褪黑素对心血管效应通过抑制NLRP3 Inflammasome-Induced Pyroptosis小鼠心肌梗死

文摘

心肌梗死(MI)诱导心肌损伤主要是由于心肌细胞的损失。Pyroptosis是一种新近发现的细胞程序性坏死,与心肌梗死的进展。褪黑素已被证明对心血管效应对心脏的损害在多种心血管疾病。然而,褪黑激素在MI pyroptosis-induced心脏损伤的作用尚未阐明。这里,我们发现褪黑激素管理改善心脏功能障碍,减少心肌细胞死亡后小鼠冠状动脉结扎和H9C2细胞暴露于低氧。结果还表明,pyroptosis诱导在活的有机体内和在体外,增加NLRP3 caspase-1裂解,GSDMD-N,成熟的il - 1β和地震水平,这些变化是减少褪黑激素治疗。此外,我们发现TLR4和NF -κB水平增加了心肌梗死或缺氧,这些增长被褪黑素逆转。褪黑激素的antipyroptotic作用被废除的TLR4受体激动剂治疗/ NF -κB信号通路。我们的结果表明,褪黑激素可以发挥心血管效应通过抑制NLRP3 inflammasome-induced pyroptosis通过TLR4的调制/ NF -κB信号通路提供强有力的证据,褪黑激素治疗心肌梗死的效用。

1。介绍

心肌梗死(MI)是全球发病率和死亡率的主要原因。人们普遍认为MI可以左心室心肌细胞恶化,加重心脏重构,最终导致心力衰竭(1- - - - - -3]。心肌细胞的死亡就发生在心肌梗死的发生,最终导致心肌损伤(4,5]。尽管再灌注治疗是一种有效的策略来减少梗塞大小,它还加强心肌损伤,称为缺血再灌注损伤(6,7]。因此,有效的识别和创新疗法减少心肌细胞损失可能在心肌梗死的治疗起到了关键的作用。

Pyroptosis是一种程序性细胞坏死的gasdermin家庭。Inflammasomes, multiprotein复合物,被激活在不同病理刺激和随后引发caspase-1的激活。一方面,积极caspase-1有助于通过把gasdermin pyroptosis D (GSDMD)产生的氨基端片段GSDMD (GSDMD-N),这被广泛认为是pyroptosis执行人。另一方面,积极caspase-1也会导致炎症反应,诱导白介素(IL) 1β或地震-成熟8- - - - - -11]。最近的研究表明,pyroptosis参与心肌细胞心肌梗死引起的损失(12,13]。的nucleotide-binding寡聚化域受体家族pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome,最著名的inflammasomes之一,被发现被激活MI和诱导心肌细胞pyroptosis通过触发caspase-1和裂解GSDMD [14,15]。然而,抑制NLRP3 inflammasome MCC950显著降低梗塞面积和改善心脏重构(16]。抑制pyroptosis可以改善心肌细胞损伤引起的心肌梗死(17]。这些研究表明,针对NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis可能是一个有效的策略来减少MI-induced心肌损伤。

神经内分泌激素褪黑激素有多个效果,包括调节昼夜节律和免疫力;影响睡眠;通过效应对氧化延缓衰老,细胞凋亡,纤维化和自噬;和保护线粒体和内质网应激(18]。它已被广泛证明褪黑激素在MI(有保护作用19]。例如,褪黑素可以改善心脏重构通过激活进行Mfn2 Notch1 /途径在小鼠心肌梗死后的心20.]。褪黑激素发挥抗炎活动通过抑制炎性细胞因子的释放,包括il - 1β地震,TNF -α,Nrf2 c反应蛋白和il - 1α的发展,在MI (21,22]。然而,调节心肌细胞pyroptosis褪黑激素是否能在MI仍不清楚。

本研究的目的是评估可能的褪黑素对心肌细胞的影响pyroptosis MI和进一步识别潜在的分子机制。我们的研究结果表明,通过抑制褪黑激素减轻心肌细胞损失NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis通过调制toll样受体4 (TLR4) / NF -κB信号通路和进一步澄清,褪黑素可能是一个有前途的代理为心肌梗死的治疗。

