文摘
百里香醌(TQ)的活性组分黑种草传统和现代药物,具有许多好处。这项研究检查了Nano-TQ的单剂量的影响慢性重复性引起的肺损伤气管内的安装脂多糖(LPS)。老鼠收到有限合伙人连续8周每周两次通过气管内的安装和一剂TQ-PLGA NPs最后剂量LPS后的第二天。六大鼠每组8 - 10周,后被牺牲和采集样本进行分析。重复的气管内的安装LPS引起的组织病理学改变,包括肺泡的部分或完全阻塞,间质水肿,温和的成纤维细胞的增生,纤维链除了淋巴细胞和浆入渗,胎型,支气管扩张,头肥厚的小动脉,和其他人。调查的超微结构显示突出坏死pneumocytes染色质的有效性和残余坏死碎片在肺泡腔缩小LPS-induced老鼠。TQ-PLGA NPs有效改善LPS-induced老鼠的肺组织病理学和超微结构的改变。此外,TQ-PLGA NPs显著减轻血清il - 10水平和TGF -β1在LPS-induced老鼠。总之,TQ-PLGA NPs预防肺部炎症和组织损伤的老鼠挑战重复气管内的有限合伙人的安装。因此,TQ-PLGA NPs代表一种很有前途的候选人LPS引起的肺损伤的预防,等待进一步的研究来确定它的安全性和确切的保护机制。
1。介绍
慢性气道炎症会导致呼吸道疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD),导致重大的经济和社会负担1,2]。慢性气道炎症引起持续肺损伤(PLI)引起的细菌感染3,4]。大量的传染性微生物需要激活先天免疫系统,主要是中性粒细胞和巨噬细胞。在照明灯具,多种炎症细胞和介质被激活,解决炎症机制受损(1,5- - - - - -7]。通常为了应对微生物感染,的toll样受体)调节巨噬细胞的激活。通常是模式识别受体(PRRs)以及先天和适应性免疫的基本监管机构(8,9]。脂多糖(LPS),细菌细胞壁的主要成分(10,11),刺激地,促进核转录因子的激活κB (NF -κB)和随后的释放促炎细胞因子(12]。因此,抑制NF -κB信号通路可以代表一个策略来表达下调过度的炎症反应。在肺疾病、细胞因子和炎症因子,如转化生长因子(TGF -β1)和白介素- 10 (IL),公布从受伤的组织,促进肺纤维化13,14]。TGF -β1被认为是肺纤维化(背后的关键因素15]。除了其效果在静止的成纤维细胞的分化转化成myofibroblasts,它是肺泡epithelial-mesenchymal转换的基本诱导物(16]。有趣的是,激活TGF -β1是由il - 10,可以参与衰减纤维化(17]。
百里香醌(TQ)是主要的活性化学成分黑种草精油。TQ是一种有效的抗氧化剂和抗炎剂(18- - - - - -20.在呼吸系统疾病[]和一个潜在的治疗效果21- - - - - -23]。TQ防止有毒的药物如bleomycin-induced肺纤维化(24,25),gentamicin-induced肾脏和肝损伤(19,20.),和二氧化钛nanoparticle-induced毒性26]。然而,它在有效性由于其局限性狭窄治疗窗口和口服生物利用度差27,28]。TQ是一种疏水性的分子,水溶性差和可怜的配方。TQ-nanoparticles (TQ NPs)显示潜在的抗氧化和抗炎作用29日,30.和改进的口服生物利用度和配方21,31日]。保利lactic-co-glycolic酸(PLGA)改善TQ NP鼻内政府的药物动力学和药效学特性(32]。此外,之前的一项研究报道,TQ-PLGA NPs拥有能力减弱bleomycin-induced肺纤维化通过抑制氧化应激和炎症(33]。因此,本研究探索成立TQ-PLGA-PVA NPs在慢性肺损伤的改善作用引起的重复气管内的(电脑)滴剂LPS的老鼠和它对血清TGF -调节的影响β1和il - 10的水平。
