二甲双胍促进轴突再生脊髓损伤后通过抑制氧化应激和稳定微管

文摘

脊髓损伤(SCI)是一种具有破坏性的疾病,可能导致终身残疾。因此,寻求有效的药物,有利于促进轴突再生和伸长SCI后得到了广泛关注。应用二甲双胍的降糖剂,已被证实能扮演的角色在不同的中枢神经系统(CNS)疾病。然而,二甲双胍的潜在的保护作用在SCI后神经再生尚不清楚。在这项研究中,我们发现二甲双胍的管理改善SCI后功能恢复通过减少神经细胞凋亡和神经突修复的稳定微管通过PI3K / Akt信号通路。抑制PI3K / Akt通路与LY294002部分逆转的二甲双胍疗效SCI在体外和体内。此外,二甲双胍治疗虚弱的过度激活氧化应激和改善线粒体功能通过激活核转录因子erythroid-related因子2 (Nrf2)和绑定到抗氧化反应元素(是)。此外,Nrf2抑制剂治疗ML385部分废除它的抗氧化作用。我们还发现,Nrf2转录部分减少LY294002体外。综上所述,这些研究结果显示,二甲双胍在SCI后神经再生的作用可能是与微管稳定和抑制过度激活Akt-mediated Nrf2 pathway-regulated氧化应激和线粒体功能障碍。 Overall, our present study suggests that metformin administration may provide a potential therapy for SCI.

1。介绍

创伤性脊髓损伤(SCI)是一个全球公共卫生问题的主要原因。数以百万计的人患有神经系统并发症与科学有关,包括四肢瘫痪或截瘫(1,2]。SCI后导致神经赤字主要和次要伤害。主要的损伤会导致结构性扰动时受伤的3]。然后,长期被认为是一个复杂和多因子的继发损伤阶段,可能会导致一系列的不利影响,包括氧化应激、炎症、和线粒体功能障碍,最终导致神经元细胞凋亡和抑制轴突再生和神经恢复(4- - - - - -6]。因此,有效预防有害的次要事件的减少神经细胞死亡和促进轴突再生是一个潜在的方法改善SCI后功能恢复。

众所周知,造成二次损伤SCI诱发神经细胞死亡(7]。此外,这种神经细胞死亡在很大程度上导致受伤的轴突,这是难以再生和重建连接与其他神经元在伤害(8]。在轴突形成微管装配是神经元极化和轴突生长的关键(9,10]。越来越微管稳定防止肿胀的轴突尖和轴突收缩后中枢神经系统损伤,促进培养的神经元的轴突生长11]。最近,一些研究已经证明,药物治疗能促进轴突的生长,促进轴突再生通过增加微管稳定(12]。此外,据报道,FGF13稳定微管,改善线粒体功能以提高轴突再生SCI后(13]。因此,调节微管稳定再生轴突被认为是科学的治疗方法。

高度无序代谢过程,氧化应激是抗氧化失衡的结果和prooxidant14]。最近的研究表明,氧化应激参与一系列的神经系统疾病,包括神经退化疾病,脑缺血,SCI (15- - - - - -17]。先前的研究已经表明,活性氧(ROS)生产,这是一个主要的不利影响在二次损伤,有显著提高SCI后(18]。脊髓受到损伤后,损伤部位是伴随着分和炎症,导致多余的活性氧的生产。因此,防止氧化应激的开发和使用抗氧化剂活性氧积累可能是有利于SCI复苏。先前的研究表明,抗氧化治疗可以触发的增加稳定微管,促进轴突再生(19),但氧化应激的作用在微管稳定SCI后仍不清楚。抗氧化防御系统,核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)结合抗氧化反应元素(是),cis-acting监管元素的基因编码蛋白质的抗氧化和二期解毒酶,从而调节一大群cytoprotective基因的表达,如血红素oxygenase-1 (HO-1)和NADH脱氢酶醌1 (NQO1)参与细胞抗氧化反应(20.,21]。作为调节Nrf2上游信号分子之一,PI3K / Akt通路为生存和发展是至关重要的,参与许多生理过程,如细胞骨架动力学和antiapoptosis [22]。此外,PI3K / Akt通路调节Nrf2 /路径然后抑制氧化应激和炎症SCI后(23]。因此,激活Nrf2 /信号通路有牵连的潜在治疗减少氧化应激和SCI后促进功能恢复。

