文摘
尽管许多研究褪黑激素和烟酰胺(不结盟运动,活动形式的维生素B3),这两个之间的联系上下文中的生物分子信号通路调节胚胎发育尚未研究。在这项研究中,我们使用牛卵母细胞模型来阐明褪黑激素对卵母细胞的发育能力的影响的压力下南浓度高。结果表明,南(20 mM)政府在体外成熟(IVM)显著降低卵母细胞的成熟和肌动蛋白分布,而诱导活性氧(ROS)积累和线粒体功能障碍,缓解了褪黑激素的多种有害的影响(10−7米)。RT-qPCR和/或免疫荧光显示upregulation的细胞凋亡(Caspase-3 Caspase-9,和伯灵顿),自噬(Beclin-1、LC3A LC3B, ATG7, LAMP1,和LAMP2),细胞周期(P21、P27和P53)和DNA损伤(COX2和8-OxoG)特定的标记在卵母细胞成熟不结盟运动治疗,相比NAM-melatonin dual-treated和未经处理的。此外,总解理和囊胚发育率,以及细胞的总数和每胚泡内细胞质量(ICM),减少,DNA碎片引起的时候,不结盟运动组织的唯一治疗比NAM-melatonin cotreatment和控制。检查NAM-associated毒性揭示背后的潜在机制增加转录南甲基化模式(NNMT和AHCY)基因在NAM-treated观察卵母细胞,而相反的概要文件补充褪黑激素。总之,据我们所知,这是第一个研究报告,褪黑素可以保护卵母细胞和胚胎从NAM-induced损伤通过其ROS-scavenging活动一起与南甲基化信号潜在的交互。
1。介绍
氧化应激,由于活性氧(ROS)积累,是一个关键因素,可以限制卵母细胞的结构和功能完整性,导致可怜的发育能力。褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine),主要由松果体分泌的一种激素,可以保持卵母细胞和胚胎发育质量直接对抗氧化应激(1- - - - - -3]。它还可以引发不同抗氧化酶的活化,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)卵母细胞(4,5),并通过上调基因提高胚胎的质量必不可少的发展和cryotolerance [6]。在热休克,长期培养、玻璃化、低卵母细胞质量,有毒和antidevelopmental化合物的存在,和其他压力条件下,褪黑素显示,维护卵母细胞成熟、胚胎发展有益的角色(4,7- - - - - -11]。
另一方面,烟酰胺(南),一种水溶性的烟酸(维生素B3),是一种膳食补充剂,控制几个条件和疾病,包括细胞生存、炎症、癌症和代谢紊乱(12]。补充的不结盟运动在体外成熟(IVM)在低浓度显著提高卵母细胞和胚胎的发育能力13]。然而,暴露于高南浓度显示许多副作用包括肥胖、肝毒性、生长抑制、DNA损伤,血小板减少症的风险,表观遗传修饰和癌症进展(14- - - - - -17]。此外,它诱导细胞凋亡、主轴缺陷和明显的线粒体功能异常干扰卵母细胞和胚胎的发育能力,尽管细胞信号通路调节这些副作用尚未完全阐明13,18,19]。根据2017年全球南市场报告,不结盟运动的消耗速度增加了30%17]。虽然这可能反映了公众意识的有益作用,高剂量的潜在不利影响的膳食维生素应该也会考虑。
在细胞内部,不结盟运动通常代谢南单核苷酸(NMN能否),由南phosphoribosyltransferase (NAMPT),转换为南腺嘌呤二核苷酸(NAD+)南单核苷酸adenylyltransferases 1 - 3 (NMNAT1-3) [20.]。NAD的至关重要的作用+,生成通过NAM-mediated新陈代谢,调节代谢体内平衡和激活的关键酶负责细胞生存和长寿突出了不结盟运动的治疗潜力(21]。然而,在不结盟运动过度积累,甲基化途径由NAM-N-methyltransferase调制(NNMT)生成甲基化南(N-methyl-nicotinamide metNAM) [22]和不结盟运动的直接氧化形成NAM-N-oxide通过影响细胞色素P450 2 e1 (CYP2E1) [23)是两个代谢途径,可以激活。与正常情况下不同的是,NNMT下诱导增加膳食摄入量,因此催化南甲基化的途径,产生不同的底层代谢物(24]。这些包括N-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2 py)和N-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PY),通过醛氧化酶的作用(AOX) [17),同型半胱氨酸(HCY),活动的adenosylhomocysteinase (AHCY) [17,25]。
