文摘

体育锻炼的特征是生理和代谢需求的增加身体压力。据报道,一个锻炼会话诱发生理反应通过氧化还原信号增加细胞功能和能源支持在不同的器官。然而,对单个轮运动的影响氧化还原内稳态和cytoprotective白色脂肪组织的基因表达(窟)。因此,我们旨在评估急性有氧运动的影响在窟氧化还原内稳态,线粒体代谢,cytoprotective基因的反应。雄性Wistar鼠被提交给一个调高运行会话(跑步机)和被分为五组:控制(CTRL,没有锻炼),并立即实施安乐死(0 h), 30分钟、1小时、2小时后运动的结束会话。NADPH氧化酶活性高于0 h和30分钟组相比,CTRL组。Extramitochondrial活性氧产量高于0 h组相比,CTRL和2 h组。线粒体呼吸phosphorylative州增加0 h组相比,CTRL, 30分钟,1,2 h组。另一方面,线粒体ATP生产低0 h 30分钟组相比,在增加1和2 h组相比,CTRL和0 h组。猫活动锻炼组相比,CTRL低。 Regarding oxidative stress biomarkers, we observed a decrease in reduced thiol content in 0 h group compared to CTRL and 2 h groups, and higher levels of protein carbonylation in 0 and 30 min groups in comparison to the other groups. The levels returned to basal condition in 2 h group. Furthermore, aerobic exercise increased NRF2, GPX2, HMOX1, SOD1, and CAT mRNA levels. Taken together, our results suggest that one session of aerobic exercise can induce a transient prooxidative state in WAT, followed by an increase in antioxidant and cytoprotective gene expression.

1。介绍

体育锻炼的特征是生理和代谢需求的增加身体压力,编程,周期化,和进步的方式,允许一些适应在有机系统(1]。急性运动会话扰乱人体的体内平衡,导致热,代谢和氧化应激。几个生化使者释放由于这些稳态扰动,包括Ca^{2 +}、生长因子、细胞因子和活性氧(ROS)。这些信使将刺激多种信号通路,调解急性和慢性反应运动(2]。了解急性反应锻炼是很重要的对于理解如何锻炼身体条件和诱发长期适应。

为了锻炼,增加骨骼肌ROS生成观察,主要是由于增加NADPH氧化酶(NOX)和黄嘌呤氧化酶(XO)活动3- - - - - -5]。瞬态增加骨骼肌急性运动引起的活性氧激活redox-sensitive信号通路参与许多生理反应和随后的肌肉适应锻炼,包括抗氧化能力的增加(6]。长期、反复发作锻炼提高抗氧化因子2 (Nrf2)转录因子负责编排的抗氧化剂防御,调节超过200 cytoprotective基因的表达(7]。有趣的是,增加活性氧的生成和生物分子氧化不仅在骨骼肌急性运动后发现还在其他器官8,9]。此外,一些证据表明,身体锻炼能够激活Nrf2 /(抗氧化反应元素)信号和增加抗氧化防御超出骨骼肌。Muthusamy et al。(2012)表明,急性运动能够激活Nrf2 /信号和随后的增强抗氧化防御老鼠心脏(10]。祖文萃et al。(2015)评估如果跑步机上运动保护黑多巴胺神经元诱导Nrf2 1-methyl-4-phenylpyridine——抗氧化系统(MPP +)诱导帕金森大鼠模型。本研究表明,跑步机锻炼4周诱导upregulation Nrf2和gamma-glutamylcysteine连接酶(γGCLC)表达的差别也阻止了全身的MPP +对这些Nrf2 /γGCLC /谷胱甘肽和黑多巴胺能神经退化11]。此外,经常锻炼也已被证明能够激活Nrf2信号在其他组织肝(12)、肾(13)、前列腺癌(14),和睾丸15]。

