褪黑激素抑制Ferroptosis引起高葡萄糖通过激活Nrf2 / HO-1信号通路在2型糖尿病性骨质疏松症

文摘

Ferroptosis最近发现,铁和活性氧(ROS)依赖的调控的细胞死亡形式。本研究旨在确定ferroptosis的存在在2型糖尿病骨质疏松症的发病机制和确认褪黑激素可以抑制成骨细胞通过激活Nrf2 / ferroptosis HO-1信号通路来改善骨微观结构在活的有机体内和在体外。我们对待MC3T3-E1细胞与不同浓度的褪黑激素(1、10或100μ米),然后把它们暴露于高葡萄糖(25.5毫米)48 h在体外。我们的数据表明,高葡萄糖可以诱导成骨细胞细胞毒性和脂质过氧化物的积累,成骨细胞的线粒体显示相同的形态学变化erastin治疗组,和ferroptosis-related蛋白质的表达谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)和cystine-glutamate逆向转运(SLC7A11)表达下调,但这些影响被ferroptosis抑制剂逆转ferrastatin-1和铁螯合剂去铁胺(柴油)。此外,免疫印迹和实时聚合酶链反应被用来检测核因子红细胞两个相关因子的表达水平2 (Nrf2)和血红素oxygenase-1 (HO-1);成骨的能力评估,茜素红染色和osteoprotegerin的表达,骨钙素,和碱性磷酸酶;结果表明,这些蛋白的表达水平在成骨细胞与1中,10或100μM褪黑素葡萄糖组均明显高于高,但使用后Nrf2-SiRNA干扰,显著抑制褪黑激素的治疗效果。我们还执行在活的有机体内实验在糖尿病大鼠模型处理两个浓度的褪黑激素(10、50毫克/公斤)。动态骨histomorphometry和ct机被用来观察大鼠骨微观结构和表达GPX4 Nrf2决心通过免疫组织化学。在这里,我们第一次报告,高葡萄糖诱导ferroptosis通过增加活性氧/脂质过氧化/谷胱甘肽耗竭在2型糖尿病性骨质疏松症。更重要的是,褪黑素水平显著降低ferroptosis和改进的成骨的能力通过激活MC3T3-E1 Nrf2 / HO-1通路在活的有机体内和在体外。

1。介绍

2型糖尿病(T2DM)病人体内是一种缓慢进展的疾病与实质性的并发症,包括神经病变、肾病和视网膜病变。流行病学研究表明,骨质疏松性骨折的发病率增加在二型糖尿病患者与健康人群相比1,2),这种风险进一步增加了患者在胰岛素(3]。然而,不能解释为增加骨质疏松性骨折的发生率减少骨矿物质密度(BMD),与1型糖尿病,BMD患者2型糖尿病的作用仍不清楚(4,5]。T2DM-related骨质疏松症的机理(T2DOP)因此仍有待澄清,进一步指导临床治疗。

铁过载报道导致小鼠骨质疏松,骨质疏松症,这是密切相关(6- - - - - -8]。Ferroptosis最近被认定为一个铁和活性氧(ROS)的依赖形式的调节细胞死亡(9),据报道,参与各种各样的疾病,比如癌症、肾变性,脑出血,创伤性脑损伤(10- - - - - -13]。这种形式的iron-dependent细胞死亡与细胞凋亡、自噬、坏死,和其他细胞死亡方式的生物化学和形态。Ferroptosis可能由特定的诱导物,如弹性蛋白和RSL3。它的特征是细胞内铁和脂质活性氧的积累,及其形态学特征是线粒体收缩(9,14,15]。许多研究已经证实氧化应激的重要角色在糖尿病骨质疏松症的发病机制16- - - - - -18]。我们之前确定铁过载引起的过度的二价金属转运蛋白1 (DMT1)成骨细胞和T2DOP的发病机制中发挥重要作用[19,20.]。我们推测可能发生ferroptosis T2DOP发病期间和当前研究确定ferroptosis的存在和机制。

褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)有很多对人体的影响,包括调节睡眠-觉醒节律、生理周期、免疫防御、心血管功能和骨代谢(21- - - - - -24]。此外,大量研究表明,褪黑素是一种有效的内源性抗氧化剂(25),这也间接地刺激某些抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx) [26]。此外,褪黑激素有效防止骨质疏松症在切除卵巢的老鼠和新成立的皮质骨股的数量增加,促进骨形成,并防止骨质流失在准更年期妇女27,28]。我们的研究证实了在T2DOP褪黑激素和自噬细胞死亡之间的关系(19],ferroptosis是一种细胞死亡方式与ROS和铁体内平衡密切相关。因此,我们推测,褪黑激素和ferroptosis相关,但具体机制还有待进一步探讨。

核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)信号通路下游直接ROS的转录调节抗氧化剂响应要素——(是)依赖基因平衡氧化介质和维持细胞氧化还原内稳态29日]。最近的研究显示,褪黑素减少肾脏损害引起的糖尿病和发挥神经保护效应通过激活Nrf2 /血红素oxygenase-1 (HO-1)途径和提高水平的抗氧化酶HO-1和NAD (P) H脱氢酶(醌)1 (NQO1) (30.,31日]。Nrf2也被报道来防止ferroptosis erastin或RSL3引起的肿瘤细胞(32,33]。然而,需要进一步的研究来确定潜在的机制Nrf2 / HO-1通路和ferroptosis改善骨微结构的褪黑激素。

我们之前发现褪黑素减少在成骨细胞自噬和延迟diabetes-induced骨质疏松症通过抑制细胞外signal-regulated激酶信号通路(34]。越来越多的证据也表明,褪黑素可以调节细胞死亡通路,包括细胞凋亡、自噬、坏死(35- - - - - -37]。然而,褪黑激素的能力保护成骨细胞免受ferroptosis-induced T2DOP损害,以及潜在的机制,仍然是未知的。本研究旨在评估褪黑激素的影响在活的有机体内和在体外T2DOP模型并确定如果褪黑激素保护造骨细胞通过抑制ferroptosis通过减轻氧化应激通过Nrf2 / HO-1通路,以及确定临床治疗的潜在治疗靶点。

1.1。细胞培养

成骨细胞的细胞行MC3T3-E1得到来自美国文化集合类型。细胞培养中α最小基本介质(αmem)(美国UT Hyclone)含10%胎牛血清(Hyclone)湿润有限公司5%₂气氛在37°C。MC3T3-E1细胞培养在成骨的T2DM-mimic条件αmem和25.5毫米葡萄糖(美国密苏里州Sigma-Aldrich)和1毫米游离脂肪酸(棕榈酸和油酸的比例1:2)。MC3T3-E1细胞培养常规培养基中含有不同浓度的褪黑激素(0、1、10或100μ米)48 h后暴露于高葡萄糖(25.5 mM HG) 24小时。调查的存在和潜在机制ferroptosis在成骨细胞,ferroptosis抑制剂ferrostatin-1 (Fer-1) (5μ米),自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA)(5毫米),细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK (10μ米),坏死抑制剂necrostain-1 (Nec-1) (50μ米)被添加到细胞培养。

1.2。试剂和抗体

褪黑素,牛血清白蛋白,去铁胺(柴油),Fer-1, 3-MA, Z-VAD-FMK, Nec-1, luzindole(褪黑素受体拮抗剂)买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。NRF2小核RNA)从GeneChem购买(中国)。主要的抗体使用如下:anti-osteoprotegerin(功能、ab73400) anti-GPx4 (ab125066) anti-SLC7A11 (ab37185) anti-Nrf2 (ab62352) anti-NQO1 (ab80588) anti-HO1 (ab13248)和anti-osteocalcin (OCN ab13420)(从Abcam,剑桥,英国)。所有二级抗体和Anti-glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH TA309157)从ZsBio购买。

1.3。细胞生存能力分析

取对数生长期细胞,消化,使单个细胞悬液,数数,接种MC3T3-E1细胞96孔板的细胞密度5000 /,并添加PBS为液体密封边缘井。当细胞的融合率上升到70 - 90%,原中被丢弃和改变无血清培养基,细胞饥饿24 h,促进细胞同步。后加10μLCCK8每个好,反应试剂37°C孵化器4 h,微型板块的读者(美国马热)是用于检测细胞的OD值在每个在450海里。相对细胞活性=(治疗组OD值留空组OD值)/(对照组OD值留空组OD值),表示为一个百分比。每个实验重复三次。