南后合成的报道毒性metNAM可以归因于蛋氨酸甲基化周期的中断。普遍的甲基供体S-adenosylmethionine(同样的)水平预计将被南生产metNAM和S-adenosylhomocysteine (SAH),转换为HCY的AHCY的活动,也被称为SAH水解酶(15,17,26]。半胱氨酸(HHCY) HCY水平升高,细胞毒性条件参与心血管疾病、老年痴呆症、帕金森症、炎症和心脏病27,28]。HHCY与生育能力下降有关,复发性流产和胎盘梗死的风险,在早期阶段,妊娠和早产发生率高的先天性缺陷(27,29日]。此外,滤泡HCY水平升高与穷人的卵母细胞和胚胎质量在多囊卵巢综合征患者接受辅助生殖30.]。HCY-induced损害的机制很可能认可的直接形成高活性氧水平,抑制的抗氧化防御系统,诱导的促炎反应,线粒体功能障碍,甲基化相关疾病,和表观遗传缺陷(15,28,31日]。
尽管大量研究褪黑激素的抗氧化活性,没有数据可用等潜在的不结盟运动之间的相互作用和激素在卵母细胞成熟和胚胎发展的背景下。在当前的研究中,我们试图探索高南浓度的影响和底层机制对牛卵母细胞的存在和缺乏褪黑激素。为了达到这个目标,不结盟运动和褪黑激素IVM期间,在卵母细胞成熟,actin-based细胞骨架复杂的形成,胚胎的发育能力,ROS水平,线粒体分布、细胞凋亡、自噬,DNA损伤检查。此外,南甲基化在卵母细胞信号通路也被审查。
2。材料和方法
2.1。伦理批准和化学品
根据实验下的国立大学的指导方针和规章制度动物保健和使用委员会(批准ID:雀鳝- 110502 x0017)。所有的化学品都购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有描述。
2.2。卵母细胞体外成熟(IVM)愿望和
的卵巢Hanwoo牛在当地屠宰场收集,运输在实验室热瓶2 h内屠宰、无菌生理盐水洗。使用18-gauge针,cumulus-oocyte复合物(COCs)收集包含TL-HEPES 50毫升管(10毫米玫瑰,2毫米碳酸氢钠,114毫米氯化钠,0.34毫米磷酸二氢钠、乳酸钠10毫米,0.5毫米氯化镁,氯化钙2.0毫米,3.2毫米氯化钾,1μL / mL酚红,100国际单位/毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升)。在TL-HEPES洗涤后,COCs至少三层积云细胞立体显微镜下捡起(奥林巴斯SZ51、东京、日本)和洗四次在IVM介质(中医- 199补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫),1μg / mL estradiol-17β10 ng / mL表皮生长因子(EGF)、10μg / mL促卵泡激素(FSH)、丙酮酸钠0.2毫米,0.1毫克/毫升链霉素,0.6毫米半胱氨酸和100国际单位/毫升青霉素)。COCs分成四级板包含700μL IVM的密度每在50 COCs褪黑激素的存在与否和不结盟运动和孵化38.5°C和5%股份有限公司222 h。所有实验由三组对应于20毫米,10的组合−7褪黑激素和20毫米,和未经处理的控制。
2.3。体外受精(IVF)
卵母细胞的受精,液体nitrogen-frozen精子解冻和稀释prewarmed杜尔贝科的磷酸盐(DPBS),然后在1800转离心5分钟在室温下。精子丸resuspended在500年μL (20μ与体外受精中g / mL prewarmed肝素补充(Tyrode乳酸溶液与22毫克/毫升丙酮酸钠,6毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA), 0.1毫克/毫升链霉素,和100国际单位/毫升青霉素)和38.5°C和5%孵化有限公司215分钟。集中精子稀释在体外受精介质的密度 精子/毫升。每个COCs载着700μL准备精子其次是孵化的38.5°C和5%的公司218 - 20 h。
2.4。胚胎体外培养(IVC)和发展