二甲双胍,作为一个传统的降血糖药,规定被广泛用于治疗2型糖尿病和其他代谢综合症自1960年代(24]。二甲双胍改善高血糖通过抑制肝葡萄糖生产和增加外围葡萄糖利用率(25]。然而,它并不局限于降低葡萄糖的能力。越来越多的证据表明,二甲双胍有好处在各种中枢神经系统(CNS)疾病,包括缺血性脑损伤、帕金森病和亨廷顿氏病(26- - - - - -28]。在老鼠大脑微血管内皮细胞(RBEC)、二甲双胍增加transendothelial RBEC层电阻,减少钠荧光素和伊文思蓝渗透率通过上调紧密连接(TJ)蛋白质29日]。此外,二甲双胍已被证明在改善线粒体有保护作用稳定后氧化应激细胞凋亡在内皮细胞(30.]。最近,研究表明,二甲双胍治疗改善了运动后恢复SCI (31日,32),但其作用的潜在机制仍不清楚,尤其是它的作用在减少氧化应激或SCI后促进轴突再生。此外,其他研究已经表明,二甲双胍可以防止缺血脑创伤性神经细胞凋亡33]。然而,未知是否二甲双胍防止神经损伤SCI后促进轴突再生。许多研究报道,二甲双胍与PI3K / Akt信号通路有关。二甲双胍抑制PI3K / Akt通路被发现治疗食道癌细胞(34]。另一项研究报道,二甲双胍对缺血性心脏的影响是通过PI3K / Akt通路介导的(35]。然而,目前尚不清楚PI3K / Akt信号通路参与了二甲双胍在SCI的角色。

在目前的研究中,我们系统地研究了二甲双胍的角色在抗氧化和SCI后神经再生。我们已经发现了一些可能的分子机制SCI通过促进微管稳定和减少细胞凋亡通过激活PI3K / Akt通路。此外,二甲双胍的神经保护作用也与过度氧化应激的抑制和改善线粒体功能通过激活Nrf2 /通路。这些发现显示,二甲双胍政府促进经济复苏的SCI,建议使用二甲双胍可能在SCI的临床治疗。

2。材料和方法

2.1。脊髓损伤和药物治疗

Sprague-Dawley老鼠(女性;220 - 250克, )购买来自中国科学院动物中心。动物们被安置在标准温度条件下12 h光/暗周期,定期用食物和水。用2%的戊巴比妥钠麻醉的后(40毫克/公斤,i.p。),大鼠进行与椎板切除术T9层面暴露没有扰乱硬脑膜下的绳。然后,老鼠遭受的压缩血管夹(15克部队、奥斯卡、中国)1分钟。虚假的对照组,大鼠收到相同的手术损伤和不接受任何药物治疗但没有影响。二甲双胍与生理盐水稀释,以实现最终的二甲双胍20毫克/毫升的浓度。手术后,老鼠被给予二甲双胍溶液(50毫克/公斤)有/没有LY294002(一个特定的PI3K抑制剂,1.2毫克/公斤)立即通过腹腔注射,然后注射相同剂量二甲双胍溶液有/没有LY294002每天直到老鼠牺牲。老鼠在SCI组收到equivolumetric注射生理盐水后在相应的时间点伤害。术后护理包括人工膀胱排空每天两次,直到恢复膀胱功能和政府头孢唑啉钠(50毫克/公斤,i.p)。完成试验后,老鼠安乐死上使用过量的戊巴比妥钠7 d和14 d,除了24大鼠运动恢复的评估。 All surgical interventions and postoperative animal care were approved by the ethics committee of Wenzhou Medical University and performed in accordance with the指导实验室动物保健和使用的。

2.2。运动康复评估

低音部,比蒂,Bresnahan (BBB)分数评估三个培训调查人员对实验也不开放田地规模在1,3,5,7,和14 d术后。短暂,BBB评分范围从0分(完全瘫痪)21点(正常的运动)。规模开发利用的自然发展运动恢复与胸SCI大鼠(36]。此外,足迹分析是由浸大鼠与蓝色染料的前翼和后肢在SCI后14 d红色染料。每组10只老鼠被用来评估运动机能。

