文摘

目前的研究进行调查是否饮食β羟基-β-methylbutyrate (HMB)可以调节肝损伤在脂多糖(LPS)挑战小猪模型和确定机制。三十小猪( , 体重)随机分为对照组(基底饮食,生理盐水注射),有限合伙人(基底的饮食),或有限合伙人+ HMB (HMB-Ca基底饮食+ 0.60%)。治疗后15 d有限合伙人和/或HMB,血液和肝脏样本。结果表明,在LPS-injected小猪,HMB补充改善肝脏histomorphological异常引起的有限合伙人的挑战。与对照组相比,血清天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶活性增加LPS-injected小猪( )。有限合伙人的挑战也表达下调的mRNA表达L-PFK, ACO, L-CPT-1 ICDHβ,AMPKα1/2和调节的mRNA表达PCNA,半胱天冬酶3,TNF -αTLR4、MyD88 NOD1, NF -κB p65 ( )。然而,这些不利影响的有限合伙人挑战逆转了HMB补充( )。这些结果表明,HMB可能反对LPS-induced肝损伤,起到保护作用和潜在的机制可能涉及通过调控AMPK改善肝能量代谢信号通路,减少肝脏炎症通过调制TLR4信号通路,不住的点头。

1。介绍

作为一个关键代谢器官和身体解毒的主要网站,肝脏重要的是有助于保护身体免受细菌和有毒产品,如脂多糖(LPS) [1,2]。因此,它主要对动物和人类健康和科学意义维护肝脏健康。有限合伙人是一个组件的革兰氏阴性细菌的外膜。通过识别toll样受体4 (TLR4),有限合伙人可以过度激活免疫细胞,如枯氏细胞(巨噬细胞)和中性粒细胞(3]。TLR4 / 88 - (MyD88)骨髓分化因子介导的通路可以激活核因子-κB (NF -κB)和诱导的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(4]。随后,肝脏炎症反应过度会导致严重的肝损伤,如细胞质液泡化,肝细胞的核溶解,破坏肝细胞索和炎性细胞浸润5]。此外,炎症性肝损伤肝脏中往往伴随着能源供应不足(6,7]。因此,调节肝脏炎症反应中扮演着重要的角色在衰减LPS-induced肝损伤。许多研究人员的共同努力下,几个营养补充剂(如天冬氨酸,n -乙酰半胱氨酸常软骨素硫酸盐提取滑冰软骨,和α酮戊二酸)已被证明有可能缓解LPS challenge-induced肝损伤(6- - - - - -9]。尽管这些有趣的观察,但它仍然是迫切需要找到廉价的药物,医生和动物生产商更可取。

β羟基-β-methylbutyrate (HMB)是亮氨酸的导数和酮酸的代谢在肝脏亮氨酸α-ketoisocaproate加双氧酶(10]。研究表明,HMB作为营养补充起到积极作用在动物和人类在压力或炎症条件下11- - - - - -13]。我们最近报道说,饮食补充0.60% HMB防止肌肉蛋白质降解和减轻肠道损伤LPS-challenged小猪(12,13]。鉴于其在炎症条件下有益的角色,我们假设HMB也可能起到积极的角色在肝脏LPS-challenged小猪。有趣的是,最近的证据指出,一个强大的关系HMB补充和肝脏的健康。首先,HMB补充肝脏移植手术后的病人是安全的报道和耐受性良好14]。提供了进一步的证据发现HMB施加有益的影响在改善胰岛素抵抗通过抑制大鼠肝脏中葡萄糖转运蛋白2型(15]。这些代谢增强,有关HMB让它主要基质用于患有肝损伤。令人惊讶的是,尽管大部分内生HMB是肝脏中生成的,很少有报道关于HMB补充的影响与肝病学科。因此,进一步研究无疑是必要的。

因此,我们在这里寻求确定HMB可以减弱肝损伤LPS-challenged刚断奶的小猪,如果是这样,说明底层机制。猪是类似于人类生理学和解剖学、和猪模型因此被认为是一个很好的动物模型为研究人类营养学和生理学16,17]。目前的结果将提供洞察HMB的行动的机制在肝脏的小猪,也提供有用的信息在炎症条件在人类营养改善肝损伤。