2。方法和材料

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠(称重 )获得哈尔滨医科大学第二附属医院。本研究通过哈尔滨医科大学动物保护和使用委员会和执行符合指南中建议的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院发行的。

2.2。心肌梗死模型和药物治疗

老鼠被随机分为三组:虚假的集团( ),MI组(MI, ),和褪黑激素治疗组(MI + MLT, )。心肌梗死模型生成的方法类似于先前的研究[23,24]。短暂,老鼠被麻醉三溴乙醇(0.2 g / kg)注入。和结扎冠状动脉左前降枝的被曝光,以尼龙缝线24 h。虚假的小鼠组接受相同的没有冠状动脉结扎手术。小鼠心肌梗死+ MLT组管理10毫克/公斤褪黑激素(M5250 Sigma-Aldrich)每天灌胃内的MI手术前14天(25]。虚假的老鼠和MI组被给予同等ddH的体积₂O。

2.3。超声心动图

心脏功能通过使用超声波检测系统(VisualSonics,多伦多,加拿大)MI后24小时。老鼠被三溴乙醇注射麻醉和固定到一个平板。暴露胸部后,左心室收缩直径(LVDs),左心室舒张期直径(LVDd),左心室射血分数(EF)、左心室部分缩短(FS)进行了检测和分析。

2.4。免疫印迹分析

组织或细胞被完全溶解在缓冲区里帕(中国Beyotime P0013B)含有蛋白酶抑制剂(4693159001、罗氏、德国)和磷酸酶抑制剂(4906837001、罗氏、德国)。样品被sds - page凝胶分离,然后转移到一个硝基膜。与5%脱脂牛奶膜被封锁后,一夜之间他们在4°C孵化后抗体:NLRP3(1: 500年,bs - 10021 r, bios),裂解caspase-1(1: 200年,ab207802 Abcam) GSDMD-N(1: 200年,ab215203 Abcam,美国),TLR4 (sc - 293072 1: 200年,圣克鲁斯生物技术),NF -κB (p - 65,1: 200年,sc - 8008,圣克鲁斯生物技术),il - 1β(1:200年,ab254360 Abcam)地震(1:100年,ab207324 Abcam)β肌动蛋白(1:2000年,TA-09 ZSGB)。然后,二级抗体增加,膜在室温下是孵化。洗后一步,灰色的值是评价一个软件数量及进行统计分析。

2.5。实时PCR试验

细胞和组织完全溶解与试剂盒(美国15596026,英杰公司)根据制造商的指示。核糖核酸的浓度决定了NanoDrop乐器。逆转录工具包(Toyobo fsq - 101)被用来合成互补。实时PCR进行使用ABI 7500快速PCR仪器SYBR绿色实时PCR主设备(Toyobo qpk - 201)。引物序列如下:NLRP3(转发:5 - - - - - -CAACCTCACGTCACACTGCT-3 ;反向:5 - - - - - -TTTCAGACAACCCCAGGTTC-3 ),caspase-1(转发:5 - - - - - -ACACGTCTTGCCCTCATTATCT-3 ;反向:5 - - - - - -ATAACCTTGGGCTTGTCTTTCA-3 ),和GAPDH(转发:5 - - - - - -AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3 ;反向:5 - - - - - -TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3 )。GAPDH是用来表达水平正常化的目标。RNA表达水平计算方法。

2.6。细胞培养、药物治疗和缺氧条件

H9C2细胞从美国购买类型文化集合(美国马纳萨斯)和在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM、SH30022.01 HyClone)补充10%胎牛血清和1% penicillin-streptomycin孵化器(5%股份有限公司₂,95%的人啊₂,37°C)。当细胞密度达到70 - 80%,细胞被转移到一个低氧室(95% N₂,5%的人啊₂37°C)和孵化120分钟有或没有褪黑激素(10μM, M5250, Sigma-Aldrich) [26]。

