关键评价活性氧和氮物种之间的相互作用与血通知低温等离子疗法的临床翻译

文摘

(国家结核控制规划),低温等离子体的电离气体生成的环境压力和温度,是一个新兴的医学应用技术。通过控制交付活性氧(ROS / RNS)和氮物种,国家结核控制规划可以引起激效细胞反应,从而刺激广泛的治疗效果。使临床翻译有前途的国家结核控制规划疗法,临床前研究的国家结核控制规划与临床基质相互作用的深入了解是极其必要的。因为NTP-generated ROS / RNS将不可避免地与血液在几个临床环境,了解他们的稳定这个系统是至关重要的。在这项研究中,两种医学上相关国家结核控制规划交付模式被用来评估NTP-generated ROS / RNS的稳定性在三个水解决方案随着有机复杂性:磷酸盐(PBS)、血浆(BP)和全血进行处理。NTP-generated RNS集体(没有₂⁻,ONOO⁻),H₂O₂,ONOO⁻随着时间的推移只进行了分析。我们证明了NTP-generated RNS和H₂O₂在PBS已经稳定,但回收的不同组件的血液。虽然RNS保持稳定在BP最初的清除效果,这完全是减少在处理全血。另一方面,H₂O₂随着时间的推移两液体完全回收。我们之前开发的发光探针铕(III)是ONOO用于精密测量⁻浓度。NTP-generated ONOO⁻被发现在所有三个液体至少30秒,从而突出其治疗的潜力。基于我们的研究结果,我们讨论了必要的考虑来选择最优的国家结核控制规划形态ROS的交付/ RNS和通过血液在临床上下文。

1。背景

在过去的十年里,(NTP)一直是一个新兴的低温等离子体技术与多元化的医学应用(1]。国家结核控制规划是一个可以在环境生成的电离气体压力和温度(批准°C),据报道,增强止血、促进伤口愈合,甚至杀死癌细胞(2- - - - - -4]。这种广泛的生物效应是由于活性氧和氮物种(ROS / RNS)由国家结核控制规划,包括原子种类、自由基、过氧化氢、氮氧化物,以及细胞现象,毒物兴奋效应(1]。而低剂量接触ROS / RNS能促进再生效果,高剂量可诱导细胞死亡。通过控制交付ROS / RNS,到目前为止,国家结核控制规划疗法的临床益处包括中和微生物,减少慢性腿部溃疡、解决皮肤疾病,缓解晚期头颈癌患者(5- - - - - -10]。此外,正在进行临床前研究表明扩大应用的潜力,包括停止出血和调停疤痕形成,减轻烧伤,本次和组织再生4,11- - - - - -17]。这是形成鲜明对比热等离子体设备主要用于热消融(≥60°C) (18,19]。两个国家结核控制规划交付方法目前被认为是最适用于诊所:直接国家结核控制规划治疗和间接国家结核控制规划(20.]。直接设置,生成国家结核控制规划在直接接触目标底物(如血,伤口和肿瘤)。这种方式可以最有效的交付ROS / RNS但目前限于表面的地区访问设备。国家结核控制规划治疗是一种间接克服这个限制。在这里,国家结核控制规划是用来丰富与ROS / RNS的解决方案,然后可以转移到目标底物。而这使得治疗领域更深层次的体内,只有持续的ROS / RNS ( )可能达到目标短暂的ROS / RNS ( )可能有非目标反应或形成更稳定的物种在运输(21]。因此,调查ROS / RNS稳定是一个高优先级的国家结核控制规划技术的成功的临床翻译。到目前为止,实验和在网上研究描述NTP-generated物种在液相中主要表现在水或PBS (21- - - - - -24),因为这可以减少反应的复杂性补充剂和有机分子中找到其他的解决方案(如细胞培养基、血液)。而这导致显著的深入洞察国家结核控制规划与液体相互作用的基本物理和化学,主要差距在当前知识在国家结核控制规划与病人的互动的材料,因为这些基质比以前所使用的模型复杂得多。因为NTP-generated ROS / RNS将不可避免地与血液在几个临床上下文交互,都故意(例如,止血)或无意中(例如,癌症治疗),了解他们的稳定在这个系统是主要的重要的。在这项研究中,我们调查的稳定性NTP-generated ROS / RNS血液作为第一步阐明国家结核控制规划在临床化学材料。国家结核控制规划交付都直接和间接方法,以前在我们的实验室25- - - - - -27),进行测试。我们进行集体NTP-generated RNS(亚硝酸盐,不分析₂⁻;过氧亚硝基,ONOO⁻)、过氧化氢(H₂O₂),ONOO⁻随着时间的推移与增加有机水溶液复杂性:磷酸盐(PBS)、血浆(BP)和全血进行处理。RNS和H₂O₂在PBS、稳定,被不同的组件的血液回收。我们之前开发的发光铕(III)探针,Eu.1(图1(一)),(28ONOO)也用于精密测量⁻和显示NTP-generated ONOO⁻出现在所有三个液体,至少30秒。根据我们的结果,我们讨论不同的血液组件的清除能力以及必要的考虑来选择最优的国家结核控制规划形态所需的临床应用。