2。材料和方法

2.1。和实验动物的饮食

本研究的动物使用协议委员会批准的动物保健研究所的亚热带农业,中国科学院。三十健康猪(长白猪, ,巴罗 )是选择和随机分配到三组( ):(1)nonchallenged控制(CON);(2)LPS-challenged控制(有限合伙人,大肠杆菌血清型055:B5;σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国);(3)有限合伙人+ 0.60% HMB-Ca治疗(有限合伙人+ HMB;HMB-Ca, , ,Sipu生化有限公司、张家港市、中国)。HMB-Ca和有限合伙人剂量使用依照我们之前的研究(12]。天1,3,5,7,9,11,13,15的审判,通宵禁食小猪的有限合伙人和有限合伙人+ HMB组腹腔注射LPS,而小猪CON组注射同样体积的无菌生理盐水如前所述[12]。小猪是单独在笼子里( 笔),随意饮食和干净的饮用水。饮食是制定满足仔猪的营养需求根据国家研究理事会(NRC,补充表1)[18]。实验持续了15天。

2.2。样品收集

所有的猪都被电惊人(250 V, 0.5 A, 5 - 6 s)和放血3 h有限合伙人或生理盐水注射后15天的审判。在屠宰之前,血样经颈静脉和离心机在4°C 3000×g 15分钟血清中恢复过来,这是存储在-80°C,直到进一步分析。屠宰后,肝脏样本立即迅速获得并固定在4%甲醛或储存在-80°C,直到进一步分析。

2.3。血清生化参数

的浓度血清天冬氨酸转氨酶(ASAT)、丙氨酸转氨酶(ALAT)、碱性磷酸酶(AKP)和谷酰基转肽酶(GGT)进行了分析使用生化分析仪器(贝克曼CX4)和商业工具(中德北京工长生物技术有限公司、北京、中国)。

2.4。肝脏形态

24小时后固定,肝脏形态学检查如前所述[19]。

2.5。逆转录和实时定量PCR

定量rt - pcr分析是根据我们之前的研究(20.,21]。简单地说,肝组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。选择基因的引物序列见表1。目标基因的表达相对于管家基因(β肌动蛋白)决定的方法(20.]。

2.6。免疫印迹分析

相对蛋白质含量claudin-1(美国马表达载体技术,丹弗斯)和p-AMPKα(Thr172细胞信号技术公司,丹弗斯,妈,美国)经肝组织免疫印迹技术测定根据我们先前的研究[22- - - - - -24]。蛋白质的乐队是可视化使用化学发光试剂(美国罗克福德皮尔斯)ChemiDoc XRS系统(美国Bio-Rad、费城、PA)。我们量化的合成信号使用Alpha成像仪2200软件(αInnotech公司、钙、美国)和归一化数据与内部控制的价值β肌动蛋白或相应的总蛋白。

2.7。统计分析

所有数据的单向方差分析在这项研究中分析了SAS软件9.2版本(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国),紧随其后的是邓肯的多个测试来确定治疗效果。结果意味着标准错误。显著的差异意味着被视为统计不同 。

3所示。结果

3.1。肝脏形态

诈骗相比,猪LPS处理表现出肝损伤、肝细胞caryolysis就是明证,karyopycnosis, hypatocyte液泡化,和肝细胞索排列紊乱,炎性细胞浸润,成纤维细胞增殖,并且在肝血窦充血(数字1(一)和1(b))。此外,肝脏的损伤引起的有限合伙人在很大程度上恢复了HMB补充(图1(c))。

3.2。血清生化参数

提出了图2,血清ASAT和AKP的活动增加了有限合伙人的挑战,和这些参数的高度几乎是相反的控制饮食猪HMB补充( )。血清ALAT活动和GGT没有显著不同的组间( )。

3.3。肝脏能量代谢相关基因的mRNA表达

碳水化合物代谢的基因的mRNA表达(己糖激酶2、Hexok2;磷酸果糖激酶,L-PFK;丙酮酸激酶(PK;丙酮酸脱氢酶、PDH)、脂肪酸氧化(acyl-coenzyme氧化酶,算法;肝肉碱palmitoyltransferase我L-CPT-1)和三羧酸循环(柠檬酸合成酶、计算机科学;异柠檬酸脱氢酶β;异柠檬酸脱氢酶γ,ICDHγ在猪的肝脏是图所示3。与诈骗相比,有限合伙人挑战的mRNA表达显著下调算法和L-CPT-1 ( )并倾向于表达下调的mRNA表达L-PFK ICDHβ( )。在LPS-challenged猪,HMB补充调节L-PFK的mRNA表达,L-CPT-1, ICDHβ( )并倾向于增加ACO mRNA表达( )。