2.3。苏木精和伊红染色、尼氏小染色

每组的大鼠( )安乐死有过量的戊巴比妥钠,4%多聚甲醛0.01磷酸盐(PBS, )SCI后在7 d。组织部分包含病变损伤的两边(1厘米)石蜡包埋。横向石蜡部分(5μ米厚)是安装在poly-L-lysine-coated幻灯片的苏木精和伊红())染色和尼氏小染色,光学显微镜下检查。细胞染色用于观察空腔,在5毫米的病变。测量报告的保存面积的百分比与分析每个部分的总面积37]。尼氏小染色,腹侧运动神经元的数量(VMN)部分评估是在以前的报告38]。横向部分收集在喙的,尾5毫米,病变部位和醋酸甲苯基紫染色。后确定的细胞位于腹侧角越低,细胞超过一半的抽样广场(20×20μ米)算作VMN。细胞线在150以上μm腹中央运河被排除在外。这些细胞被手动从每个字段使用MetaMorph软件计算。

2.4。细胞培养治疗方案

PC12细胞从细胞购买银行文化的集合类型的中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院。在RPMI 1640培养基培养PC12细胞补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。细胞培养在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂和95%的空气在37°C。PC12细胞接受二甲双胍(1毫米),LY294002 (10μ米),ML385(小说和具体Nrf2抑制剂,2μ米),和H₂O₂(100μ米)8 h。所有实验进行至少三次。

2.5。初级皮层神经元文化

主要的皮质神经元获得怀孕Sprague-Dawley老鼠胚胎(E18)胎儿。简单地说,胎儿老鼠被斩首了。大脑皮层在冰冷的分离和冲洗汉克的缓冲区。清理血管后,皮质组织切成大约1毫米块,然后用0.125% trypsin-EDTA为20分钟37°C。孵化后,溶液过滤了100μm细胞过滤器(WHB)。在1000 rpm的细胞悬液离心5分钟,和细胞颗粒是完整的DMEM / F-12 resuspended。细胞培养4 h公司5%₂在37°C。然后,细胞被刷新和神经基础培养基(含2% B27 Gibco英杰公司)和0.5毫米谷酰胺(GlutaMAX™补充,Gibco)和培养在湿润的气氛中5%的有限公司₂和95%的空气在37°C。每3 d中取代了。

2.6。免疫印迹分析

脊髓组织样本提取7 d和14 d后立即手术,为西方墨点法snap-frozen在-80°C。简单,组织细胞溶解使用缓冲区里帕(1% Triton x - 100, 0.5%钠脱氧胆酸盐,1毫米PMSF, EDTA 1毫米,10μg / mL亮抑酶肽,20毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,pH值7.5)。体外,细胞被冲洗两次与PBS和细胞溶解在裂解缓冲(1%诺乃清洁剂p 40, 0.1% SDS, 1%钠脱氧胆酸盐,25毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,和pH值7.6)。蛋白质提取的胞质及核是由使用核和胞质蛋白提取工具包(中国Beyotime P0027)根据制造商的协议。组织和细胞溶解产物在12000转离心10分钟在4°C,和上层清液得到的蛋白质分析。蛋白质浓度与增强的BCA量化分析工具(Beyotime、上海、中国)。40μ克组织蛋白质是由sds - page分离和转移到PDGF膜(美国加州Bio-Rad)。阻塞后5%脱脂牛奶(Bio-Rad) 2 h,膜被孵化与主抗体GAPDH(1: 10000年,Bioworld) phosphor-Akt(1: 1000年,Abcam) total-Akt(1: 1000年,Abcam)裂解caspase3(1: 500年,Abcam),伯灵顿(1:1000年,细胞信号技术)、bcl - 2(1: 1000年,Abcam) Ace-tubulin(1: 1000年,细胞信号技术),Tyr-tubulin(1: 1000年,σ),MAP2(1: 1000年,细胞信号技术),GAP43(1: 1000年,Abcam), Nrf2(1: 1000年,Abcam) NQO1(1: 1000年,Abcam) HO-1(1: 10000年,Abcam),和组蛋白(1:1000年,Abcam)一夜之间在4°C。膜的清洗与TBST (Tween-20 Tris-buffered盐水和0.1%)三次,二次抗体孵育1 h在室温下。信号被ChemiDoc XRS +可视化成像系统(Bio-Rad)。我们通过使用一个软件数量分析了乐队。