白色脂肪组织(窟)是一个关键代谢组织,不仅是重要的调节能量可用性时和运动后还通过执行一个内分泌的角色通过发病的分泌,影响不同器官的代谢和功能(16]。体育锻炼增加窟血液流动和肾上腺素的刺激,导致更高的脂类分解和脂肪酸氧化率(17,18]。最近,汤森et al。(2020)显示,在转基因小鼠模型的减少线粒体ROS发射(线粒体过氧化氢酶overexpression-MCAT)运动性ROS调节分子反应在窟。在野生型小鼠急性运动感应瞬态增加Pdk4和磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (Pck1)mRNA在皮下腹股沟窟和附睾的窟仓库,并没有观察到医学院成就测试的动物。这些结果表明,活性氧参与窟生理反应体育锻炼(19]。樱井et al。(2009)报道,老鼠提交9周的有氧运动有较高的超氧化物歧化酶2表达在附睾的窟,而NOX2 ROS-producing酶的表达和脂质过氧化作用在附睾的减少和腹膜后窟20.]。此外,8周的运动训练SOD2的增加,过氧化氢酶蛋白质含量,降低脂质过氧化窟的男性老老鼠(21]。这些长期的体育锻炼对氧化还原内稳态的影响似乎是一个适应活性氧引起的急性照射每一个单一的锻炼中观察到的一些组织。

研究文献表明通过间接证据,ROS能调解急性运动对窟的影响。ROS的急性运动刺激窟的来源,以及调制redox-sensitive反应,不是完全理解。因此,我们旨在评估急性有氧运动对窟氧化还原内稳态的影响,以及相关基因的表达NRF2-KEAP1-ARE通路的激活在成年雄性Wistar鼠。

2。材料和方法

2.1。实验模型

成年雄性Wistar鼠体重400 - 450 g 18周年龄被维护在一个动物房间照明控制(12 h光暗周期)和温度(23 - 24日°C)免费获取标准老鼠食物和饮用水。使用动物研究机构委员会批准了研究(协议n°: 132/18),和程序符合国际生物医学研究指导原则涉及动物的国际医学科学组织理事会(瑞士日内瓦)。动物分为对照组(CTRL)都应该锻炼和四组(n = 6 /组)安乐死在不同时间点后练习会话:安乐死后30分钟锻炼会话(0 h)和安乐死(30分钟),1小时(1 h)或2小时后(2 h)。

急性运动之前,动物实验组织适应跑步机为1周,平均10分钟10米/分钟的速度为5天。最大努力的适应后,增量测试执行,最初6米/分钟的速度,这是增加3米/分钟每3分钟,固定在10°倾角。测试进行到动物的疲惫(当动物住在钢网格尽管增加休克刺激)改编自Bacurau et al。(2016)22和根据我们先前的研究23]。平均最大速度达到 ,和平均工作时间 分钟。动物急性练习会话,运行在65%和75%之间的最大速度(最大努力获得测试)20分钟对应调高强度有氧运动。之后,动物们被斩首安乐死,腹膜后窟是提取并存储在-80°C,直到进一步的分析(最大存储四个星期)。

2.2。乳酸测定试验

从尾静脉血样采集后立即最大努力测试和放置在一个管25%氟化钠(氟化钠)。等离子体在2000 x g离心得到的血液在室温15分钟。乳酸含量测定血浆样品中使用商用Bioclin工具包(Quibasa、巴西),按照制造商的说明。测量是基于乳酸脱氢酶(LDH)催化的反应的氧化L-Lactate丙酮酸,由此减少河畔⁺NADH。NADH形成被分光光度法测量在340毫米标(Victor X4;PerkinElmer)。样本的值是通过产品的吸光度校正因子( ),获得mg / dL的浓度。中给出的值是更易与L ( )(24]。

2.3。NADPH氧化酶活性

NADPH氧化酶活性在腹膜后窟量化使用Amplex红/辣根过氧化物酶(合)试验(分子探针,英杰公司)。腹膜后窟在50毫米(700毫克)均质钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.2,包含0.25蔗糖,0.5毫米德勤,EGTA 1毫米,5毫克/毫升抑肽酶,34.8毫克/毫升PMSF。匀浆离心机在700 x g 10分钟。离心后,上清液脂质残渣出院和中间阶段收集和离心机在100000 x g 35分钟4°C。50毫米的颗粒在0.5毫升resuspended磷酸钠缓冲区,pH值7.2,包含0.25蔗糖,MgCl 2毫米₂、5毫克/毫升抑肽酶和34.8毫克/毫升phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)和存储在-80°C到H₂O₂一代测量。

