

无菌炎症的神经系统和血管系统和血小板聚集是两个关键步骤的发病和加重AIS。官我们先前的研究显示,能有效地抑制炎症因子与无菌炎症和AIS患者血小板聚集,包括TMAO、Fib, PAgT, c反应蛋白(23]。这个结果是一个潜在的进步揭示在AIS的治疗机制。肠道微生物群参与的大脑和肠道之间的双向通信brain-gut轴,和微生物代谢产物的障碍,尤其是有限合伙人和蓝玉,会加剧无菌炎症和血小板聚集。此外,研究其他疾病,如2型糖尿病(26),表明中药的代谢和免疫介导宿主肠道微生物群的调节,从而达到治疗效果。此外,有效成分,包括黄连素和大黄酸,据报道飞中风影响肠道微生物群。基于上面的证据,它是合理的假设可能治疗AIS患者通过microbiota-gut-brain轴、螺纹调节几个肠道细菌低微生物代谢物有限合伙人和TMAO等,这将导致的差别,对这些基因的进一步无菌炎症和血小板聚集(图10)。由这一假说,我们设计了实验,采样策略和分析过程来探讨肠道microbiome-related THD对AIS的影响,旨在揭示官的角色从肠脑的角度交流microbiota-gut-brain轴。

据我们所知,这是第一个研究探讨AIS患者的中药对肠道微生物群的影响。在这项研究中,我们发现THD +官基本治疗组实现更好的临床结果与基本治疗对照组。此外,THD组,健康的肠道微生物群变得接近,组比对照组。除了中介SCFA-producing细菌在两组,Dorea二级bile-producing细菌,减少在对照组,随后可以降低胆固醇水平。相比之下,AIS患者改变肠道微生物群的几个具体特征(THD组。(THD +基本治疗后,有显著减少LPS-producing细菌和随后的减少有限合伙人的生物合成。此外,肠道微生物群的同现网络加强与更多的连接和更高的复杂性,LPS-producing细菌和致病的细菌之间的竞争是提高。点线索来TMA发生水平的抑制,包括生物合成的基因TMA的减少和增加的基因分解TMA,特别是显著增加mttB基因是利用异化TMA在甲烷生成途径。这些线索之际,我们之前的结论研究等离子体TMAO水平可以降低THD (23]。官的集团,mttB基因是由acetate-producing捐赠的主要细菌治疗后显著增加。值得注意的是报告的THD肠道microbiota-related活性成分的影响可以支持我们的研究结果。发现小檗碱降低LPS的水平和增加acetate-producing属,包括瘤胃球菌属和Blautia(47- - - - - -49]。大黄酸也报道增加几个SCFA-producing细菌和表达下调全身炎症(50,51]。因此,分析结果在当前的研究中提供了一个依据上述假设(图10),有助于填补THD的治疗机制和效果之间的差距。此外,通过分析大量的肠道微生物群的变化之间的相关性和AIS的临床结果,我们发现的结果AIS(减少署和火热的分数的减少)可以安装大量的细菌的改变在家庭或属水平。这个结果证明了AIS的肠道微生物群是一个指示器,另外提供了理性的假设AIS的治疗取得了良好结果的调节肠道微生物群和微生物代谢产物参与microbiota-gut-brain轴。

总之,我们的研究揭示了肠道microbiota-related THD对AIS的影响,提供了一个新的线索对AIS的治疗机制。然而,值得注意的是,有轻微差异预处理样品在控制和组织不受控制的偏差造成的随机分组和相对较小的样本大小。差异体现在临床结果和肠道微生物群,尤其是肠道细菌之间的共存。一方面,THD的预处理样品组评估署略高,夫人,火热的分数,和更低的BI ( ,补充图4),这表明这些样本可能遭受更严重的AIS。另一方面,如补充表所示3预处理共存的复杂性网络在对照组(418.706),这是接近健康组(650.226),高于预处理网络(THD组(313.282)。然而,相对更严重的AIS和无序的肠道微生物群样本前处理没有削弱我们的结论(THD组更好的结果,而是加强了它和暗示(THD +基本治疗可能比基本治疗在治疗患者情况更糟。然而,更加客观的数据和更大的样本量是想进一步探索对肠道微生物的影响和定量评估的有效性AIS的肠道微生物群作为一个指标。正如16 s rRNA主要提供肠道微生物群的分类信息,更多的研究使用整个宏基因组序列,multiomics数据,和生物实验的验证,是必需的。

5。结论

本研究显示更好的结果(THD组比对照组和改变肠道微生物群(THD的AIS患者组。我们的研究结果暗示,THD +基本治疗可能发挥功效的显著减少通过LPS-producing细菌,acetate-producing细菌的显著增加,肠道微生物群的增强共存的复杂性,和加强竞争LPS-producing细菌和机会致病菌。这些规定可能抑制肠道microbiota-derived代谢物,包括有限合伙人和TMAO可加重无菌炎症和血小板聚集。此外,本研究还证明了肠道微生物群作为一个潜在的指标AIS和提供证据的AIS患者的肠道和大脑之间的沟通。这些发现将有助于揭示在AIS的治疗机制的角度microbiota-gut-brain轴。

数据可用性

所有数据被存放到NCBI SAR在BioProject PRJNA683157数量。

信息披露

执行分析的一部分在高性能计算平台上北京大学的生命科学中心。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

HQZ和jx cosupervised这项研究。路上,XQJ HQZ合作设计研究基于测序数据。jx、LG和LJL合作设计和实施治疗措施和抽样。路上,CN、LC、YQW,毫升,化学加工分析数据和结果的图和表。路上,HQZ jx写和修改手稿,作者校对和改善了手稿。

确认

这项工作得到了中国国家重点研发项目(2017 yfc1200205),中国国家自然科学基金(32070667和32070667)的关键特殊项目科学技术部中医现代化研究(2019 yfc1712400),和北京的科技项目(Z171100001717012)。

补充材料

补充表1:批处理数据和组件的草本植物野。补充表2:在控制和基线特征预处理组。补充表3:参数同现网络的所有组的研究。补充表4:度属的共存的患者团体网络在这个研究。补充表5:MCC分数同现网络中心属的病人组在这个研究。补充图1:绝对差的占主导地位的细菌(家庭/属)之间的AIS患者和控制样品。补充图2:属治疗前后的维恩图官对照组(A)或(B)组。补充图3:比较每个有限合伙人——/ SCFA-producing细菌样本人群。补充图4:中风的预处理样品指标控制和组。(一)署分数; (B) mRS scores; (C) BI scores; (D) fire-heat scores.(补充材料)

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