2.7。免疫荧光染色

脊髓组织样本得到7 d和14 d后受伤。脊髓都后缀在4% PFA,洗,嵌入在石蜡。横向部分5μ米厚度,在二甲苯deparaffinized,水化,乙醇洗涤。此外,孵化了部分10%正常山羊血清1 h在室温下在PBS含有0.1% Triton x - 100。然后他们被适当的初级抗体孵育过夜在同一个缓冲区4°C。以下主要抗体被使用,基于不同的目标:Ace-tubulin(1: 500年,细胞信号技术),GFAP(1: 500年,圣克鲁斯)NeuN(1: 500年,Abcam) GAP43(1: 500年,Abcam) HO-1(1: 200年,Abcam) NQO1(1: 1000年,Abcam)和Tyr-tubulin(σ1:500)。主要抗体孵育后,部分用PBST洗净了 然后用Alexa孵化萤石488/594山羊anti-rabbit /鼠标二级抗体在室温下1 h。部分被冲洗三次PBST孵化和4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 10分钟,最后洗PBST和密封的盖玻片。使用f -肌动蛋白染色的,rhodamine-coupled phalloidin (Yeasen,上海)。捕获的图像用共焦荧光显微镜(尼康,A1 +、东京、日本);阳性神经元在每个部分统计的三名观察员对实验小组也不清楚。每部分相应的蛋白阳性细胞率的计算,从计算得到的值30 - 40随机部分在每个动物的病变部位,有5个动物检查每组。

2.8。TUNEL分析

DNA碎片检测使用原位细胞死亡检测设备(罗氏、南旧金山、钙、美国),和TUNEL染色进行7 d SCI后。的部分(5μ米厚)是deparaffinized和水化。然后,这些部分是处理20μg / mL蛋白酶K工作20分钟解决方案在37°C。部分被冲洗三次PBS和孵化TUNEL反应混合物在一个黑暗的湿润箱1 h在室温下。之后,部分是用PBS和对待DAPI在室温下10分钟。积极控制脊髓切片处理10 U /毫升DNase我缓冲在室温下10分钟前孵化与TUNEL反应混合物。消极的控制得到TUNEL没有TdT酶试剂。阳性细胞共焦荧光显微镜下观察(尼康,A1 +、东京、日本)和分析利用ImageJ软件。

2.9。测量细胞内ROS生成

细胞内ROS水平检测通过活性氧测定工具包(Beyotime S0033,中国)。简单地说,根据制造商的指示,PC12细胞暴露在H₂O₂有或没有二甲双胍8 h,然后沾10更易为30分钟/ L DCFH-DA 37°C。ROS水平评估通过共焦荧光显微镜观察与DCFH-DA细胞染色,而荧光强度测量,进行统计分析。对于每一个样本,收集20000个细胞。

2.10。测量和ATP水平

线粒体膜电位( )发现通过使用JC-1 (Beyotime C2006,中国)。PC12细胞被镀在共焦凹陷和孵化培养基含有JC-1 20分钟37°C。然后,细胞与冰冷的PBS冲洗两次,改变了新的媒介,使用共焦荧光显微镜检测到(A1 +尼康,东京,日本)。

使用ATP测定ATP水平检测工具(中国Beyotime S0026)根据制造商的协议。

2.11。统计分析

给出的结果 (SEM)从至少三个独立的实验。数据分析了单向方差分析(方差分析)Dunnett的紧随其后事后测试控制和治疗组之间比较。 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。二甲双胍降低脊髓组织损伤,改善SCI大鼠运动功能

在这项研究中,老鼠被给予二甲双胍溶液(50毫克/公斤,i.p。)立即确定二甲双胍可能促进SCI的复苏。BBB评级量表是用来评价二甲双胍SCI后的治疗效果。如图1(一)虚假集团执行略高于20单位的BBB运动评分和治疗受伤的老鼠在1.5(7天)和2(14天),救援在metformin-treated老鼠(得分,分别在3和4)大约是10%的最大实现(数字1(一)- - - - - -1 (c)),这表明二甲双胍组的运动功能显著改善SCI组相比。此外,使用圆)染色,我们进一步观察周围白质损伤的SCI后和中央灰质。metformin-treated集团一致运动评估显示,病变区和伤害减少保存前角运动神经元(数字1 (d)和1 (e)),这表明二甲双胍在SCI防止严重的破坏。与此同时,一些报道证实,PI3K / Akt信号通路参与了二甲双胍在缺血性心脏的影响(35]。然后,我们发现SCI后一种蛋白激酶的磷酸化状态。免疫印迹结果表明,p-Akt显著调节二甲双胍治疗后相比,在SCI集团(数字1 (f)和1 (g))。这些结果表明,PI3K / Akt信号通路可能参与二甲双胍SCI后的保护作用。上述结果进一步表明,二甲双胍在SCI对运动神经元神经保护功效。