受精后,积云细胞被连续移液分离;然后,受精卵在700年被维护μL完成SOF介质(32)和38.5°C和5%孵化有限公司2。三天后(第四天postfertilization),总乳沟和分裂到8 - 16个细胞阶段胚胎的数量记录在SOF介质刷新之前酝酿板块为另一个4天。在第八天postfertilization,囊胚发育率记录收集胚泡在4%多聚甲醛(PFA)和储存在4°C到使用。
2.5。评估卵母细胞成熟
22小时发作的成熟,裸卵母细胞,收集COCs重复移液后,在PBS和第一极体挤压洗显微镜下直接可视化。成熟的确定阶段,卵母细胞,孵化Triton x - 100 20分钟,0.5%是沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI: 1μg / mL;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)15分钟紧随其后的是共焦激光扫描显微镜下可视化(奥林巴斯Fluoview FV1000,东京,日本)。基于核材料的形态,卵母细胞的成熟阶段分类如下:胚泡(问),第一次减数分裂的中期(中期我:MI)和第二次减数分裂中期(MII:成熟)。
2.6。细胞骨架的可视化
丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)是研究使用Alexa萤石488 -共轭phalloidin染色(热费希尔科学)。总之,裸露的卵母细胞( :一式三份)固定在4% PFA, PBS洗,permeabilized Triton x - 100 15分钟为0.5%。在PBS洗涤后,卵母细胞与Alexa萤石孵化488 -共轭phalloidin 40分钟然后洗与DAPI染色在室温下15分钟。卵母细胞是可视化共焦激光扫描显微镜下荧光强度,在细胞质和透明带/卵膜,估计使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达;https://imagej.nih.gov/ij/)。
2.7。测量活性氧(ROS)水平
裸露的卵母细胞( :2,一式三份)与ROS孵化指标7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(H2DCFDA: 5μ米)20分钟38.5°C之后,还要洗在PBS和成像显微镜数字化(奥林巴斯IX71、东京、日本)。荧光强度的ROS估计使用ImageJ软件。
2.8。线粒体分布的评估模式
为了研究线粒体的分布格局,裸露的卵母细胞( :一式三份)孵化与100 nM MitoTracker深红色污点(表达载体/分子探针,尤金,或者美国)为38.5°C 40分钟PFA在固定前4%。卵母细胞是数字化显微镜下检查,线粒体分布模式分为异常(分散外围地或细胞质中的薪资)或均匀(均匀分布在整个细胞质)。
2.9。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成
从卵母细胞总RNA提取( :一式三份)用大角星PicoPure RNA隔离工具包(大角星,培育、钙、美国)根据制造商的指导方针。固定数量的RNA (100 ng)受到互补脱氧核糖核酸合成使用iScript cDNA合成装备(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)如下:RNA (15μL)与5 x iScript混合反应混合物(4μL)和iScript逆转录酶(1μL)然后孵化在25°C 5分钟,30分钟42°C, 85°C为5分钟。
2.10。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)
RT-qPCR是使用iQ-SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室)根据制造商的指示。简单地说,2μL(正向和反向引物(表组合1),5μL SYBR绿色混合,1μL nuclease-free水混合和分布式进入删除stylus 96 -回避PCR盘子(Bio-Rad实验室)之前添加2μ稀释cDNA (150 ng / LμL)。使用CFX96仪器(Bio-Rad实验室),qPCR表现在以下条件下:95°C 3分钟,44 95°C的周期15秒,58°C 20年代和30年代的72°C。每个cDNA样本用于复制(3生物复制)。使用GAPDH基因的mRNA丰度估计作为参考基因在转录水平的每个基因在未经处理的控制设置为1。