2.7。免疫荧光染色

治疗或治疗H9C2细胞用4%多聚甲醛固定。阻塞后一步,anti-NLRP3(1: 100年,bs - 10021 r, bios)或anti-TLR4 (sc - 293072 1: 100年,圣克鲁斯生物技术)是补充道,和细胞孵化一夜之间在4°C。然后,二次抗体共轭Alexa萤石488 (A11034英杰公司)在室温下添加1 h。最后,细胞核染色与4 ,6-diamino-2-phenylindole (DAPI C0065 Solarbio)。所有图片是在荧光显微镜(日本尼康80 i)。

2.8。免疫组织化学染色

心脏组织被移除,固定和嵌入石蜡。阻塞后一步,主要anti-TLR4抗体(sc - 293072 1: 100年,圣克鲁斯生物技术)是补充道,和组织孵化一夜之间在4°C。第二天,添加二次抗体是在室温下为20分钟。捕获的图像是由显微镜(德国蔡司)。

2.9。钙黄绿素/ EthD-III染色

钙黄绿素AM / EthD-III染色进行根据制造商的指示(美国Biotium 30002)。简单地说,治疗和治疗与PBS H9C2细胞被洗了三次,然后,200μL calcein-AM / EthD-III染色的解决方案是补充道。孵化了40分钟后,细胞被捕获的图像通过使用荧光显微镜(日本尼康80 i)。

2.10。乳酸脱氢酶(LDH)释放试验

上层清液的收集不同群体,LDH检测使用一个LDH测定工具包(中国Nanjingjiancheng A020-2-2)根据制造商的指示。标仪是用于分析每个样品的吸光度值在450海里。

2.11。苏木精和伊红染色(他)

心脏组织在石蜡固定和嵌入式。后的石蜡组织块切成5μ米厚的部分,他染色是由使用一个工具包(G1120 Solarbio)根据制造商的指示。在显微镜下图片收集(德国蔡司)。

2.12。TUNEL染色

心脏组织来自不同团体被嵌入在石蜡,然后切成5μ米的部分。原位检测细胞死亡工具包(11684817910、罗氏、德国)是用于检测细胞死亡后,制造商的指示做了一些调整。deparaffinization之后,TUNEL反应混合物添加到石蜡切片,然后孵化1 h在37°C。细胞核与DAPI染色(C0065 Solarbio)在室温下15分钟。荧光显微镜是用来捕获的图像(尼康80我,日本)。

2.13。统计分析

数据呈现的 。单向方差分析是用来比较组之间的差异与SPSS 22.0软件。 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。褪黑激素减轻心脏损伤MI老鼠

确定褪黑激素是否有心血管效应MI后,我们建立了小鼠模型的MI和预处理小鼠褪黑激素对冠状动脉结扎前14天(图1(一))。TTC染色是用来测量梗死区后24 h MI。MI组的梗死面积明显增加与虚假的集团相比,而褪黑激素管理明显减少梗塞区心肌梗死引起的(图1 (b))。如数据所示1 (c)- - - - - -1 (e)超声心动图数据显示,EF和FS值显著降低心肌梗死小鼠比虚假的老鼠,表明心脏损害被MI在小鼠体内诱导。值得注意的是,EF和FS值都有效地恢复心肌梗死小鼠褪黑激素政府。此外,melatonin-treatment组减少炎症细胞的浸润而MI组(图1 (f))。

3.2。褪黑激素变弱NLRP3 Inflammasome-Mediated心脏Pyroptosis MI老鼠

先前的研究已经表明,pyroptosis导致心肌细胞丧失发展的MI (27,28]。因此,我们下一个决定褪黑素的保护作用是否MI老鼠的心与pyroptosis有关。TUNEL染色表明褪黑激素治疗逆转MI-induced心肌细胞损失(图2(一个))。此外,血清LDH水平显著增加的MI老鼠,这表明等离子体膜破裂。重要的是,褪黑激素政府减少LDH水平(图2 (b))。如图2 (c)pyroptosis GSDMD-N水平,遗嘱执行人,明显增加心肌梗死小鼠的心与虚假的老鼠;然而,这种增加被褪黑激素治疗逆转。这些数据表明,褪黑激素可以抑制pyroptotic心肌梗死引起的心肌细胞死亡。