2。材料和方法
2.1。设计TQ-PLGA Nanoemulsion
使用固体纳米粒子是准备与PLGA /油/水(S / O / W)溶剂蒸发法如前所述[21,34与一些修改(图)1)。美国,PLGA(σ)是溶解在HPLC-grade二氯甲烷(DCM)作为油相12 h紧随其后获得统一的解决方案添加5毫克TQ(σ,美国)。悬架是用2分钟生成S / O主要乳液与20毫升的水相乳化与聚乙烯醇(1%生理盐水 )形成S / O / W乳液使用电磁搅拌器在400 rpm。混合物是涡在高设置为10秒之后,声波降解法(20 KH2) 3分钟来生成最终的S / O / W乳液。有机溶剂使用旋转蒸发器蒸发在50°C。在10000转离心20分钟后在4°C,合成材料收集和resuspended 2%蔗糖。粒子的形状和大小被证实使用透射电子显微镜(TEM) (35]。TQ-PLGA NPs的特点是在我们以前的工作报告(33]。暂停TQ-PLGA NPs展出浑浊的白色,和纳米颗粒球形形状和20 nm(10 - 30海里)大小的封装效率为80%。
2.2。封装TQ-PLGA NPs的效率(EE)
纳米粒子悬浮受到离心30000 rpm,持续15分钟。上层清液被删除,1毫升的甲醇是添加到沉积物声波降解法处理了5分钟,然后注入高效液相色谱法测量TQ操作的数量。EE为80%计算使用以下方程(21]:
2.3。动物和治疗
48男性健康的白化大鼠称重 ,从动物屋获得Zagazig大学被用于这个调查。动物们被安置在标准条件下,给定一个免费的水和一个标准的饮食(El-Nasr化学公司、埃及)。指南的研究根据美国国立卫生研究院(NIH出版85号- 23,2011年修订),并经当地的动物保健Zagazig大学审查委员会(伦理批准文号:ZU-IACUC / 2 / F / 71/2020)。
动物适应一周,分成4组分配如下:我(控制):收到集团it滴剂8周的每周盐水两次。组II (TQ-PLGA NPs):收到it盐水连续8周每周两次滴注法和单剂量it TQ-PLGA NPs在最后一次剂量的生理盐水后的第二天。第三组(LPS):收到it滴剂LPS溶解在盐水连续8周每周两次。第四组(有限合伙人+ TQ-PLGA NPs):收到it滴剂LPS溶解在盐水连续8周每周两次和一个it剂量的TQ-PLGA NPs有限合伙人的最后一剂后的第二天。
有限合伙人和TQ-PLGA NPs it灌输如前所述[36,37用细微的修改。总之,氯胺酮/ xylazine-anesthetized老鼠固定在他们回到玻璃板70度的角。有限合伙人(大肠杆菌055年:B5;美国σ)和TQ-PLGA NPs溶解在盐水和灌输到气管的剂量水平2毫克/公斤体重[33]。it使用3-gauge静脉滴注法进行塑料针连接到注射器0.3毫升空气紧随其后。老鼠被放置在一个垂直的位置和旋转1分钟内均匀地分配慢慢灌输了肺部。
六大鼠每组牺牲在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后24 h TQ-PLGA的滴剂NPs(8周)和10周的最后一天(10周)从实验的开始。总损伤记录,收集血液样本通过心脏穿刺,凝结了30分钟,10分钟和离心机在3000 rpm,血清分离。标本的肺组织病理学的中性缓冲福尔马林固定在10%,和其他快速标本保存在TEM 2.5%的戊二醛。
2.4。组织病理学