1.4。核转染

NRF2基因表达是使转染撞倒了 MC3T3-E1细胞与siRNA-NRF2或核控制(GenePharma有限公司有限公司,上海,中国。小干扰rna转染瞬态进行使用Lipofectamine 3000(美国表达载体),根据制造商的指示。转染24小时后,MC3T3-E1 HG的处理和不同浓度的褪黑激素。转染效率是经免疫印迹。

1.5。ROS水平测定

细胞被播种在 细胞6-well盘子。加入2毫升介质不同的药物和孵化48 h,取代了与无血清培养基中,包含10μmol / L 2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),放置在黑暗中30分钟。加5μL的预配置7-aminoactinomycin D(凯基生物生物技术,南京,中国)解决每个管和孵化在黑暗中在室温下约5分钟去除死细胞干扰。最后,它在流式细胞分析仪检测,使用一个发射波长525 nm和488 nm的激发波长。每组细胞的平均荧光强度代表细胞中活性氧的水平。

1.6。减少测定谷胱甘肽(GSH)的水平

MC3T3-E1细胞被播种 细胞6-well盘子。用不同的方法治疗后48小时内,细胞被洗两次与磷酸盐(PBS)和离心收集细胞。三倍的体积单元粒子被添加到蛋白质去除试剂溶液,然后对样本执行两个快速冻融周期使用液态氮和37°C水浴,分别,紧随其后的是4°C 10000×5分钟和离心机10分钟。取上层清液,并确定谷胱甘肽含量根据提供的方法谷胱甘肽和GSSG试验设备(产品号S0053 Beyotime)。吸光度的测定波长410 nm标。画一个标准曲线的吸光度的标准产品,最后计算每组的谷胱甘肽浓度的样品。

1.7。丙二醛(MDA)测量

小心地提取每组细胞蛋白质和添加0.1毫升样品和0.2毫升MDA检测解决每一个好工作。混合后,在沸水中加热15分钟。冷却后,200μl的上层清液添加到96孔板,然后,吸光度测量在532 nm使用标计算MDA水平。

1.8。实时逆转录(RT)聚合酶连锁反应(PCR)

RNA提取总RNA分离使用MiniBEST通用设备(豆类、志贺、日本)和逆转录使用Primescript RT执行主混合(豆类)。实时PCR进行480年LightCycler实时PCR系统(罗氏、巴塞尔、瑞士)使用SYBR预混料交货taq II工具包(豆类)。表列出了引物用于放大GPx4 (GPX4),Nrf2 (NRF2),HO-1 (HMOX1)、碱性磷酸酶(高山,ALPL),功能、OCN和β肌动蛋白(ACTB)。放大条件如下:95°C 30年代,紧随其后的是40 95°C的周期5 s, 20年代和60°C。相对mRNA表达量化阈值(Ct)值,通过比较循环β肌动蛋白是作为内部控制。实验数据处理的2^{- - - - - -ΔΔCt}方法如下:ΔΔCt = (Ct target-Ct内部控制)实验组,对照组(Ct target-Ct内部控制)(38]。每个实验重复三次。

1.9。免疫印迹分析

治疗后,首先仔细地吸入治疗从每组细胞上清液,加入2毫升的PBS重复洗涤;然后,提取细胞裂解缓冲和地方冰溶化了30分钟。上层清液离心机在12000×15分钟在4°C,上层清液所含的总蛋白质是收获。电泳和转移到聚乙二烯二氟化物膜根据不同分子量的蛋白质在低温度。阻塞后,把它放在主抗体稀释率的孵化箱1:1000年,一夜之间在4摄氏度。然后,仔细细胞膜进入二级抗体孵化箱,添加山羊anti-rabbit和anti-mouse二级抗体的稀释比例1:5000年,在室温下孵化1小时。特定的乐队使用EC3可视化成像系统(UVP Inc .高地、钙、美国),和每个波段的光密度测量使用ImageJ软件(NIH,贝塞斯达,医学博士,美国)。计算的相关内容感兴趣的蛋白质之间的比例和GAPDH在同一个样本并以图形方式表示。