2。方法

2.1。目的和实验设计

本研究的目的是评估NTP-generated持久稳定的ROS / RNS临床基质(如血浆和全血处理)通知国家结核控制规划的最佳翻译技术/应用程序。直接和间接国家结核控制规划应用程序进行评估,使用了三种化学分析方法(图1 (b))。产生的ROS浓度/ RNS立即在PBS(0)用作基线浓度后国家结核控制规划治疗。国家结核控制规划年底之间的延迟治疗和化学分析是30 - 300秒之间变化随着时间的推移提供洞察ROS / RNS的稳定性。

2.2。英国石油(BP)和加工全血的集合

本研究安特卫普大学的伦理委员会批准/安特卫普大学医院(比利时安特卫普)19/13/160参考号码。实验通过匿名捐赠者的血液样本红十字血液服务提供的弗兰德斯(比利时梅赫伦)。英国石油公司从血液中分离使用以下协议。25毫升处理全血小心地分发到15μL LymphoPrep (1114547, Alerne技术SA)和离心20分钟2100 rpm外开式转子在室温下。离心后,血液成分被分为四个不同层次与英国石油(BP)。上面层BP当时很容易收集到的其他部分的血液。“处理全血”一词指的是淡黄色的外套,源自健康志愿者外周血(柠檬酸磷酸葡萄糖抗凝)捐赠的前一天和存储在室温下过夜(红十字会的弗兰德斯)。

2.3。国家结核控制规划的治疗

我们研究了直接和间接的国家结核控制规划的治疗。一个治疗参数为每个方法使用基于类似的治疗效果从我们过去的研究和发表的报告(25,26]。直接治疗中,我们使用一个定制的microsecond-pulsed介质阻挡放电(μs-DBD)在大气压空气中(Megaimpulse有限公司、圣Petersbug、俄罗斯)。对这些实验中,我们使用一个700 Hz脉冲频率和治疗的样本10秒,1毫米以上样品。

间接治疗,我们使用了kINPen®印第安纳州非热能的等离子体射流(INP格赖夫斯瓦尔德/ Neoplas工具GmbH,格赖夫斯瓦尔德,德国)。国家结核控制规划飞机,这是一个大气压力氩等离子体医学常用研究[26,27,29日]。我们使用了kINPen®印第安纳治疗2毫升磷酸盐(PBS) 12-well板(pH值7.3)。6毫米的差距的国家结核控制规划源和液体,气体流速1 slm,治疗时间5分钟。治疗后,NTP-enriched PBS被转移到水溶液(PBS、英国石油公司、或处理全血)。