2.11。免疫荧光
IVM后,卵母细胞( :一式三份)固定在4% PFA,洗了三次在PBS, permeabilized Triton x - 100 20分钟为0.5%。在10%的边后卫和3% BSA阻塞后,准备在PBS, 2 h,一夜之间,卵母细胞被孵化在4°C的主要抗体对Caspase-3长大,Caspase-9, Beclin-1, microtubule-associated蛋白1轻链3β(LC3B),环氧酶2 (COX2), 8-oxoguanine (8-OxoG)(补充表1)。样本洗在PBS添加Alexa Fluor-conjugated二级抗体(补充表1)。90分钟后在室温下孵化,DAPI添加15分钟然后卵母细胞被发现玻璃面和共焦激光扫描显微镜下进行调查。荧光强度估计使用ImageJ软件。
2.12。微分ICM和TE细胞的染色
固定在PFA,第八天囊胚permeabilized 0.25% Triton x - 100 20分钟,洗了三次洗涤缓冲(0.1%渐变20到0.1% BSA在PBS),和孵化阻断缓冲区(5% BSA在PBS)在室温下1 h。样本孵化隔夜anti-CDX2 (caudal-related同源框2)抗体(BioGenex,海牙,荷兰)之前洗和孵化Alexa萤石- 568驴anti-mouse免疫球蛋白在室温下1 h。CDX2完全本地化的滋养外胚层(TE),从而用来区分内细胞团的TE (ICM)。细胞核与DAPI染色15分钟然后胚泡洗,安装在玻璃幻灯片和共焦激光扫描显微镜下检查,细胞的总数(DAPI积极),TE (CDX2积极),和每个囊胚ICM (CDX2负)记录。
2.13。末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定
TUNEL分析检测的DNA碎片进行使用原位细胞死亡检测工具根据制造商的指示(美国印第安纳波利斯罗氏诊断)。总之,PFA-fixed第八天胚泡水洗三次0.3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)准备在PBS和孵化0.5% Triton x - 100和0.1%柠檬酸钠为30分钟。样本处理fluorescent-conjugated TUNEL解决方案为38.5°C 1 h;然后,细胞核与DAPI染色,持续15分钟。囊胚是安装在玻璃幻灯片和可视化数字化显微镜下鲜红的斑点的数量和DAPI-stained原子核,指标DNA碎片,和细胞总数,分别计算在每一个胚泡。
2.14。统计分析
统计分析进行了使用GraphPad棱镜version 6(美国圣地亚哥,CA)。NAM-treated组之间的比较与NAM-melatonin cotreated或未经治疗组使用学生的执行 - - - - - -测试。给出的结果 。意义的程度了 , , ,和当值低于0.05,0.01,0.001,和0.0001,分别。所有实验至少重复三次。
3所示。结果
3.1。褪黑素减少NAM-Associated卵母细胞成熟障碍和肌动蛋白稳定
我们曾报道称,高南浓度会影响胚胎发展的过程(13]。调查是否褪黑激素可以减轻这种效果,牛卵母细胞治疗与20毫米南22 h的存在和缺席10−7褪黑激素。褪黑激素的浓度选择是基于以前的研究褪黑素的保护作用在IVM的牛33,34,猪35),和山羊36卵母细胞。初始检查卵母细胞成熟透露,不结盟运动在20毫米浓度显著降低极体挤压( %)比未经处理的控制( %),而褪黑激素补充成功恢复正常成熟( %)(图1(一)和1 (b))。确认,核成熟的阶段是通过DAPI染色检查在IVM的核材料。如数据所示1 (c)和1 (d)卵母细胞成熟是不结盟运动治疗后显著降低( %),相比更高水平的melatonin-NAM cotreatment ( %)和控制( %)。代表图像的卵母细胞成熟的不同阶段呈现在图1 (c)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
另一方面,不结盟运动的影响和褪黑激素治疗的丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)的完整性在卵母细胞透明带/卵膜和细胞质使用phalloidin-based染色了。见数据1 (e)- - - - - -1 (g)卵母细胞中,f -肌动蛋白的荧光强度降低不结盟运动治疗后比未经处理的控制,而在添加褪黑激素显著增加。