微粒体分数在150毫米孵化钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含SOD (100 U /毫升;σ),合(0.5 U /毫升,罗氏,印第安纳波利斯),NADPH(1毫米)和Amplex红(50μM;分子探针,尤金或)和荧光立即测量标(Victor X4;PerkinElmer诺沃克,CT)在30°C,使用一个激发波长的发射波长530 nm和595 nm在1小时。酶活性表达为nanomoles H₂O₂每小时每毫克的蛋白质(nmol·h⁻¹·毫克⁻¹)[25]。蛋白质含量是由布拉德福德试验(26]。

2.4。线粒体隔离和线粒体功能的测量

线粒体隔离后立即执行安乐死的差速离心根据修改后的协议马舍尔et al。(2020)27]。腹膜后窟(5%重量/体积组织( ))是放在冰冷的mitochondria-isolation缓冲区包含(更易·L¹)250蔗糖10玫瑰1乙二醇四乙酸(EGTA)和pH值7.4没有牛血清白蛋白(BSA)。组织是切碎的精心使用剪刀。接下来,剁碎组织与组织均质机均质(Ultra-Turrax)使用两个10秒治疗6500 rpm的轴自转速率。这匀浆进一步使用聚四氟乙烯杵均质。匀浆离心机在700 x g 10分钟4°C。上层清液的收集和稀释在寒冷隔离缓冲区包含Percoll(20%),和离心机14000 x g 10分钟4°c,这个过程重复了隔离缓冲区没有包含Percoll BSA (10%)。由此产生的颗粒在隔离缓冲区没有BSA和Percoll resuspended,离心机在10000 x g 5分钟4°C。这个过程被重复隔离缓冲区没有BSA和Percoll,和颗粒在mitochondria-isolation resuspended缓冲区。孤立的颗粒的蛋白质浓度是验证使用蛋白质化验(Lowry方法、Biorad、大力神、钙、美国)与BSA的标准相比(美国马热科学、沃尔瑟姆)。

2.4.1。线粒体氧消耗

线粒体呼吸与Clark-type测量电极(Strathkelvin、格拉斯哥、英国)37°C在磁搅拌在呼吸缓冲区包含更易·L¹:125氯化钾,10个拖把,2 MgCl₂5 KH₂阿宝₄0.2与丙酮酸(5更易EGTA·L¹)和苹果酸(5更易·L¹)作为复杂基质即氧电极使用217 nmol O溶解度系数校准₂/毫升37°C。对于测量复杂的我呼吸,线粒体(对应于线粒体蛋白质的200μg)被加入1毫升的孵化缓冲区。2分钟后孵化,1更易·L¹ADP是补充道,ADP-stimulated呼吸测量为2分钟。线粒体被用来测量复杂IV呼吸,和最大非耦合摄氧呼吸室或呼吸缓冲区包含来自线粒体呼吸室测量ATP生产和extramitochondrial ROS浓度。复杂IV呼吸刺激通过添加N, N, N, N - - - - - -tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD, 300μ摩尔·L¹)+抗坏血酸盐(3μ摩尔·L¹)。最大非耦合摄氧测定的30 nmol·L¹羰基cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazone (FCCP) [27]。

2.4.2。线粒体ATP生产

测量ADP-stimulated呼吸后,孵化缓冲区包含来自线粒体呼吸室和立即补充ATP测定混合(稀释1:5)(σ,奥尔德里奇)。线粒体ATP生产每次呼吸测量后立即决定,而ATP标准使用白色96孔板和荧光谱仪(SpectraMax®M3、分子器件、欧洲大学协会)在560 nm发射波长(27]。

2.4.3。Extramitochondrial ROS浓度

Amplex红过氧化氢测定工具包(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)是用来确定extramitochondrial ROS生产。Amplex红色反应1:1化学计量学与过氧化物催化下合,产生高荧光resorufin。孵化缓冲区包含线粒体被撤的呼吸室和立即补充50μ摩尔·L⁻¹Amplex红外的和2 U /毫升合。120分钟后的上层清液收集在黑暗中孵化。Extramitochondrial ROS浓度测定并与H₂O₂标准使用96 -黑色板和荧光谱仪(SpectraMax®M3、分子器件、欧洲大学协会)灭绝540海里排放和580 nm波长(27]。