检查组织标本缓冲福尔马林固定在10% 24 h。保存组织处理常规的石蜡包埋技术(38]。组织病理学变化进行评估通过光学显微镜半定量的病变评分系统。病变评分为代表,正常;+,温和;+ +,温和;和+ + +,严重的如前所述39]。
2.5。超微结构评估
超微结构检查,肺样本快速修剪成细部分锋利的刀片和固定在2.5%戊二醛(pH值7.2)4 h然后把1.33%四氧化锇在一夜之间在4°C脱水和间隙紧随其后。样本嵌入在环氧树脂,sem-thin部分是通过超微切片机,甲苯胺蓝染色和评估光学显微镜检测病变(40]。检测的部分处理后的病变组织在网格和染色采用劲性砼对柠檬酸铅和铀。最后,ultrasections评估了TEM (JEOL jem - 1230)。
2.6。评估TGF -β1和il - 10
血清il - 10水平分别使用一个特定的酶联免疫试剂盒(猫。不。美国RayBiotech ELR-IL-10), TGF -β1是由酶联免疫试剂盒测量(猫。不。美国BioVision K4344)根据制造商的指示。的敏感性TGF -β1酶联免疫试剂盒是< 1 pg / ml,而il - 10的敏感性工具包是10 pg / ml。
2.7。统计分析
结果il - 10和TGF -β1使用双向方差分析统计分析GraphPad棱镜7图基的测试。并给出了结果 (SEM) 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。临床症状和总结论
老鼠没有遭受任何临床症状或死亡在整个实验过程。对照组显示正常的肺组织形态学8和10周。补充的TQ-PLGA NPs正常大鼠施加没有改变,只有焦温和的顶端观察肝样变区域。总值图片显示的效果重复it滴剂LPS的8 - 10周显示合并作为一个贫困地区,一般小型小叶。此外,TQ-PLGA NPs恢复了正常大小的小叶还是小红的肺疫源地LPS-challenged老鼠(图2)。
3.2。组织病理学研究
检查部分牺牲老鼠收到重复的it盐水显示正常的组织形态学结构的肺泡和航空公司有轻度水肿,8周后产生的。10周后,所有结构都是正常的,没有任何改变,除了轻微的个人拥挤的血管和局限性肺气肿(数字3- - - - - -5)。部分牺牲老鼠对待TQ-PLGA NPs在8周显示激活肺泡巨噬细胞含有NPs和近正常航空公司除了几个小腔内粘膜脱落。此外,近正常血管和毛细血管与温和有液泡的媒体随后水肿被观察到在一些老鼠。10周后,部分显示拥挤与一些肺毛细血管包含NPs泡沫细胞,而航空公司小液泡和血管出现正常(包含数据3和4)。
检查部分从老鼠收到重复的信息。有限合伙人连续8周每周两次显示慢性肺炎由慢性肺泡内渗出物和完全或部分梗阻由于间质水肿和温和的成纤维细胞的增殖。这些改变以及小纤维链旁淋巴细胞和浆入渗的观察在大多数部分。肺泡遭受了肺泡上皮细胞的增生,肺气道显示部分障碍物的细支气管(支气管扩张)由于厚粘液材料混在炎症细胞。过分生长小动脉壁被注意到,一些气性肺泡显示墙的部分透明样变化。10周后(两周后最后剂量LPS),病变在大多数牺牲老鼠仍强烈和明显,由扩散和大型长期活跃肺区域由坏死肺泡组织入侵扩散和增生性pneumocytes II型肺泡巨噬细胞(泡沫细胞)。航空公司遭受了缩小由于杯状细胞化生(数字3和4)。
部分大鼠治疗TQ-PLGA NPs有限合伙人和牺牲在治疗后24小时后仍然显示肺部病变的改善肺泡隔增厚的特点是大量泡沫细胞含有黑蓝色颗粒纳米粒子除了没有渗出物在大多数肺泡腔。许多活跃的巨噬细胞(泡沫细胞)与有液泡的细胞质倾向形成合胞体巨大的细胞在牙槽间的主要组织。航空公司仍然显示一点粘液和粘膜炎症细胞和杯状细胞化生(数字3和4)。