3.2。褪黑素减少氧化应激和线粒体功能障碍在NAM-Treated卵母细胞
评估潜在的褪黑素清除ROS在不结盟运动治疗、体外成熟卵母细胞coincubated ROS-specific污点的H2DCFDA在显微镜下可视化。值得注意的是,补充褪黑激素与显著降低ROS水平相比明显增加下南唯一治疗(数字2(一个)和2 (b))。此外,检查线粒体的分布模式表明褪黑素能保持同质线粒体分布,而异常的分布主要在NAM-treated卵母细胞相比melatonin-NAM和控制(图2 (c))。的形态外观不同的线粒体分布模式如图2 (d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。褪黑激素保护从NAM-Induced卵母细胞凋亡和自噬
前进,不结盟运动的影响和褪黑素的表达水平不同的细胞凋亡和自噬标记了在转录和翻译水平。如图3(一个),upregulation Caspase-3 NAM-treated BCL2观察的差别和伯灵顿,对这些卵母细胞与控制。相反,增加褪黑激素的差别是伴随着对这些Caspase-3和伯灵顿。尽管melatonin-NAM治疗下BCL2水平的增加,这种影响没有达到统计学意义( )。确认,检查Caspase-3的蛋白质含量和Caspase-9在卵母细胞使用免疫荧光显示显著增加这两个蛋白的水平NAM-treated卵母细胞相比melatonin-NAM cotreatment和控制的(数字3 (b)- - - - - -3 (e))。同样,autophagy-related基因的转录模式Beclin-1, LC3A, LC3B, ATG7, LAMP1, LAMP2 Beclin-1的翻译模式和LC3B调查在卵母细胞与不结盟运动和melatonin-NAM治疗。如数据所示3 (f)- - - - - -3 (j),在这些观察自噬标记感应NAM-treated组相比melatonin-NAM cotreatment和控制。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
3.4。褪黑激素变弱NAM-Treated卵母细胞DNA损伤和细胞周期阻滞
探索南积累是否能诱导细胞周期扰动,在卵母细胞DNA修复机制,丰富的特定标记P21, P27、P53, COX2, 8-OxoG调查使用RT-qPCR和免疫荧光。见图4(一)不结盟运动治疗与upregulation P21的信使rna, P27和P53相比melatonin-NAM cotreatment或未经处理的控制。COX2蛋白表达显示一个明显的过度和8-OxoG南唯一治疗而相反的模式下观察褪黑素后管理局(数字4 (b)- - - - - -4 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.5。褪黑激素恢复胚胎的发育能力Post-NAM治疗
我们更进一步不结盟运动治疗后检查胚胎的发育能力的存在和缺乏褪黑激素。如数据所示5(一个)和5 (b),总乳沟和分裂到8 - 16个胚胎的数量,在第四天postfertilization记录,显示大幅下滑下南唯一治疗( 为总乳沟和% %分裂到8 - 16个细胞阶段的胚胎)比未经处理的控制( 为总乳沟和% %分裂到8 - 16个细胞的胚胎阶段)。有趣的是,政府的褪黑激素成功恢复正常发育率( 为总乳沟和% %分裂到8 - 16个细胞的胚胎阶段)。同样,第八天囊胚发育率最低的群南治疗相比melatonin-NAM dual-treated和对照组( %, %, %对应于南、melatonin-NAM和控制,分别5 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们继续调查南和褪黑激素治疗的效果使用微分染色在胚胎的质量。如数据所示5 (d)和5 (e),每胚泡细胞总数显著低于NAM-treated组相比melatonin-NAM派生和控制胚胎( %, %, %为不结盟运动,melatonin-NAM,分别与控制)。自从ICM: TE比可用于评估胚胎的质量(37),我们使用了TE-specific CDX2转录因子免疫荧光的微分染色胚泡。显然,NAM-treated集团展出的最低分数ICM (CDX2-negative)细胞和相应的ICM: TE比率控制相比,而褪黑激素部分规范化这些参数(数据成功5 (d)和5 (e))。