3.2。PI3K / Akt信号通路的激活是SCI后参与二甲双胍的效果

进一步评估是否激活PI3K / Akt信号通路对二甲双胍促进经济复苏至关重要的SCI, LY294002(特定的PI3K抑制剂)被用来抑制PI3K / Akt信号通路。观察到p-Akt是二甲双胍治疗后显著增加SCI的集团相比,这些增加被LY294002治疗(数据明显抑制2(一个)和2 (b))。如数据所示2 (c)- - - - - -2 (e),BBB评分也表明,二甲双胍的保护作用功能恢复明显抑制了SCI LY294002治疗。)染色进一步透露,LY294002治疗显著扩大病变区域相比,仅在二甲双胍治疗组(数字2 (f)和2 (g))。此外,LY294002管理显著减少了运动神经元生存相比,仅在二甲双胍治疗(图2 (h))。在足迹分析中,metformin-treated老鼠显示下肢协调爬行和脚趾拖动在14 dpi很少。相比之下,老鼠从SCI和LY294002团体仍然显示不协调爬行和广泛的拖动(图2(我))。上述结果表明,二甲双胍PI3K / Akt信号通路的调节,增加了神经元生存,最终促进了SCI的功能恢复。

3.3。二甲双胍降低PI3K / Akt的通过激活凋亡信号通路

TUNEL染色法进行评估是否二甲双胍治疗减少了SCI后细胞凋亡水平。发现SCI凋亡细胞的数量急剧增加,与二甲双胍治疗改善它。然而,这种保护作用的二甲双胍在一定程度上削弱了LY294002治疗(数字3(一个)和3 (b))。此外,与TUNEL一致,免疫印迹分析也表明,二甲双胍治疗明显阻塞SCI-induced增加裂解caspase3,伯灵顿的表情。相比之下,二甲双胍增加bcl - 2表达的水平相比,在SCI组。然而,这种凋亡效应显著逆转了二甲双胍LY294002治疗(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。综上所述,上述结果进一步证实了SCI后二甲双胍的凋亡效应。

3.4。二甲双胍促进神经突SCI后赔偿

如上所示,二甲双胍治疗对SCI后神经保护作用。接下来,我们进一步探讨二甲双胍是否促进轴突的补偿。我们检查了acetylated-tubulin的表达(Ace-tubulin;稳定微管在轴突),tyrosinated-tubulin (Tyr-tubulin;动态微管在轴突),microtubule-associated蛋白2 (MAP2,特定的结构蛋白在神经元树突)在SCI后14 dpi(每组39- - - - - -41]。免疫印迹结果显示Ace-tubulin和MAP2表情显著增加二甲双胍组相比,在SCI组。相比之下,二甲双胍治疗显著减毒Tyr-tubulin水平相比,在SCI组。此外,LY294002治疗逆转的影响与增加Ace-tubulin MAP2和减少二甲双胍证明Tyr-tubulin(数据4(一)- - - - - -4 (d))。此外,coimmunofluorescence GFAP-labeled星形胶质细胞和轴突Ace-tubulin-labeled 14岁dpi执行。结果表明,GFAP-positive星形胶质细胞在SCI后累积损伤边境和二甲双胍治疗促进了轴突穿过病变边界和产物拉长深入远端地区相比,在SCI和LY294002治疗组(数字4 (e)和4 (f))。为了进一步证实二甲双胍的神经保护效应,我们有检查GAP43的表达,这是神经保护蛋白质(42]。结果表明,GAP43的表达虚假的处于非常低的水平,科学,和LY294002治疗组,二甲双胍治疗后显著增加(数据5(一个)和5 (b))。另外,我们已经完成了coimmunofluorescence染色GAP43 NeuN,并发现二甲双胍GAP43的表达明显增加,减少神经元的损失(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。这些数据表明,metformin-activated PI3K / Akt信号通路SCI后导致轴突再生。