重复LPS引起的组织病理学改变it滴剂和TQ-PLGA NPs归纳在表格的改善效果1。
3.3。超微结构发现
肺部的超微结构控制和TQ-PLGA NP组出现正常没有改变(图5)。肺气道损伤的超微结构发现,血管,肺泡和肺隔LPS-treated老鼠如表所示2。检查肺组织超微结构从老鼠收到重复的信息。有限合伙人显示突出坏死pneumocytes染色质的有效性和残余坏死碎片从胞质细胞器,扩展到狭窄的肺泡腔。10周后,LPS-challenged老鼠显示突出被破坏、坏死pneumocytes没有任何胞质细胞器与染色质的有效性和pneumocytes表面微绒毛。相比之下,老鼠接受TQ-PLGA NPs显示一些胶原纤维沉积除了有液泡的pneumocytes空层状的身体,有时含有纳米材料在8周,和近正常pneumocytes核染色质和突出有液泡的细胞质与小片状材料以及纳米材料以及突出恢复pneumocytes 10周后的超微结构特征(图5)。
3.4。TQ-PLGA NPs改善血清il - 10水平和TGF -β1 LPS-Challenged老鼠
LPS组的大鼠有显著提高血清il - 10(图6)和TGF -β1(图7)水平与对照组大鼠相比( )。管理TQ-PLGA NPs改善血清il - 10和TGF -β1水平在正常大鼠LPS-challenged老鼠没有影响。
4所示。讨论
百里香醌是一种很有前途的化合物具有很强的抗氧化和抗炎活动在体外而在体内。在目前的研究中,我们使用LPS-induced慢性肺损伤大鼠模型探讨Nano-TQ的潜在影响。原油TQ操作可以在高剂量和毒性引起过敏性皮炎和水溶性较差。要克服这些缺点,可生物降解和生物相容性的聚合物纳米粒子将TQ交割的有吸引力的替代品。Nano-TQ的给药途径是在气管滴注法加强当地TQ对肺的影响免疫系统,避免系统注入,因为它是疏水性,应该慢慢地传播(41,42]。
在我们的实验中,大鼠的肺组织收到重复剂量LPS的特点是许多慢性病变,包括严重的缩小(支气管狭窄)由于活跃的慢性细支气管炎粘液分泌物和杯状细胞化生。Harkema结果部分地同意和霍奇注意到气管和支气管气道粘液细胞化生的老鼠暴露在重复剂量的有限合伙人(43]。类似的发现增加了由Stolk等人描述肺支气管粘液细胞增生的仓鼠由于重复it安装有限合伙人为5周(44]。此外,其他研究人员注意到增厚拼凑而成的气道壁肌动蛋白染色后长期接触玉米粉尘提取物在小鼠45]。另一方面,我们的发现包括BALT增生与著名的有丝分裂和核破裂生发中心的活动。这些发现金子不同意等人认为增稠的航空公司由于白细胞浸润到BALT [46]。此外,后来作者注意到气性肺泡内炎症细胞渗入,肿胀除了航空杯状细胞增生,肺泡壁和大量的炎症细胞的渗透主要是巨噬细胞和中性粒细胞从有限合伙人暴露15分钟后通过喷雾器(46]。
在我们的工作还包括肺气肿病变和支气管粘液细胞增生。之前的研究发现,中性粒细胞招募和neutrophil-derived弹性蛋白酶可以诱发肺气肿,支气管粘液细胞增生(44),发现与当前的研究一致。此外,抑制弹性蛋白酶导致防止LPS-induced肺气肿,支气管粘液细胞增生(在较小程度上44]。此外,Khedoe等人发现肺气肿和巨噬细胞数量的增加,肺泡的破坏,在牺牲小鼠中性粒细胞入渗的有限合伙人管理20周(每周两次)(47]。本研究的结果表示杰出的肺气肿大鼠的存在牺牲8和10周后同意芬利的结果和他的大学认为肺气肿的存在可能是由于慢性阻塞性肺病(48]。他们还证明BALT浓度的增加和巨噬细胞的表达矩阵metalloproteinase-1(金属蛋白酶- 1)和MMP-9 [48]。