2.4。RNS测量

测量RNS浓度NTP-treated PBS,英国石油(BP)和处理全血,用荧光测定。硝酸盐和亚硝酸盐的荧光测定工具包(780051年,开曼化学)根据制造商的说明进行。简单,直接治疗,每个包含10μL (NTP-treated样本。间接治疗,10μL (NTP-enriched PBS (ppb)被转移到每个包含40μL (PBS、英国石油公司(BP)或全血进行处理。每个样本的最后一卷,直接和间接的国家结核控制规划治疗,调整到100μL分析缓冲区。10μL 2, 3-diaminonaphthalene(丹)试剂添加到每个好,立即或30、60岁或300秒后治疗。10分钟后在室温下孵化,20μL的氢氧化钠(氢氧化钠)被添加到每个增强荧光的检测产品,1 -naphthotriazole (H)。后立即添加氢氧化钠,荧光测量Tecan火花阶段使用一个激发波长(λ_前女友)365±20海里,一个发射波长(λ_新兴市场430±20 nm),固定增益(获得55)。硝酸盐和亚硝酸盐的选择性荧光测定工具包用于这项研究还评估(支持图S1)。

2.5。H₂O₂测量

测量H₂O₂浓度在NTP-treated PBS,英国石油(BP)和加工全血,我们进行了荧光测定(MAK165,默克公司)根据制造商的指示。简而言之,直接国家结核控制规划进行分析处理,每个包含25μL NTP-treated PBS或50μL NTP-treated BP或处理全血。每个样品的体积与试验调整缓冲区获取最后一卷50μl .间接治疗国家结核控制规划的情况下,每个包含2.5μL和47.5磅的调整μL PBS, 25岁μL英国石油(BP),或25μL加工全血。不同稀释被用来保持在校准范围内。50μL掌握混合(4.75 + 50 mL检测缓冲区μL红过氧化物酶底物+ 200μL 20单位/毫升过氧化物酶)被添加到每个。30分钟的孵化后,荧光测量Tecan引发阶段,( ,λ新兴市场的 ,固定增益34)。

2.6。ONOO⁻测量

在这里,我们使用了一种新的发光铕(III)探测器(Eu.1,图1(一)),我们开发了以前,ONOO的检测⁻在体外在活细胞(28]。最初的时间点,100μL (Eu.1(100μ米)在相关媒体处理直接国家结核控制规划的排放强度Eu.1立即测量。随后的时间点,Eu.1(100μ米)添加治疗后直接国家结核控制规划在一定的时间( ,60、120和300秒)。排放强度是衡量板读者使用时间分辨发射( , , )。决心通过比较浓度排放强度的百分比变化校准曲线(支持图S2)。

2.7。统计分析

所有统计差异分析了使用线性混合模型和JMP Pro 13 (SAS软件)。固定效应将治疗或治疗之间的时间延迟和分析。当检测到显著的区别是,事后Dunnett的测试进行计算调整价值比控制。量化的ROS / RNS物种,国家结核控制规划治疗比未经处理的时间点。确定英国石油(BP)的清除能力和处理全血,延迟分析(30 - 300秒)ROS / RNS与初始浓度(0秒)。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。在所有图形表示为数据 意味着(SEM),复制的数量表示的传说,和所有数据都准备GraphPad棱镜(GraphPad棱镜7,GraphPad棱镜软件,Inc .)。

3所示。结果

3.1。NTP-Generated持久ROS / RNS在PBS是稳定的,但随着时间的推移,英国石油公司和全血进行处理

确定基线NTP-generated持久ROS浓度/ RNS,国家结核控制规划是用来治疗PBS,直接和间接利用DBD在大气和氩kINPen飞机,分别。而直接的国家结核控制规划生成更高浓度的RNS相比间接治疗(图2(一个)国家结核控制规划产生的超过20倍),间接H₂O₂(图2 (b))。RNS和H₂O₂国家结核控制规划后立即分析处理(0秒)和延迟治疗后30 - 300秒之间。这些物种都稳定在PBS至少300秒。PBS也的pH值测量之前和之后的国家结核控制规划治疗和直接暴露后保持相对不变( ; )或间接( )国家结核控制规划,而未经处理的(pH值: )。