的NLRP3 inflammasome已被证明是由诱导pyroptosis参与细胞死亡,并抑制NLRP3 inflammasome发挥保护作用在各种疾病29日- - - - - -31日]。确定是否antipyroptotic褪黑素的影响在MI与NLRP3 inflammasome,我们发现这个大multiprotein复杂的变化。在这项研究中,我们发现的蛋白质和mRNA水平NLRP3和裂解caspase-1中减少心肌梗死+ MLT组与心肌梗死组(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。Caspase-1激活是导致心脏损伤诱导il - 1的成熟β或地震。因此,我们也发现褪黑素对il - 1的影响β并在心脏组织的地震。如数据所示2 (g)和2 (h),il - 1的蛋白水平β和地震增加了MI但被褪黑素减少政府。

3.3。褪黑激素能抑制NLRP3 Inflammasome-Mediated心脏Pyroptosis在体外

接下来,我们旨在确定褪黑激素可以减弱NLRP3 inflammasome-mediated心脏pyroptosis在体外。缺氧心肌梗死的发病中起着至关重要的作用;因此,我们建立了一个在体外在H9C2心肌细胞缺氧模型来模拟MI的条件。我们发现,褪黑素显著降低低氧诱导心肌细胞死亡,被EthD-III染色(图3(一个))。此外,LDH水平显著增加心肌细胞暴露于低氧,减少褪黑激素管理(图3 (b))。如图3 (c)后,GSDMD-N水平显著增加缺氧暴露与控制;然而,这种增加被褪黑激素治疗逆转。此外,NLRP3的水平和裂解caspase-1增加在心肌细胞缺氧暴露和被褪黑激素治疗(数据大大减少3 (d)和3 (e))。类似的变化NLRP3被免疫荧光(图观察3 (f))。我们还发现褪黑素对il - 1的影响β和地震H9C2细胞暴露于低氧。如图3 (g),il - 1的蛋白水平β和地震增加了缺氧和减少褪黑激素管理。

3.4。褪黑激素变弱NLRP3 Inflammasome-Mediated Pyroptosis通过抑制TLR4 / NF -κB信号通路在活的有机体内和在体外

先前的研究已经表明,toll样受体4 (TLR4) /核因子-κB (NF -κB)信号通路不仅在MI-induced心肌炎症中起着至关重要的作用,还参与NLRP3 inflammasome-mediated炎症反应(32,33]。因此,我们调查是否antipyroptotic褪黑素的影响在MI与TLR4 / NF -相关联κB信号通路。如数据所示4(一)和4 (b)TLR4的蛋白质含量和NF -κB (p - 65)增加心肌梗死后小鼠的心,而这些增加被褪黑激素治疗逆转。符合在活的有机体内数据,还缺氧诱导增加TLR4和p - 65水平H9C2细胞,和褪黑激素政府大幅下调这些低氧诱导增加(图4 (c))。类似的变化观察TLR4通过免疫荧光试验(图4 (d))。脂多糖(LPS)是一种常见的TLR4 / NF -受体激动剂κB信号通路(34,35]。有趣的是,我们发现,褪黑素的影响在TLR4 / NF -κB信号通路被有限合伙人(图4 (e))。

我们还发现,有限合伙人治疗废除褪黑素减少低氧诱导心肌细胞的能力损失(图5(一个))。重要的是,如图5 (b)- - - - - -5 (f),褪黑素的antipyroptotic效果被有限合伙人治疗,就是明证GSDMD-N减少,NLRP3 caspase-1裂解,和成熟的il - 1β和地震水平H9C2细胞暴露于低氧。这些数据表明,褪黑激素,至少在某种程度上,变弱NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis通过抑制TLR4 / NF -κB信号通路。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们观察到褪黑激素改善心脏损伤MI在H9C2细胞小鼠模型和低氧诱导心肌细胞损伤。我们还表明,褪黑素对心血管效应通过抑制心肌细胞死亡引起NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis在细胞水平。褪黑激素的antipyroptotic效应可能是由于抑制TLR4 / NF -κB信号通路。这些发现进一步支持褪黑激素是一种有效的代理为心肌梗死的治疗。