之前类似的结论报告表明肺气肿的机制包括激活巨噬细胞的有限合伙人释放和elastolytic酶(蛋白酶),主要MMP-2 MMP-9, MMP-12,细胞因子趋化中性粒细胞(49- - - - - -51]。同时,肺气肿可以负责肺实质破坏,包括肺泡壁和毛细血管床(51]。
部分或完全阻塞肺泡(慢性牙槽炎)伴随着间隙扩散和激活pneumocytes一起肺泡巨噬细胞在LPS-challenged老鼠是很常见的。类似以前的调查报告的结果显示,慢性牙槽炎可以归因于大量单核白细胞入渗的主要巨噬细胞在肺实质和粘液细胞化生在航空公司52,53]。我们的结果指出,有限合伙人是一个强大的激活的巨噬细胞。此外,常驻巨噬细胞被激活淋巴因子诱导一个破裂的细胞因子主要通过NF -κB激活(53]。肺部隔了变量的厚度由于纤维母细胞增殖除了气道纤维化。气道纤维化是解释为一致的和重复的有限合伙人管理导致连续渗透和激活的中性粒细胞,其次是增加TGF-1的表达式进行航空公司(54]。
目前的研究表明增加TGF -β1水平协议与以前的报告显示,细胞因子在慢性阻塞疾病参与组织重构和增加TGF -的表达式β1,激活成纤维细胞的增殖(55,56]。Savov等人也注意到牙龈炎性细胞浸润和纤维蛋白的沉积航空和肺组织高水平的MMP-9有限合伙人的日常接触后8周(4 h /天57]。
LPS-challenged老鼠的肺接受单剂量TQ-PLGA NPs透露许多改善事件和再生尝试改造大部分肺架构。少数一些BALT和肺上皮细胞凋亡是遇到,可以归因于TQ通过p53-independent细胞凋亡诱导的抗增殖作用,通过激活caspase-8, caspase-9, caspase-3半胱天冬酶级联(58]。此外,据报道,TQ可以充当一种活化剂对p53基因及其下游区p21WAFI并最终减少凋亡蛋白bcl - 2 (59,60]。TQ-PLGA NPs的慢性病变的改善作用,主要是纤维化,肺气肿,并增厚肺泡和肺隔膜了。我们的结果完全与El-Khouly等人的研究结果报道,TQ缓解肺纤维化的进展博来霉素诱导的大鼠(61年]。
TQ中和肺气肿的肺泡,炎性细胞浸润,增生性淋巴细胞周围的细支气管,和过度的NF -κB在bleomycin-induced大鼠肺组织(61年]。的改善效益TQ-PLGA NPs记录在本研究按照坎特谁注意到可能的有利影响n .漂白亚麻纤维卷种子在实验后的雄性小鼠肺损伤肺志向不同的材料(62年]。研究表明,相同n .漂白亚麻纤维卷治疗显著降低支气管旁炎症细胞浸润,肺泡间隔炎症细胞浸润、水肿、肺泡渗出物、间质纤维化、肉芽肿、肺坏死(62年]。
超微结构的变化由于有限合伙人包括严重增厚blood-air壁垒,pneumocytes发展迅速,成纤维细胞,巨噬细胞,过量的胶原原纤维。Pneumocyte II型表现出凋亡变化表现为核染色质浓缩,核膜扭曲,胞质细胞器的部分损失,萎缩的细胞膜。Pneumocyte II型细胞质空泡形成包含异常或空层状的身体,megamitochondria,表面微绒毛的部分损失。通常,pneumocyte II型覆盖5%的肺的内部表面积而pneumocyte I型细胞覆盖其余表面(63年]。他们分布在慢性肺损伤缺陷。这项研究的结果是同意将等人报道,表面活性剂提高血小板衍生后激活因子(表面活性剂分泌强烈刺激器)发布的巨噬细胞受到有限合伙人(64年]。此外,有限合伙人也可以刺激表面活性剂由代理直接在pneumocytes II型细胞分泌(65年]。