检查NTP-generated ROS / RNS的稳定在一个更复杂的生理解决方案中,我们对待英国石油来源于健康的捐赠者。BP占大约55%的血液量,主要包括水、电解质溶解,蛋白质和脂质。直接和间接国家结核控制规划都是用于治疗BP,收集和分析RNS和H₂O₂以同样的方式。有趣的是,RNS立即回收大约15μM都直接或间接的国家结核控制规划治疗,尽管直接治疗在PBS生产几乎两倍的RNS (cf图2 (c)与图2(一个))。剩下的RNS稳定至少60秒。另一方面,H₂O₂浓度是立即的价格相比显著降低PBS和继续减少(图2 (d))。

处理全血,包括红细胞、白细胞和血小板随着英国石油公司,也是治疗和分析作为最复杂的模型和完整的生理上的解决方案。RNS和H₂O₂国家结核控制规划立即减少生成的直接到检测不到的水平(数字2 (e)和2 (f))。对于间接国家结核控制规划,RNS立即减少低于0.2μM和完全缺席了300秒,而H₂O₂只有检测后立即治疗。

虽然在PBS ROS / RNS稳定,一旦引入BP的组件,它们的浓度明显降低(图3)。事实上,BP的RNS浓度减少到50 - 75%的起始浓度比PBS和几乎完全没有在处理全血(数字3(一个)和3 (c))。另一方面,直接检测H₂O₂在英国石油公司(BP)显示剩余国家结核控制规划(图直接比例的33%3 (b)国家结核控制规划(图),间接为4.5%3 (d)NTP-treated PBS的基线水平相比)。H₂O₂在英国石油公司也略有下降随着时间的推移,没有发生在PBS。此外,在较高的初始浓度的H₂O₂从间接的国家结核控制规划治疗,H₂O₂仍在处理全血当立即分析检测(图2 (f)),尽管剩下的百分比≤0.1%(图3 (d))。因此,当细胞和血小板组件可能导致H₂O₂清除能力的血液,BP组件单独强有力的食腐动物。

3.2。NTP-Generated过氧亚硝基(ONOO⁻)在PBS是稳定的,英国石油(BP)和处理全血至少30秒

ONOO^{- - - - - -}是一种高活性RNS参与细胞信号和操纵ONOO吗^{- - - - - -}浓度已经成为一些疾病的治疗和管理战略(如炎性疾病、血管疾病和癌症)(30.- - - - - -32]。检测ONOO^{- - - - - -}尤其具有挑战性的在生物环境中由于有限的选择性和适用性的当前的化验和检测探头的响应时间慢,尽管一些引人注目的最新发展33- - - - - -35]。在这里,我们使用了一种新的发光铕(III)探测器(Eu.1)检测直接NTP-generated ONOO^{- - - - - -}在PBS,英国石油(BP)和全血进行处理。这个探针,设计并合成了一些作者,之前已经演示了快速和选择性地检测ONOO^{- - - - - -}时间分辨的方式,在水缓冲和人类的英国石油公司(28]。在最近的研究中,欧盟的长的发光寿命(III)调查被用来消除任何短暂的自体荧光起源于生物分子在英国石油公司或处理全血,从而提供高信噪比和ONOO的精确测量^{- - - - - -}浓度。

很明显,ONOO^{- - - - - -}生成后立即直接国家结核控制规划在所有三个治疗和浓度相当于水解决方案(图4(一))。这表明直接治疗最初生成一个相对稳定的ONOO集中^{- - - - - -}(~ 17μ米),不管介质的复杂性。在PBS, ONOO的衰败^{- - - - - -}发生超过300秒,可以归因于ONOO的反应^{- - - - - -}形成更稳定的物种,如亚硝酸盐(NO₂^{- - - - - -})和硝酸盐(NO₃^{- - - - - -})[36]。重要的是要注意,ONOO退化^{- - - - - -}可能不是完全和直接负责的形成没有₂^{- - - - - -}也没有₃^{- - - - - -}和可能导致显著短寿的物种(例如,ONOOCO₂^{- - - - - -},没有)22]。有趣的是,一个30秒的延迟后,ONOO⁻在英国石油公司和处理全血减少到大约相同数量, 和 ,分别成为完全废除之前在更高的时间延迟(≥60秒)。这表明BP组件在清除ONOO发挥重要的作用^{- - - - - -},特别是NTP-generated ONOO^{- - - - - -}。作为ONOO^{- - - - - -}形成和稳定也高度依赖于溶液的pH值(37),我们也评估国家结核控制规划治疗博士直接国家结核控制规划的影响没有显著影响溶液的pH值在任何解决方案(pH值< 0.15单位)(图4 (b))。综上所述,这些数据强烈表明,ONOO的衰败^{- - - - - -}是由于血液中与其他生物分子/有机反应物种,主要在英国石油公司。这不是意外,鉴于ONOO的有力硝化和氧化性质^{- - - - - -}和潜在的反应性伙伴的数量处理全血和BP(如氨基酸、有限公司₂、铁^{2 +})[36]。而ONOO的反应^{- - - - - -}与生物分子/有机物种似乎衰变的主要机制,其他ROS / RNS之间的交互完全不能打折。