3.4。肝脏基因的mRNA表达相关的传感网络的能量

活化蛋白激酶的mRNA的表达α(AMPKα)1/2,过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α(PGC-1α),无声的信息监管机构1 (SIRT1)猪的肝脏是图所示4。案子,相比显著降低AMPK的表达α1,AMPKα2所示猪的肝脏治疗后与有限合伙人( )。在LPS-challenged猪,HMB补充倾向于增加AMPK的mRNA的表达α1,AMPKα分别为2 15.85%和22.37%,但这些减少未达到统计学差异( )。饮食治疗没有显著影响的mRNA表达Sirt1 PGC-1α( )。

3.5。肝脏的mRNA表达细胞增殖核抗原(PCNA)、Caspase-3,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),热休克蛋白70 (HSP70)

如图5,相比,有限合伙人挑战显著调节肝脏的mRNA表达PCNA,半胱天冬酶3,TNF -α( )。猪LPS处理相比,HMB补充显著降低半胱天冬酶3 mRNA表达( )和增殖细胞核抗原、TNF的表达下调mRNA的表达α分别为14.07%和11.02%,但这种减少未达到统计学差异( )。饮食治疗没有显著影响Sirt1的mRNA表达和PGC-1α( )。

3.6。肝脏的mRNA表达TLR4和Nucleotide-Binding寡聚化域蛋白质(点头)及其下游信号

如图6,有限合伙人挑战显著调节肝脏TLR4的mRNA表达,MyD88 NOD1和NF -κB p65相对于反对( )。饮食补充HMB LPS-challenged猪的mRNA表达显著下调MyD88和NF -κB p65 ( )和减少的mRNA表达TLR4 NOD1 16.30%和8.27%,分别,但这种减少没有达到统计学差异( )。

3.7。P-AMPK肝脏蛋白表达α和Claudin-1

如图7没有显著的影响,观察肝claudin-1蛋白表达,以应对饮食治疗( )。AMPK的磷酸化α表达下调了有限合伙人的挑战相对于saline-injected猪( )。有限合伙人相比猪,HMB补充显著增加p-AMPK的蛋白表达α( )。

4所示。讨论

HMB的角色意识的许多生物和生理过程包括肝脏生理是增加14,15]。我们之前的研究表明,膳食补充0.6% HMB减轻生长抑制和肠道损伤LPS-challenged刚断奶的小猪(12,13]。在目前的研究中,我们扩展到肝脏调查0.6% HMB补充肝损伤的影响。我们发现在有限合伙人的挑战,血清ASAT活动和AKP(有用的肝损伤的生化指标8,25])都增加了。这些发现表明,有限合伙人可能会导致肝损伤。进一步证明了有限合伙人的挑战和肝损伤之间的关系来自肝脏组织病理学改变的结果,包括炎症白细胞渗透和核溶解,karyopyknosis,肝细胞的空泡形成,出血。这些与其他研究结果一致2,8]。有趣的是,HMB降低血清ASAT AKP和改善活动LPS-induced heptatocyte caryolysis, karyopycnosis,纤维母细胞增殖。这些发现表明,HMB提供了一个有益的影响肝损伤的抑制作用。