褪黑素的潜在保护作用在不结盟运动发达的胚胎也检查通过检查使用TUNEL检测DNA碎片。结果表明,南管理显著增加,而褪黑激素补充成功减少凋亡细胞的数量在第8天胚泡( %, %, %为南、melatonin-NAM和控制胚泡,分别数据6(一)和6 (b))。
(一)
(b)
3.6。褪黑素与南甲基化信号通路
澄清背后的潜在机制保护作用的褪黑激素对不结盟运动在卵母细胞毒性,不结盟运动的关键基因甲基化的转录模式使用RT-qPCR信号通路进行调查。这些基因包括nicotinamide-N-methyltransferase(生产metNAM NNMT) adenosylhomocysteinase (AHCY,同型半胱氨酸(HCY))和醛氧化酶(AOX1 2 py和4-PY代谢物)。如图7,除了AOX1 upregulation测试基因在卵母细胞的不结盟运动唯一的治疗比未经处理的控制。此外,政府的褪黑素明显表达下调基因转录水平的三个测试(图7)。
4所示。讨论
褪黑激素的抗氧化活性在胚胎发育的过程中已经全面研究,而高南浓度的影响等发育过程已经很少报道(6,7,13,18,38]。迄今为止,少量的褪黑素和不结盟运动之间的潜在联系的背景下影响胚胎的发育尚未阐明。使用牛卵母细胞体外模型,我们试图通过研究阐明这两种生物分子之间的相互作用的影响胚胎发展的不同阶段,不结盟运动管理的存在和缺乏褪黑激素。
卵母细胞成熟,全球之声的发展阶段,信息产业部,成功受精和胚胎发展是一个重要的一步(39]。据报道,肌动蛋白的分布影响卵母细胞的成熟(40,41]。在最近的研究中,卵母细胞的显微镜检查显示,不结盟运动在20毫米,卵母细胞的数量大幅下降,明显挤压极体和那些达到了信息产业部阶段,卵母细胞的成熟。它还影响卵母细胞的丝状肌动蛋白的分布。尽管如此,不结盟运动的压力下补充褪黑激素显著恢复正常的成熟和肌动蛋白形成。张等人报道,符合这个延迟的卵母细胞成熟和肌动蛋白分布在猪卵母细胞暴露在5毫米不结盟运动(18]。此外,褪黑激素的能力保护卵母细胞的有害影响antidevelopmental化合物包括黄曲霉毒素B1,百草枯,鱼藤酮报道(2,5,34,42]。这证实了我们的观察和反映这种松果体激素对卵母细胞成熟的有益作用即使在南浓度高的压力。
我们最近报道,使卵母细胞暴露于高剂量的不结盟运动激活连续释放活性氧(ROS),它可以大大限制卵母细胞成熟和胚胎发展的过程(13]。在目前的研究中,我们继续进行了深入的调查,褪黑素的潜在ROS-scavenging活动的压力下。有趣的是,卵母细胞成熟后melatonin-NAM cotreatment显示降低ROS水平相比南唯一治疗,保证,先前报道,褪黑素对不同有毒化合物的保护作用[2,5,34,42]。
生产过剩的活性氧可以诱导损伤的线粒体,细胞细胞器负责能源生产,通过ROS-induced活性氧释放机制(43]。线粒体功能障碍已被观察到在肥胖、糖尿病、肿瘤、心血管和脑血管疾病(28,31日,44]。在当前的研究中,高发病率异常线粒体分布格局在NAM-treated卵母细胞。值得注意的是,大多数的卵母细胞成熟下melatonin-NAM补充显示均匀分布,卵母细胞质量和发展能力的一项指标(45]。与这些观察结果一致,褪黑激素增强线粒体生物起源,保护猪早期胚胎线粒体损伤后鱼藤酮治疗(42]。,这支持上述的结果下的卵母细胞成熟成熟和ROS褪黑激素/不结盟运动治疗。
它已经表明,诱导细胞凋亡和自噬在IVM消极地影响卵母细胞的成熟和随后的胚胎发展(46,47]。我们之间以前发现高南浓度和诱导细胞凋亡和自噬在卵母细胞(13]。考虑到这一点,我们在此调查是否褪黑素可以防止卵母细胞凋亡和自噬在不结盟运动治疗。检测细胞凋亡的mRNA和/或蛋白质含量(Caspase-3、Caspase-9 BCL2和伯灵顿)和自噬(Beclin-1、LC3A LC3B, ATG7, LAMP1,和LAMP2)标记BCL2和upregulation差别显示对这些其他的基因,在卵母细胞治疗,而规范化的褪黑激素的水平。DNA损伤和ROS生产之间的联系,细胞凋亡,线粒体功能障碍,降低卵母细胞的成熟,细胞周期阻滞,而且,在某些情况下,生育能力损失据报道(48,49]。在目前的研究中,upregulation DNA损伤和细胞周期P21 arrest-related标记,P27、P53, COX2、和8-oxoG观察卵母细胞暴露于南,但褪黑激素明显恢复了正常水平。这证实了先前的研究显示更高的活性氧产量和DNA损伤的发病率在发展中老鼠过度不结盟运动后补充(15),以及与fipronil卵母细胞治疗,一个杀虫剂48,证实了褪黑素的保护作用与NAM-induced卵母细胞的氧化应激。