4所示。讨论

在这项研究中,我们测试了不同组件的清除能力的血,治疗后两个国家结核控制规划模式和使用一系列互补的检测方法。目前,一个完整的了解NTP-generated ROS / RNS与临床缺乏底物,据我们所知,这是第一次报告的评估NTP-generated ROS / RNS的血液。

因为RNS减少到一个固定的浓度,尽管这两个国家结核控制规划模式产生不同的起始金额(cf数据2(一个)和2 (c)),这表明,溶解的蛋白质(如白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原)和脂质(如脂肪酸、胆固醇)的英国石油公司只有部分清除行动。额外的细胞和血小板的组件处理全血进一步回收RNS(数字3(一个)和3 (c))。这些数据表明,RNS只是部分减少血液的英国石油(BP)组件。另一方面,我们的结果表明,BP包含主要的清除能力H₂O₂,其余的百分比H₂O₂在直接和间接治疗40%和5%,分别为(数字3 (b)和3 (d))。然而,这并不是说,血液细胞和血小板组件不会导致清除的H₂O₂,处理全血快熄灭所有H₂O₂立即(图2 (f))。立即清除效果的H₂O₂主要是由于红细胞酶机械,防止血红蛋白氧化过程。应该是认为可以氧化血红蛋白中的铁结合H₂O₂ferryl血红蛋白(HbFe^{4 +})[37]。与高浓度的H₂O₂(6.5毫米),这将减少大量的携带氧气的血红蛋白,血红蛋白亚铁(HbFe^{2 +}O₂),导致不良反应(37]。当在少量生产,HbFe^{4 +}将迅速恢复亚铁血红蛋白的红细胞没有任何毒性作用。在我们的例子中,H₂O₂足够低(≤20吗μ直接治疗和≤400μM间接治疗;图2 (b)红细胞)回收,大量ferryl血红蛋白形成之前(38]。没有₂⁻,一个类似的氧化过程可以发生在铁(HbFe血红蛋白的形成^{3 +}),而不是ferryl血红蛋白(39]。综上所述,很明显,评价NTP-generated ROS / RNS的浓度在临床基质和产生的副产品对这项技术的安全的翻译是至关重要的。

两国家结核控制规划形式直接和间接转化潜力的诊所,尽管他们通过不同的机制由于他们提供的不同的物种。电流限制直接国家结核控制规划是直接访问目标的要求,因此限制这个国家结核控制规划形态表面伤口和癌症(如黑素瘤、头颈癌)或在手术。国家结核控制规划治疗是一种间接绕过这个限制,和解决方案富含ROS / RNS国家结核控制规划已被传递到身体的深层治疗(40- - - - - -42]。与间接国家结核控制规划有必要强调治疗,只有持续的ROS / RNS传递到深层组织,因为ROS / RNS一生经历较短反应形成更稳定的物种在液体中。在这项研究中,基于我们的结果看来,静脉输注NTP-enriched交付解决方案可能很困难,因为这些物种丢失血液运送的。具体来说,ONOO⁻无法在60秒(图4(一)),而H₂O₂无法在30秒(图2 (f))。在60秒内总RNS仍可检测,但在非常低的水平(图2 (e))。然而,考虑到注射部位的位置到目标和ROS的稳定性/ RNS物种,间接的国家结核控制规划可以优化治疗临床应用。此外,其他国家结核控制规划交付间接方法(如本地应用程序,灌注在体腔)也可能提供有前途的选择。从显示的数据,很明显,临床效益间接产生的ROS / RNS国家结核控制规划需要彻底调查。与化学合成ROS / RNS也需要确定间接国家结核控制规划提供了额外的优势。这些基本的研究必须是特定于应用程序(例如,伤口愈合,癌症治疗)和concentration-specific ROS / RNS[的多效性的影响43]。