HMB的评价机制模式的行动,我们开始研究分析基因的mRNA表达与能量代谢有关。首先,我们发现HMB补充调节PFK的mRNA表达,ACO, L-CPT-1, ICDHβ在肝脏的LPS-challenged小猪。PFK参与催化糖酵解的第一步,也就是说,到葡萄糖磷酸化的葡萄糖- 6 -磷酸生产ATP和丙酮酸(26]。ICDHβ三羧酸循环的一个关键酶,从细胞溶质传输的代谢中间体到线粒体支持柠檬酸循环(27]。配电网和L-CPT-1与脂肪酸氧化的过程,这是一个重要的能量来源(7]。因此,当前研究的结果表明,HMB在某种程度上,可以促进糖酵解,脂肪酸氧化,柠檬酸循环产生更多ATP减轻LPS-induced能源压力在肝脏的小猪。这种改善肝脏能量状态促使我们调查HMB补充能否激活AMPK肝脏的信号通路LPS-challenged小猪。AMPK细胞传感器的能量状态;它的功能恢复细胞ATP通过关闭合成代谢过程(进一步ATP消费)的分解代谢(ATP生成)。增强的AMPK激活报道减弱LPS-induced损伤严重程度的组织如肝脏、肠、肺动物(7,13,28]。在目前的研究中,HMB补充调节AMPK的mRNA的表达α1/2的肝脏LPS-injected小猪,伴随着AMPK升高α磷酸化。总体而言,这些数据表明HMB补充导致一种改进的能量状态LPS-injected肝脏受伤的小猪通过激活AMPK信号通路。

除了能源以外,包括细胞增殖和凋亡细胞营业额也会影响组织的完整性和体内平衡29日,30.]。特别是,不成熟的细胞凋亡发生在错误的信号级联反应组织病理条件下。另一方面,受伤的细胞增殖失控,可能成为大规模当他们无法进入癌细胞凋亡通路(31日]。在这项研究中,我们发现,有限合伙人挑战了肝细胞增殖和细胞凋亡,就是明证调节增殖细胞核抗原、caspase-3的信使rna表达水平。其他研究证实这些结果(32]。与预期一致,信使rna表达水平的肝脏中PCNA caspase-3 LPS-challenged小猪在应对HMB补充调节。这些结果表明,抑制肝细胞增殖和细胞凋亡可能是一个促进机制改善肝脏健康的LPS-injected小猪HMB补充。

吸引了降低血清促炎细胞因子水平在HMB补充(12),我们想知道HMB可以改善肝脏炎症反应改善肝脏的完整性。符合我们血清TNF -α数据,我们发现肝肿瘤坏死因子-αmRNA表达调节后的有限合伙人挑战,这种高度的LPS-challenged小猪HMB治疗。证据显示,促炎细胞因子的生产过剩会导致肝损伤(33,34]。因此,这些数据表明HMB可能发挥作用在减少肝脏LPS-induced炎症,这促使我们进行深入研究探讨的潜在机制。TLR4和NOD1/2是最受欢迎的信号等主要应对有限合伙人和触发炎症反应的激活35,36]。在这项研究中,好的按照改变血清TNF -α水平和肝脏肿瘤坏死因子-αmRNA表达,我们观察到mRNA表达TLR4和MyD88 (TLR4信号相关基因),NOD1(点头信号相关基因),和NF -κB p65增加肝脏的LPS-injected小猪,然后由HMB逆转。因此,抑制肝TLR4信号通路,不住的点头的LPS-injected小猪可以一个可能的机制来解释HMB对抗肝损伤的能力。类似的结果在resistance-trained男性( ),HMB降低TNF -循环α和肿瘤坏死因子-α受体1的表达在复苏(37]。综上所述,我们扩大了范围从肌肉和肝脏和小肠证明从LPS-induced HMB还可以保护肝脏组织损伤通过抑制TLR4信号通路,不住的点头。

总之,我们的数据表明,膳食补充HMB可以改善肝损伤LPS-challenged小猪。HMB这些有益的影响可能是通过调控AMPK与改善肝能量代谢相关信号通路,减少肝脏炎症通过调制TLR4信号通路,不住的点头。这些发现有助于开发新的干预措施改善肝损伤和功能障碍在动物和人类暴露于内毒素。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yehui段和Bo歌曲同样这项研究做出了贡献。

确认

本研究由国家自然科学基金委共同支持的中国(31802077,U19A2037, 31972582);长沙的优秀青年创新训练计划(kq2009020);广西自然科学基金(2020 jja130102和2018 jjb130239);湖南创新型省份建设专项资金项目(2019 nk2193和2019 rs3022);中国农业研究系统的专项基金(CARS-35);的“战略重点研究项目”中国科学院(XDA24030204);阜阳师范大学进行阜阳科技项目(SXHZ202007);和开放基金在亚热带地区农业生态过程的重点实验室,中国科学院(ISA2020203和ISA2020204)。

补充材料

补充表1:成分和营养水平的饮食(风干基础上,%)。(补充材料)