在这个调查中,并扩散激活巨噬细胞主要是由于肺泡内单核细胞分化成巨噬细胞是符合Domenici-Lombardo等人的观察发现pneumocytes II型增生的间质成纤维细胞和肥大48 h后5毫克/公斤有限合伙人滴剂在大鼠66年]。血液中的单核细胞出现在12 h然后从肺泡毛细血管和间质和分化成巨噬细胞24小时(66年]。上述结果不同意Vernooy等人报道,巨噬细胞的数量减少1周后康复有限合伙人管理8周(每周两次)(52]。然而,Ofulue等人表明,长期接触(6个月),吸烟导致增加intra-alveolar巨噬细胞(67年]。LPS-challenged老鼠收到TQ-PLGA NPs显示正常blood-air障碍,许多流露出牙槽间的巨噬细胞包含多个胞浆内的电子致密体(纳米)除了持久性的胶原纤维沉积。大部分胶原沉积遭受collagenolysis一起几退化pneumocytes II型包含电子致密的身体和自由在间质纳米颗粒。老鼠牺牲10周后显示正常blood-air障碍,正常的肺泡pneumocyte我,pneumocyte II型含有胞浆内空泡和浓缩的线粒体。
TQ-PLGA NPs在这项研究中,使用的特点是大约20 nm大小和球形观察支气管上皮内,pneumocytes,巨噬细胞和间质。这些结果与以前的报告部分协议由Hara等人注意到异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭PLGA纳米颗粒内部所有pneumocytes和内皮it安装后大鼠肺(68年]。此外,卡普et al。69年和盖斯等。70年)证实,超细粒子超细颗粒吸入后被检测到。超细粒子可以穿过细胞膜nonphagocytic肺部和培养细胞的机制和可能出现在许多身体的隔间,包括肝脏、心脏和神经系统(70年]。此外,盖斯等人发现20纳米二氧化钛(TiO2)纳米颗粒在大鼠的支气管相关巨噬细胞吞噬溶酶体24 h后吸入(71年]。他们还发现吸入超细TiO2粒子航空和肺泡腔的一侧,并在毛细血管(71年]。老鼠接受TQ-PLGA NPs只有轻微的超微结构变化由线粒体空泡形成和出现密度随着吞噬液泡含有致密材料pneumocyte II型、巨噬细胞、气道上皮。我们的结果部分同意盖斯提到,肺泡巨噬细胞的作用在吸入微观和纳米颗粒的间隙72年]。此外,类似的研究结果报道Penberthy等人证明了支气管上皮细胞的吞噬能力在过敏空气方式(73年]。
TQ-PLGA NPs在LPS-induced肺损伤的改善效果得到了显著减少血清il - 10和TGF -β1。这些结果密切相关的改善肺泡巨噬细胞增殖和活化。在这种背景下,Yanagawa等人报道,巨噬细胞分泌il - 10在人类肺癌患者(74年]。TGF -的表达增加β诱导肺成纤维细胞的增殖的老鼠暴露在有限合伙人为8周前所述[57]。TQ操作的改善效果也被支持的一项研究显示其改善效果在肺血管损害LPS-induced急性损伤(23]。TQ通过调节促炎细胞因子介导的影响(23]。
5。结论
本研究介绍了信息的改善效果TQ-PLGA NPs在慢性肺损伤引起的重复it滴剂LPS的老鼠。管理的一剂TQ-PLGA NPs 8周后挑战与LPS显著改善肺泡的组织学和超微结构的改变,气管和肺血管、降低血清il - 10水平和TGF -β1。鉴于TQ操作的证据确凿的有益的药理活性,TQ-PLGA NPs可以代表一个更好的选择克服贫穷的溶解度和其他因素限制了其治疗应用。
数据可用性
生成数据分析或在本研究包含在这个手稿。
的利益冲突
作者宣称他们没有相互竞争的利益。
确认
这项研究是由科学研究院长以来公主Nourah少女阿大学通过快速研究资助计划。