2.5。抗氧化酶的活动

腹膜后窟在5毫米均质Tris-HCl缓冲区(pH值7.4),含0.9%氯化钠(w / v)和1毫米EDTA,其次是在750 x g离心10分钟4°C。上层整除储存在-80°C总超氧化物歧化酶(SOD)活性降低由细胞色素C在550纳米28]。过氧化氢酶(CAT)活性化验方法后Aebi(1984)和被表示为单位每毫克的蛋白质(U /毫克)[29日]。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活动是化验遵循NADPH在340纳米氧化过度的谷胱甘肽还原酶的存在,减少谷胱甘肽,和叔丁基氢过氧化物基质,并表示nmol每毫克的蛋白质氧化NADPH (nmol /毫克)(30.]。由布拉德福德测定蛋白质浓度。

2.6。氧化损伤的生物标志物

2.6.1。反应蛋白水平硫醇

反应蛋白硫醇含量测量使用5、5 - - - - - -dithio-bis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)(西格玛奥德里奇)。硫醇残留与DTNB反应,裂开的二硫键给2-nitro-5-thiobenzoate(“挪威通讯社”星期六报导^{- - - - - -}“挪威通讯社”星期六报导)电离₂^{- - - - - -}di-anion水在中性和碱性博士“挪威通讯社”星期六报导₂^{- - - - - -}被量化的分光光度计测量吸光度在412纳米31日]。

2.6.2。脂质过氧化反应,免疫印迹

蛋白质样本与2 x Laemmli样本混合样本的准备SDS页面缓冲区。(BioRad大力神,CA)和分离使用10% Bis-Acrylamide凝胶在130 V 60 - 120分钟(BioRad大力神,CA)。解决蛋白质被electrophoretically转移到硝化纤维素膜(BioRad大力神,CA)在一夜之间30 V。之后,评估蛋白质加载和转让、膜在0.1%(孵化 )在5%醋酸和朱红色年代,然后,被图像量化拉斯维加斯500数码拍照。1 h TBS-T膜被封锁(20毫米Tris-HCl, pH值7.6,150毫米氯化钠,0.1%渐变)含3%牛血清白蛋白(BSA)。1:700稀释的主要抗体anti-4-HNE (Abcam,剑桥,英国)添加和搅拌过夜在4°C, 3洗1 x TBS-T紧随其后。然后,膜被孵化1 h在室温下与1:10.000稀释HRP-linked anti-mouse二级抗体(Abcam,剑桥,英国)在3% BSA / TBS-T。乐队是可视化与Luminata™西方合(微孔、Millerica MA)使用图像量化拉斯维加斯4000 (GE生命科学、波士顿、欧洲大学协会)。的数据被表示为光密度比4-HNE列每个乐队中的总蛋白获得的红丽春花染色和规范化的对照组;措施都是使用软件图像获得J [32]。

2.6.3。由2 d OxyBlot蛋白质羰基化作用

腹膜后窟匀浆用于抗氧化分析变性和derivatized 12%十二烷基硫酸钠溶液(SDS)和dinitrophenylhydrazine (DNPH)根据制造商的协议(微孔)。中和解决方案用于终止衍生化反应后15分钟。蛋白质分离进行了使用12% Bis-Acrylamide凝胶在120 V (BioRad) 60 - 120分钟,随后转移到硝化纤维膜在一夜之间25 V。非特异性结合位点被封锁1 x磷酸盐和渐变20 (1 x PBS-T)和5% BSA一小时。1:500稀释的主要抗体(Anti-Rabbit-NDP-Kit微孔OxyBlot)在4°C添加和搅拌过夜,3洗1 x PBS-T紧随其后。然后,膜被孵化1:300稀释的山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白(与过氧化物酶共轭)抗体在室温下一个小时。乐队是可视化与Luminata™西方合(微孔、Millerica MA)使用BioRad Chemidoc和图像实验室(BioRad大力神,CA)。的数据被表示为光密度比dinitrophenyl-hydrazone (DNP)乐队每个乐队中的总蛋白通过内生控制标签β肌动蛋白和规范化对照组(33]。