3.5。二甲双胍可以降低氧化应激通过激活Nrf2 / SCI后信号通路

大量的研究已经证明,Nrf2 /信号通路是必不可少的二甲双胍的抗炎、抗氧化43]。进一步确定机制二甲双胍对SCI的治疗效果,我们评估Nrf2 /是否信号通路参与了二甲双胍在SCI的效果。我们发现Nrf2的表达水平,HO-1, NQO1。如数据所示6(一)- - - - - -6 (d),Nrf2的表情,HO-1 NQO1水平提高SCI后的价格相比虚假的组,表明SCI Nrf2 /激活信号通路。与科学组相比,二甲双胍治疗显著诱导Nrf2水平越高,HO-1, NQO1。此外,免疫荧光染色也表明HO-1的表达式和NQO1二甲双胍组显著增加(数据6 (e)和6 (f))。上述结果表明,二甲双胍治疗促进抗氧化水平通过激活Nrf2 / SCI后信号通路。

3.6。二甲双胍促进轴突再生和移民通过影响神经元微管稳定

为了进一步确定二甲双胍的效果,我们有检查Ace-tubulin的表达水平,Tyr-tubulin, MAP2在初级皮层神经元。在体外,₂O₂治疗被用于刺激急性SCI的微循环。如数据所示7(一)- - - - - -7 (d)免疫印迹结果显示Ace-tubulin和MAP2表情显著增加神经元二甲双胍治疗后相比,H₂O₂组。相比之下,二甲双胍显著减毒Tyr-tubulin水平相比,H₂O₂组。然而,LY294002治疗明显阻塞SCI后的二甲双胍对微管稳定的影响。此外,我们进一步评估的影响二甲双胍在初级皮层神经元微管稳定。主要的皮质神经元在DIV7激起了H₂O₂有和没有二甲双胍管理。然后,采用免疫荧光染色检测Ace-tubulin和Tyr-tubulin的表达式。结果表明,神经元没有二甲双胍治疗后H₂O₂有一个短轴突比对照组。然而,二甲双胍治疗组的轴突长度非常长比H₂O₂和LY294002组(数字7 (e)和7 (f))。Ace-tubulin比Tyr-tubulin进行评估的相对比例稳定动态微管(44]。我们发现二甲双胍管理导致显著增加Ace-tubulin H / Tyr-tubulin比率相比₂O₂和LY294002集团(图7 (g))。我们也使用主皮质神经元DIV3检测生长锥的形状(白色框架)免疫染色。如图7 (h)生长锥的平均直径明显增加二甲双胍组相比,H₂O₂和LY294002组。因此,以上结果表明,二甲双胍可以调节微管稳定,因此增加的内在增长能力轴突通过激活PI3K / Akt信号通路。

3.7。二甲双胍减轻线粒体功能障碍,减少ROS通过激活一种蛋白激酶/ Nrf2 /体外信号通路

在这里,使用H₂O₂处理PC12细胞,进一步评价二甲双胍治疗在体外抗氧化的效果。我们首先发现Nrf2蛋白的表达。如数据所示8(一个)和8 (b)核中提取的,西方的屁股anti-Nrf2抗体显示水平的易位Nrf2 H后增加₂O₂治疗和二甲双胍显著增加Nrf2易位。先前的研究表明,Nrf2正受PI3K / Akt显著,导致氧化应激的抑制23]。我们使用LY294002和ML385(小说和特定Nrf2抑制剂)45,46)进一步证实Nrf2所扮演的角色。结果表明,LY294002治疗不仅抑制p-Akt / t-Akt比率,但也抑制Nrf2可能促使进入细胞核。然而,ML385只抑制Nrf2转移核与p-Akt表达式(数据没有明显的影响8(一个)- - - - - -8 (d))。同样,我们发现更高的HO-1表达式和NQO1 metformin-treated组相比,治疗组,由ML385显著逆转治疗(数字8 (d)- - - - - -8 (f))。这些发现表明,Nrf2激活显著诱导表达HO-1和NQO1 H₂O₂条件和二甲双胍进一步增加HO-1和NQO1表达式通过激活/ Nrf2 / Akt通路。接下来,验证二甲双胍的保护作用是由于线粒体功能的改进,我们检测线粒体膜电位(Δψ米)在PC12细胞中使用JC-1染色试验。变化的比率aggregate-to-monomer荧光被表示为 。如数据所示9(一个)和9 (b)二甲双胍治疗明显增加了暴露后的PC12细胞H₂O₂2 h相比,h₂O₂集团ML385组和阳性对照组(CCCP集团)。这些结果显示,二甲双胍可以恢复线粒体活动。ROS的产生与线粒体功能障碍,造成重大不利影响在二次伤害。因此,我们试图了解二甲双胍是否会影响细胞内ROS水平使用特定探测器对过氧化氢,2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA)。荧光图像显示了明显的低密度荧光二甲双胍组相比,H₂O₂组、ML385组和ROSUP组(阳性对照组)(数据9 (c)和9 (d)),这表明二甲双胍对ROS的减少有显著的影响。此外,我们进一步监测细胞ATP水平。我们发现H后ATP水平相对较低₂O₂和二甲双胍治疗获救,而ML385逆转的影响二甲双胍的ATP水平(图所示9 (e))。基于这些结果,二甲双胍可能恢复线粒体功能障碍,然后减少ROS水平,导致神经元保护和再生。