直接与间接的国家结核控制规划,在国家结核控制规划的治疗目标底物,一个独特的混合的短暂的化学物种(如•哦,O,和没有)可以交付以及持久ROS / RNS(例如,没有₂⁻H₂O₂,ONOO⁻)引起的生物反应(21]。重要的是要注意,虽然短暂的物种并没有在这项研究中,测量他们的治疗效果无法直接打折国家结核控制规划治疗,由于附近一代网站的目标。最近,这些短暂的物种的重要性直接国家结核控制规划治疗已经浮出水面,这是符合当前的理解在氧化还原医学(25,43,44]。而直接治疗也是产生紫外线辐射,一些报告表明,生成的数量dbd不会导致整个生物效应(45,46]。国家结核控制规划治疗是有价值的,直接可控的方法生成和传递这些短暂的ROS / RNS在临床设置,这需要进一步研究在血液和其他生物的解决方案。

5。结论

总之,我们评估的稳定持久的ROS / RNS(即。,没有₂⁻H₂O₂,ONOO⁻在直接和间接国家结核控制规划治疗后临床相关的解决方案。欧盟(III)发光探针能够快速、有选择性地检测ONOO⁻不仅在PBS和英国石油公司还在处理全血。NTP-generated ONOO⁻被发现在所有三个液体至少30秒,从而突出其治疗的潜力。治疗血液的不同组件显示主要的细胞和血小板组件负责清除RNS血。另一方面,英国石油公司和其他血液成分有效的清除潜在的对H₂O₂和ONOO⁻。综上所述,我们的研究结果提供国家结核控制规划与血液相互作用基本见解和建议静脉NTP-enriched交付解决方案治疗可能很困难,各种血液在途的活性物种可能会丢失。

通过考虑,总的来说,该网站介绍NTP-generated ROS / RNS治疗稳定的物种,和生物目标站点之间的距离,更明智的决定国家结核控制规划疗法临床应用的直接和间接的。在等离子体医学领域,这对国家结核控制规划在不同临床治疗高转化重要环境和应用程序。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

本研究安特卫普大学的伦理委员会批准/安特卫普大学医院(比利时安特卫普)19/13/160参考号码。

同意

知情同意科学使用病人血样被安排和红十字血液服务提供的弗兰德斯(比利时梅赫伦)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

A.L.和E.B.概念化的研究目标和目标。A.L.,E.B., and C.B. developed the design and methodology for the experiments. A.L., E.B., and C.B. performed the experiments and analyzed the results. C.B. and S.J.B developed the new peroxynitrite probe used in this study. S.J.B, E.S., and A.B. provided workspace, equipment, resources, supervision, and valuable discussions for the project. A.L, S.J.B., E.S., and A.B. acquired financial support for the project. A.L. wrote the original draft of the manuscript with contributions from E.B. and C.B. All authors participated in the review of the manuscript. All authors have given approval to the final version of the manuscript. Abraham Lin and Eline Biscop contributed equally and share first authorship.

确认

这部分工作是支持研究基金会弗兰德斯格兰特12 s9218n (A.L.), 12 s9221n (A.L)和G044420N(学士和A.L)。这项工作也支持Methusalem格兰特(学士)。

补充材料

文件包括分析选择性的硝酸盐和亚硝酸盐荧光测定工具使用在我们的研究细节过氧硝酸盐测量和校准曲线。(补充材料)

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