2.7。通过实时Q-PCR基因表达

从腹膜后提取的总RNA窟使用Dynabeads™和TissueLyser LT通过高速震动破坏和同质化的样品2毫升微型离心机。RNA提取,RNeasy脂质组织迷你包(美国试剂盒)使用后,制造商的指示。RNA浓度和纯度测定样品的吸光度测量在260和280 nm分光光度计(Biomate 3 s,热科学)和完整性进行了分析,在琼脂糖凝胶电泳(1%)。1.2的互补脱氧核糖核酸合成μg的RNA thermocycler (Techne tc - 412,英国)使用高容量cDNA逆转录工具包(美国表达载体),根据制造商的指示。实时PCR进行使用EvaGreen(热FIREPol EvaGreen人力资源管理结构,索利斯生物因素)。qPCR周期是根据制造商的指令集(初始变性95°C 15分钟一次;其次是变性为15 95°C (s +退火60°-65°C 20年代和72°C伸长了20年代,重复40倍)。的β肌动蛋白基因作为管家基因的控制。使用2基因表达进行了分析^{- - - - - -ΔΔCt}方法(34]。用于实时PCR引物的描述表1。

2.8。统计分析

结果表示为 (SEM)通过统计和分析程序GraphPad Prism 7.0(美国圣地亚哥,CA)。达和皮尔森测试是用来验证样品的正常血乳酸水平,其次是成对的 - - - - - -测试。其他数据集测试正常使用Kolmogorov-Smirnov测试其次是单向方差分析方差分析与Bonferroni多个比较期末测验。

3所示。结果

3.1。最大努力描述

为了验证测试的最大努力,我们测量血浆乳酸浓度(图1)。我们观察到更高的最大努力后血浆乳酸水平测试之前相比,其水平测试( )。这一结果表明,所有的动物都达到了最大的努力水平,一旦血浆乳酸高于7更易/ L,确保更大的准确性在%的计算的最大单个运行速度运动。

3.2。急性有氧运动对NADPH氧化酶的影响活动和在腹膜后窟Extramitochondrial ROS生产

首先,我们评估急性有氧运动的影响在腹膜后窟ROS的两个主要来源:线粒体NADPH氧化酶酶和(35]。对于氮氧化物活动,立即观察显著增加,30分钟后运动相比,CTRL集团(CTRL与0 h, ;CTRL和30分钟, )。然而,这个效果是短暂的,因为明显降低氮氧化物活动观察2 h组相比其他运动组(0 h和2 h: ;30分钟和2小时: ;和1 h和2 h: ),但不是控制(图2(一个))。与extramitochondrial ROS生产,我们观察到一个更高的锻炼会话后立即生产活性氧(0 h)相比,CTRL组(CTRL与0 h: )。同样有趣的是,氮氧化物活动,这种效果是短暂的2个小时后,回到基础水平的锻炼会话(0 h和2 h: )(图2 (b))。这些发现表明,急性运动刺激腹膜后窟瞬态增加活性氧产量由氮氧化物酶和线粒体。

3.3。急性运动对线粒体呼吸和ATP生产的影响

线粒体是脂肪组织中活性氧的主要来源之一(36]。自extramitochondrial ROS生产是暂时性的增加运动后,我们分析了线粒体呼吸和ATP生产,为了评估线粒体功能。我们的结果表明,线粒体复杂IV呼吸和最大摄氧量的非耦合线粒体没有组间的不同,反映出同等载荷的可行的线粒体在所有实验(图3(一个))。也没有明显的线粒体耗氧量的变化,具体地说,我在复杂的活动,在状态我(图3 (b))。然而,我们观察到在第二状态复杂的我,0 h组有较高的消费₂相对于其他组(0 h和CTRL, ;0 h和30分钟, ;与1 h, 与2 h, )(图3 (c))。此外,在分析第三状态复杂的我时,我们发现后立即运动(0 h) O₂消费相比,明显高于其他组(0 h和CTRL, ;与30分钟, ;与1 h和2 h: )(图3 (d))。有趣的是,我们发现,尽管高氧的线粒体消耗phosphorylative复杂我0 h组的状态,这并不是伴随着增加ATP生产。相反,ATP生产有一个倾向于减少运动后立即与对照组相比(CTRL与0 h, ),从而表明线粒体所消耗的氧气倾斜ROS生产而不是ATP合成。在30分钟组,表明,ATP生产相比显著增加0 h (0 h与30分钟: )。ATP生产1 h组高于CTRL (CTRL与1 h, )和0 h组(0 h与1 h, ),以及2 h组(CTRL和2 h, :CTRL与0 h, )。之间没有差异被发现(图1 h和2 h组3 (e))。这些结果表明负活性氧和线粒体ATP产量之间的关系。