4所示。讨论

科学是一种严重的神经系统疾病,可以诱导神经功能障碍和永久性的伤害。一系列的二次伤害,包括氧化应激、线粒体功能障碍,和神经细胞凋亡,被认为是残疾的主要因素(47]。因此,新的有效的治疗治疗减少SCI-induced神经障碍和组织迫切需要赔偿。应用二甲双胍的降糖剂,广泛用作治疗II型糖尿病(48]。我们之前的报告还显示,二甲双胍治疗改善SCI后功能恢复,部分是通过抑制神经细胞凋亡和衰减blood-spinal绳屏障破坏(32,49]。然而,目前尚不清楚是否二甲双胍治疗效果在轴突再生的复苏。在本研究中,我们发现二甲双胍治疗显著降低脊髓损伤,减少神经细胞凋亡,抑制氧化应激,促进轴突再生稳定微管,并最终改善SCI后功能恢复的老鼠。PI3K / Akt的激活和Nrf2 /通路是SCI二甲双胍治疗的潜在机制。

众所周知,SCI后受伤的轴突再生能力较差(50]。因此,它是有意义的探索促进轴突再生的方法。最近,各种neuroregenerative研究专注于树突和轴突修复改善中枢神经系统损伤后功能恢复(51]。之前的研究表明,二甲双胍发挥神经保护作用和促进功能恢复的记忆缺陷通过抗炎和触发神经发生52]。此外,最近的研究已经证实二甲双胍有益促进周围神经损伤后的神经再生(句)53]。这些研究表明,二甲双胍在轴突再生具有保护作用。然而,二甲双胍是否有治疗效果在轴突再生科学尚未报道。基于这些研究,我们推测,二甲双胍SCI后能促进轴突再生。在我们的研究中,我们发现二甲双胍的改善结果Ace-tubulin-labeled探明,表明二甲双胍能促进轴突再生。先前的研究已经表明,细胞骨架结构的改造,如微管稳定,对受伤的轴突的再生与生长锥启动(54]。我们发现二甲双胍调节的表达Ace-tubulin周围病变和增加的比率Ace-tubulin / Tyr-tubulin在初级皮层神经元在H₂O₂条件,表明二甲双胍对轴突再生的影响与微管稳定。我们目前的研究还显示,PI3K / Akt信号通路的神经保护对中枢神经系统的影响。与此同时,另一项研究进一步证实,PI3K / Akt信号通路参与了二甲双胍对缺血性心脏的保护作用35]。此外,PI3K / Akt也发挥了重要作用在稳定微管结构修复后神经突SCI (22]。这些研究表明,二甲双胍能激活SCI后PI3K / Akt信号通路。因此,我们假设PI3K / Akt通路为二甲双胍对微管稳定的影响是至关重要的。LY294002在这项研究中,我们发现,一个特定的PI3K抑制剂,显著逆转二甲双胍在微管稳定的影响,表明二甲双胍具有潜在的神经突修复SCI后通过稳定微管结构。