MI-induced心脏损伤是世界范围的一个主要的死亡原因,主要是由于心肌细胞损失。因为心肌细胞有潜力的小部门,防止心肌细胞死亡被认为是一种有效的治疗心肌梗死的治疗。许多研究发现心肌炎症是心脏功能障碍的一个重要因素在MI进展36,37]。抑制炎症反应是一个潜在的战略,减少心肌细胞的损失在MI (38- - - - - -40]。Pyroptosis炎症相关的细胞死亡,已被证明是参与心肌细胞损失在心血管疾病,如心肌梗死和缺血/再灌注损伤(41,42]。类似于之前的研究,我们目前的研究发现,GSDMD-N, pyroptosis执行人,显著增加心肌梗死小鼠的心和hypoxia-treated H9C2心脏细胞。此外,LDH测定数据显示,MI诱导标志pyroptosis-related形态学变化。然而,预防策略的损失引起的心肌细胞pyroptosis MI的进展仍不明朗。

褪黑素是松果体分泌的一种神经内分泌激素。大量研究表明,褪黑素在心血管疾病有益的影响,包括心肌梗死、缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化、心力衰竭和高血压(43,44]。类似于以前的研究的结果,我们发现,褪黑激素管理显著改善心脏功能障碍的正常化EF和FS值,减少炎症细胞的数量的心MI老鼠。因此,我们下一步考虑褪黑素可以防止心脏功能障碍的机制。先前的研究表明,褪黑素的心血管效应的潜在机制MI相关能力,抑制炎症反应,降低氧化应激,维持线粒体功能,减少心肌细胞凋亡,调节受体或nonreceptor信号通路(如MAPK / ERK, AMPK, PI3K / Akt,安全,和Notch通路)(45- - - - - -47]。然而,褪黑激素在MI的心血管作用是否与心脏pyroptosis抑制尚未证实。结果所表明褪黑激素可以显著抑制心脏pyroptosis,如图所示的MI的心GSDMD-N水平降低小鼠和H9C2细胞暴露于低氧。同时,NLRP3的水平,caspase-1裂解,il - 1和成熟β和地震明显减少褪黑激素治疗在活的有机体内和在体外。这些数据是第一个表明褪黑素可以防止心脏损伤部分通过抑制NLRP3 inflammasome-mediated心脏pyroptosis。

TLR4,第一个为哺乳动物的toll样受体,是被广泛接受的扮演着重要的角色在促进炎症反应在心血管疾病(48,49]。例如,TLR4基因及其下游NF -κ诱导的小鼠的B MI后(50]。小干扰rna对TLR4或TLR4抑制剂治疗显著降低梗塞大小和恢复心肌梗死小鼠心脏功能(51]。缺氧诱导的心肌细胞损伤被沉默抑制TLR4 [52]。此外,TLR4 / NF -κB信号通路已被证明函数的上游NLRP3 inflammasome在MI (53,54]。然而,是否褪黑激素的有益作用NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis与TLR4 / NF -相关联κB MI的信号通路尚不清楚。正如预测的那样,我们发现TLR4和NF -的激活κB MI (p - 65)是被褪黑激素在活的有机体内和在体外,而政府的有限合伙人,TLR4的受体激动剂/ NF -κB信号通路,废除在心脏pyroptosis褪黑激素的有益作用。

5。结论

综上所述,我们目前的研究提供了强有力的证据表明褪黑素调节MI-associated NLRP3 inflammasome-mediated心脏pyroptosis影响TLR4 / NF -κB信号通路,表明其在心肌梗死的治疗效用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在理性的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

z .我和w . LH造成了研究设计和制备条w . LH、w . MN和l . PY的执行在活的有机体内实验。w . LH、w . MN和m . XL负责在体外实验。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81772045)和黑龙江省高校基础研究基金(2018 - kyywf - 0480)。

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