3.4。抗氧化酶的活动

ROS的可用性取决于他们在一个给定的组织生产和解毒。因为我们的结果表明活性氧的增加生产运动后,我们决定评估抗氧化酶的活动的猫,SOD、GPX。猫的活动在所有运动组较低的比较来控制(CTRL与0 h, ;与30分钟, ;与1 h, ;与2 h, )(图4(一))。然而,没有观察到不同组间GPX(图4 (b))和SOD(图4 (c))活动。

3.5。氧化损伤的生物标志物

因为我们观察到的氮氧化物和线粒体ROS生产的增加伴随着减少猫活动锻炼会话后,我们决定测量两种氧化损伤生物标志物间接评估ROS可用性和活性氧在生物大分子的直接影响37]。在此基础上,我们分析了三种特定标记的生物分子氧化:硫醇活性蛋白质,蛋白质羰基和脂质过氧化水平。反应蛋白的水平硫醇低0 h组相比,控制(CTRL与0 h, )和2 h组(0 h和2 h, )。没有观察到的差异在CTRL, 30分钟、1 h, 2 h组(图5(一个))。这些结果表明,运动后立即引起prooxidative环境窟会话(观察硫醇的氧化组)随后恢复到基线水平。

脂质过氧化水平高于0 h (CTRL与0 h, ),0.5 h组(CTRL和30分钟, ),和1 h组(CTRL与1 h, )相比控制(图5 (b))。除此之外,蛋白质羰基含量高于0 h (CTRL与0 h, )和0.5 h。组(CTRL和30分钟, )相比于控制。1 h和2 h组、蛋白质羰基化水平下降与0 h (0 h与1 h, ;0 h和2 h, )和30分钟(30分钟和1 h, ;30分钟和2小时, )(图5 (c))。这些结果符合反应蛋白硫醇的水平,表明瞬态pro-oxidative运动后的会话状态。

3.6。对氧化剂基因表达的影响

体育锻炼可以通过ROS-related redox-sensitive激活细胞内信号通路机制在一些组织,导致生理修改通过基因组和non-genomic机制(38]。由于我们发现锻炼协议导致ROS增加可用性腹膜后窟,我们分析了抗氧化剂和cytoprotective基因相关NRF2-KEAP1通路的激活将调制(图6)。

一个小时运动后(1 h)显著增加NRF2 mRNA水平观察与CTRL ( ),0 h ( ),和2 h ( )组(图6(一))。GPX2 mRNA水平高于30分钟组与1 h ( )和2 h ( )组(图6 (c))。Glutamate-cysteine连接酶修改单元(GCLM) mRNA水平低1 h组相比,CTRL ( )和0 h ( )组(图6 (d))。血红素oxygenase1 1 (HMOX1) mRNA水平高1 h组与CTRL ( ),0 h ( ),30分钟( ),和2 h ( )组(图6 (f))。SOD1基因表达是高2 h组相比,CTRL ( ),0 h ( ),30分钟( ),和1 h ( )组(图6 (g))。也观察到显著增加猫表达0 h与CTRL ( ),30分钟( ),1 h ( ),和2 h ( )组(图6(我)),从而表明过氧化氢酶活动的减少运动后(图5(一个))是由于转译后的机制。没有明显改变SOD2的催化亚基1 Glutamate-Cysteine连接酶(GCLC1)和GPX1 mRNA水平运动后的任何时间评估。这些结果表明,急性有氧锻炼会话能够调节一些抗氧化剂和cytoprotective基因的mRNA水平。