先前的研究已经表明,氧化应激产生一个破坏性的角色在SCI和糖尿病性神经病55,56]。过度氧化应激与活性氧积累会导致神经元凋亡,这并不有利于神经再生(57]。许多研究报道,Akt通路antiapoptosis过程中起着重要的作用[58]。在这项研究中,我们发现二甲双胍增强尼氏小体的数量和维护正常的形态通过激活PI3K / Akt通路,表明二甲双胍治疗可以保护神经元免受SCI-induced凋亡PI3K / Akt信号通路。此外,陆等人已经证实21提高功能恢复和轴突再生纤维母细胞生长因子通过调节氧化应激后句(59]。减少过度氧化应激改善SCI后运动功能恢复(60]。此前的一项研究也表明,二甲双胍抑制恢复线粒体生物起源的PDK4 /氧化stress-mediated凋亡通路(61年]。基于这些研究,我们推测,二甲双胍具有重要作用在防止过度SCI后氧化应激。为了验证这个假设,我们暴露了PC12细胞H₂O₂诱导氧化应激和治疗1毫米二甲双胍。结果表明,活性氧的大量积累引起的PC12细胞,与二甲双胍治疗明显改善。此外,我们还发现二甲双胍抗氧化能力在体外和体内,展现在NQO1和HO-1显著增长水平。抗氧化防御系统,Nrf2是一个关键的抗氧化的后卫将是维持正常的氧化水平(62年]。此外,许多研究表明,Nrf2 /在氧化应激通路中起着重要作用[63年]。符合之前的研究中,我们的研究结果还表明,二甲双胍的抗氧化能力被ML385部分逆转(小说和特定Nrf2抑制剂),这表明Nrf2 /信号通路可能是一个潜在机制二甲双胍SCI后防止氧化应激。

众所周知,线粒体是真核细胞细胞器的主要力量的地方,导致ATP生成通过电子传递链的氧化磷酸化反应。此外,辛格等人已经表明,线粒体功能障碍中起着重要作用在神经损伤后继发损伤,导致活性氧的积累,神经细胞死亡和损伤的能量转换(64年]。另一方面,轴突再生是一个复杂的过程,需要正常的线粒体功能提供能量(65年]。因此,维持正常的线粒体功能是轴突再生的关键。Pintana等人报道说,二甲双胍可以防止大脑线粒体功能障碍,恢复学习行为高脂肪食源性胰岛素抵抗大鼠(66年]。基于这些研究,我们推测,二甲双胍具有至关重要的作用在神经细胞线粒体功能。我们发现二甲双胍保护线粒体膜电位和ATP水平从H₂O₂体外条件。这一结果表明,二甲双胍对SCI复苏的影响在一定程度上是通过保护线粒体功能。

大量研究表明,Akt施加强有力的抗氧化效果通过增加Nrf2[的转录活动67年]。Nrf2是一个关键的转录因子结合抗氧化反应元素(是),然后保持一个正常的氧化应激水平(62年]。此外,Nrf2 / Akt信号被认为是关键的分子调控机制减轻氧化应激神经损伤(68年- - - - - -70年]。然而,没有明确的证据证实二甲双胍抗氧化压力的作用是密切相关的一种蛋白激酶/ Nrf2 / SCI后信号。在这项研究中,二甲双胍的表达水平显著调节总Nrf2核Nrf2 NQO1、HO-1体内和体外。我们还发现二甲双胍磷酸化Akt的表达增加。这些结果表明,二甲双胍的神经保护作用可能是由于它的抗氧化能力通过激活/ Nrf2 / Akt通路。

我们的研究已确定,二甲双胍对SCI后的神经保护作用,澄清二甲双胍治疗SCI的相关机制。然而,有几个问题需要进一步的研究要做。首先,更实用和更少的入侵途径,口服二甲双胍的更有利于临床应用,但这可能会表现出不同的剂量反应曲线相比,ip注入。因此,有必要进一步确定口服二甲双胍的功效SCI的预防。其次,众所周知,糖尿病加重SCI的预后(71年),但老鼠被SCI是正常SD大鼠在我们当前的研究。因此,作为一个传统的抗糖尿病药,二甲双胍在SCI预防糖尿病大鼠的疗效需要在未来的研究中进行验证。

5。结论

我们当前的研究表明,二甲双胍治疗可以显著减少脊髓损伤,随后提高SCI后的功能恢复。此外,我们首先证明了二甲双胍在SCI的保护作用与减少神经细胞凋亡和促进轴突再生的稳定微管。此外,抑制过度的氧化应激和线粒体功能恢复至关重要的积极作用,二甲双胍的参与/ Nrf2 / Akt信号通路。我们的研究表明,二甲双胍可能合适的潜在的治疗策略SCI复苏。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81722028,81722028,81802251),和浙江省自然科学基金(R18H50001, LQ18H090008, LQ18H150003)。

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