我们更进一步探讨褪黑激素政府是否在IVM可提供一个长期的保护发展中胚胎。尽管唯一不结盟运动治疗的毒性,褪黑激素成功恢复正常的乳沟,8-16胚胎细胞阶段,和囊胚发育率。此外,高发病率的DNA碎片,降低每胚泡细胞的数量,和更低的ICM指数:TE观察胚胎发达从NAM-treated卵母细胞相比melatonin-NAM cotreatment或未经处理的控制。由于DNA碎片和CDX2-based微分染色通常使用,加上解理和囊胚发育率的评估,评估胚胎植入前的胚胎的质量(50),显然我们的观察发现褪黑素的保护作用发展胚胎通过改进质量。
同样地,我们试图破译背后的潜在机制褪黑素和不结盟运动在卵母细胞相互作用。不结盟运动甲基化,由NAM-N-methyltransferase (NNMT),是不结盟运动的主要途径代谢的哺乳动物。南甲基化的第一个产品是N-methyl-nicotinamide (metNAM)可以进一步处理的有毒代谢产物2 py和4-PY通过醛氧化酶的活性(AOX) [22- - - - - -24]。在当前的研究中,检查关键基因的表达模式参与南甲基化显示显著增加的转录水平NNMT不结盟运动的压力下,强烈地废除了褪黑素的作用。虽然在卵母细胞AOX1水平处理南并没有表现出显著差异控制相比,它在补充褪黑激素显著下调。与我们的结果一致,李强等人报道,南政府在老鼠与增加metNAM而不是2 py和4-PY水平(24]。
澄清的其他代谢途径可能参与metNAM而不是AOX1 upregulation, adenosylhomocysteinase的转录模式(AHCY)的酶转化S-adenosylhomocysteine (SAH)内同型半胱氨酸(HCY) S-adenosylmethionine(同样)甲基化周期,是调查。NNMT利用相同生产metNAM和长官,转化为HCY AHCY [17]。有趣的是,一个戏剧性的表达水平增加AHCY在NAM-treated卵母细胞后目睹了差别而强烈的对这些褪黑激素。符合我们的发现,HCY的参与诱导的线粒体功能障碍大鼠缺血性脑(31日)和繁殖障碍包括生育能力下降,抑制受精,卵母细胞和胚胎的发育能力,复发性流产的风险增加,胎盘梗死和先天性缺陷报告(27,29日,30.]。此外,褪黑素对HCY-induced氧化损伤的保护作用,通过减少Caspase-3和伯灵顿的水平和增加BCL2,一直在观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和老鼠的海马(51,52]。此外,高HCY水平观察pinealectomized鼠标亮点之间潜在联系的松果体褪黑激素和维护HCY水平(53]。
总之,我们所知,这是第一个研究报告,政府的褪黑激素在IVM可以保护牛卵母细胞对高南concentration-induced活性氧积累、细胞凋亡、DNA损伤,线粒体功能障碍,减少了胚胎的发育能力。这可以归因于褪黑激素在调节的潜在参与不结盟运动信号,从而减轻NNMT -甲基化和HCY-induced氧化应激和线粒体功能障碍(图8)。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
ME-S麦构思和设计实验。ME-S进行了实验。ME-S和麦分析数据。ME-S写了初稿的手稿。麦的知识至关重要的修订和手稿上的合理修正。在试剂制备KJ - h和帮助。I-KK监督这项研究。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。ME-S和麦了同样的工作。
确认
这项工作在一定程度上支持的韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府(雾;2020号r1a2c2006614)、韩国研究所的计划和评估技术在食品、农业、林业和渔业(IPET)通过Agri-Bioindustry技术开发项目,由农业部、食品和农村事务部(MAFRA;120066 - 01),BK21四个项目由韩国教育部。
补充材料
补充表1:用于免疫荧光抗体。(补充材料)