4所示。讨论

多项研究表明,慢性接触运动导致增强cytoprotection和抗氧化防御系统在不同的组织,如骨骼肌(10,心39),大脑40),和其他(41]。这生理适应与低水平的感应ROS在每个单一的运动(38]。在窟,有一些证据表明,慢性暴露于有氧运动与脂质减少存储、脂肪酸动员(42),改善线粒体功能(43),减少炎症发病的表达(20.),因此修改窟新陈代谢(44),和表型(45]。慢性运动似乎引起氧化还原在窟改编,比如减少ROS生产和增加抗氧化防御(46]。我们的研究显示,急性调高强度耐力运动促进窟的瞬态prooxidative状态,导致瞬态生物分子的氧化,增加抗氧化/ cytoprotective基因表达。

在目前的研究中,我们评估的两个重要来源ROS在窟,氮氧化物和线粒体酶47,48]。氮氧化物是唯一的功能是生产超氧化物酶或H₂O₂(49]。他们是跨膜酶和属于氮氧化物的家庭,包括氮氧化物从1到5,DUOXs 1和2,显示不同的组织分布和表达水平(50]。NOX2和NOX4似乎最表示氮氧化物亚型在窟51),但我们找不到任何证据文献中关于急性运动对他们的活动的影响。在目前的工作中,我们观察到一个瞬态NOX-derived ROS增加生产,更高的锻炼会话后,30分钟后,然后回到基线水平。氮氧化物可以激活酶在急性运动增加的几个因素,而不是目前的研究的目的。

增加与电子相关的线粒体呼吸是逃避复杂的我和三世,导致部分减少O₂形成超氧化物阴离子(O₂^•−)[52),从而增加extramitochondrial H₂O₂流出(52]。尽管我们发现后立即线粒体呼吸锻炼,增加ATP产量降低。此外,逆ATP和活性氧产量之间的关系也被观察到。Das和Jana(2015)观察到更高水平的蛋白质羰基α亚基的F1复杂骨骼肌ATP合酶的老老鼠相比,年轻的同行。有趣的是,它是与较低的活动相关的频道在古老的动物53]。这是强有力的证据redox-sensitive网站在ATP合酶,和ATP合酶的氧化还原的修改α亚基可能发挥重要作用在ATP合成的规定(54]。王et al。(2011)在线粒体分离出老鼠的心脏,阻断自由硫醇的氧化与N-Ethylmaleimide (NEM,烷基化试剂)导致atp酶酶活性增加。作者表明,治疗组之间的差异和不接受NEM大(两次),这表明氧化改性的半胱氨酸在atp酶活性产生深远的影响。仍然在这项研究中,作者观察到的存在ATP合酶之间的二硫键α亚基的γ亚基。然而,ATPα亚基被确定为主要的线粒体蛋白质发生氧化活性氧引起的变化,这是与减少酶腺苷三磷酸酶活性(55]。在我们的研究中,我们观察到ATP生产减少运动后立即,在同一时刻,ROS水平增加。然而,从运动30分钟后,ATP生产增加,表明ROS调节线粒体ATP生产的可能机制。

ROS的可用性取决于他们在一个给定的组织生产和解毒。因为我们练习会话和氮氧化物mitochondria-derived ROS生产,我们调查的抗氧化酶SOD的活性,猫,GPX。然而,组间没有差异观察SOD、GPx活动有关。另一方面,我们观察到显著减少猫活动历史点后练习会话。萍et al。(2015)显示在雄性小鼠骨骼肌急性有氧运动相似的响应,与线粒体H₂O₂生产、减少猫活动锻炼90分钟后,和SOD活性的差异(56]。猫是一个转换酶酶H₂O₂成水和O₂(57]。因为过氧化氢酶H解毒作用₂O₂运动后,观察其活动的减少可能会导致更大的ROS的可用性。

我们的研究结果表明,活性蛋白质运动后立即硫醇水平明显下降。然而,这些影响是短暂的,2小时运动后回到基线水平,表明经济复苏从prooxidant状态。硫醇化合物包括任何organosulfur包含组R-SH减少状态(R代表一个烷基或其他有机取代基)。半胱氨酸残基硫醇的氧化团体经常导致二硫桥的形成,可重要的是影响蛋白质的三维结构和活动,例如[58]。降低半胱氨酸硫醇(Cys-SH)和二硫化氧化同行仔细平衡维持各细胞氧化还原内稳态隔间。正因为如此,他们的ROS水平相关的可用性。此外,有一个一致的证据表明瞬态硫醇氧化与redox-sensitive信号调制,影响细胞信号蛋白,调节蛋白激酶活性和转录因子(59,60]。

我们还观察到一个增加的脂质过氧化反应对锻炼会话后,后持续0.5和1 h。先前的报道证明增加体育锻炼后血液中脂质过氧化产物(57]。4-HNE可以与硫醇和氨基反应的大分子,它的形成与稳定的共价迈克尔和席夫碱加合物多种组蛋白,导致蛋白质交联,蛋白质聚合,失活蛋白质的功能,和结构扰动,包括增加蛋白质羰基化反应(58- - - - - -60]。此外,瞬态4-HNE水平的增加伴随着Nrf2活性,增加mitochondriogenesis,和抗氧化防御61年]。

所以接下来,我们也评估蛋白质羰基含量,另一个标记的氧化形成由于赖氨酸和谷氨酸氧化脱氨基作用57]。立即我们观察到蛋白质羰基含量的增加,锻炼会话结束后30分钟,一个小时后回到了基底的水平。这些结果符合大部分氧化还原参数评估的模式(增加活性氧生成,减少猫活动,减少蛋白质巯基含量,并增加4-HNE)观察后立即运动,显示急性运动引起了短暂pro-oxidative州窟。

有氧运动在啮齿动物模型一直是显示激活Nrf2信号在多个组织,包括骨骼肌(59),肝脏(62年),和心肌63年),导致内源性抗氧化基因和蛋白质表达的upregulation,生理适应性的相关体育锻炼的有益作用[7]。在基础条件,NRF2仍位于细胞质中,与Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1),不动。协会与Keap1导致泛素化,因此,NRF2 protease-mediated退化。然而,增加活性氧的可用性可以触发Keap1氧化,减少NRF2-Keap1交互,因此,减少NRF2退化(64年]。这个过程增加NRF2易位细胞核及其抗氧化反应元素绑定(是),导致200多名cytoprotective基因的转录,包括NRF2本身(7]。我们观察到增加NRF2 mRNA水平1小时锻炼会话后,这表明NRF2信号被激活在我们的模型中,可能由于瞬态增加活性氧生成。

此外,一次锻炼还能提高相关基因的mRNA水平的几种抗氧化剂和cytoprotective NRF2激活在窟,包括HMOX SOD1,猫,GCLM。HMOX1的mRNA水平更高的1 h组。HMOX1基因把hemeoxygenase 1,酶,催化血红素降解反应和病原的第一步,生产公司、铁和胆绿素。HMOX1参与抗氧化抗炎功能,它存在在非常低的水平在大多数细胞和组织,在调节prooxidant条件(65年]。SOD1基因表达也增加了运动后。这种酶是三SOD亚型之一,负责O的歧化作用₂^•−到H₂O₂。猫基因表达后立即增加锻炼;然而,回到基础水平后30分钟会话。猫基因编码过氧化氢酶,抗氧化酶存在于几乎所有需氧细胞的过氧物酶体将H₂O₂水和氧气(66年]。奇怪的是,减少急性GCLM基因表达较低的1 h组相比,CTRL和0 h组。GCLM有关谷胱甘肽合成半胱氨酸和L-glutamate [67年]。缺乏响应的表达式GPX1, GPX2, GCLC1 GCLM, SOD2不一致,增加其他抗氧化基因中找到。文学是稀缺的急性运动的影响的描述cytoprotective基因的动态监管。因此,需要更多的研究来阐明这个问题。

在目前的研究中,DNA的氧化动力学和DNA损伤反应急性运动后没有评估,但这是一个重要的主题,将在将来的研究中得到解决。此外,长期有氧运动的影响在窟氧化还原控制和肥胖动物的体内平衡和DNA损伤反应也是一个相关的问题,我们组打算评估。

5。结论

总之,我们证明一次有氧运动引起的瞬态prooxidant环境中,以一个更高的氮氧化物和extramitochondrial ROS生产活动,减少猫活动,和更高水平的生物分子氧化。此外,抗氧化和cytoprotective基因的mRNA水平增加了急性运动,表明瞬态ROS暴露的细胞反应。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq), Fundacao德帕罗尽管带动做里约热内卢(FAPERJ)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)。