1.10。透射电子显微镜法

MC3T3-E1细胞resuspended和转移到6-well板块继续培养48小时不同的干预方法,收集到的细胞被固定为0.25% Trypsin-EDTA(美国Gibco生活技术,马里兰州)4小时,和1%锇酸(Sigma-Aldrich)0.1磷酸盐缓冲剂(PH7.4)被固定在室温下2小时。染色的标本椽酸铅(Sigma-Aldrich)和2%醋酸铀(美国Amresco,梭伦,哦)饱和水溶液序列。然后,我们使用一个Ultracut年代超微切片机(徕卡微系统公司位于德国)准备50 nm厚片。把切下的透射电子显微镜(JEOL,东京,日本),观察电子显微镜下细胞的超微结构。

1.11。茜素红S染色

MC3T3-E1细胞resuspended、接种和培养密度 /好。经过48小时的不同的治疗方法,在成骨诱导培养基培养细胞为2周。清洗后,用10%多聚甲醛10分钟。准备1%茜素红溶液(Sigma-Aldrich)和染色5分钟。冲洗后再,观察倒置光学显微镜使用Image-Pro + 6.0(美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)和计算钙结节的数量在10个字段。

1.12。道德声明

制度伦理审查委员会的中国医科大学第一医院批准了这项研究。在我们实验的动物使用符合伦理要求。与本研究相关的所有活动项目进行后中国医科大学第一医院机构指南和临床规定。

1.13。实验动物

八周大specific-pathogen-free雄性sd大鼠中称重 g是购自中国医科大学实验动物部(动物证书号码:SCXK(辽宁),2008 - 0005年)。60老鼠用于确定骨histomorphometry的目标;45老鼠用于建立糖尿病模型,和剩下的15大鼠分为对照组。糖尿病大鼠被分为三组( )治疗腹腔内注射高剂量的褪黑激素(50毫克/公斤,HMT集团)、低剂量腹腔注射褪黑激素(10毫克/公斤,航空航天集团),和一个控制2型糖尿病组。

1.14。模型和样本采集

首先,SD大鼠喂养高脂肪和高糖饮食2个月,同时,他们可以喝水12小时/天。为了更好地构建一个2型糖尿病模型和提高建模成功率,我们选择了小剂量链脲霉素(Sigma-Aldrich S0130)(30毫克/公斤)多个腹腔内注射的方法建模。72小时后,空腹血糖7.8 >更易与L和胰岛素敏感性下降,和模型成功建立39]。血糖和体重测量并记录在一段固定的时间(0、4、8、12周)。老鼠们被安置在一个温控房间( °C)光/暗周期为12小时。老鼠的重量保持220克和270克之间,血糖维持在5更易/ L和18更易/ L。老鼠被颈椎脱位4 W,牺牲8 W, 12 W模型后,胫骨被带进新鲜无菌磷酸盐4%福尔马林溶液,然后在4°C存储在冰箱里。

1.15。钙黄绿素双标记

钙黄绿素双标记的骨头是由钙黄绿素腹腔注射(5毫克/公斤)12人,2天前牺牲。双钙黄绿素绿色标记测量皮质骨近端附近干骨后端使用荧光显微镜(奥林巴斯BX-60、东京、日本)。矿物附着率(MAR),矿化表面/骨表面(BS)和骨形成率(BFR)测量根据标准化协议使用一个Osteo-Measure histomorphometry系统(美国Osteometrics迪凯特,GA)。所有参数后histomorphometric术语和定义的骨矿研究的美国社会。

1.16。Microcomputed断层扫描(CT)的评估

老鼠牺牲麻醉下颈椎脱位4、8、12周。得到了合适的股骨,软组织被移除。骨样本被放置在一个直径10毫米管垂直于扫描轴,和下面的扫描参数选择: 图像矩阵,80千伏电压,80μ目前,2.96年代曝光时间。松质骨区(1.0毫米3.0毫米厚)从远端生长板被选中,和190年的最低阈值图像拔牙被用来制作的重建。通过微ct图像被重组,以下参数测定:骨密度、骨小梁体积/组织体积(BV /电视),小梁(Tb.N)数量,小梁厚度(Tb.Th)。

1.17。免疫组织化学(包含IHC)

胫骨部分(10μ米)在二甲苯和水化deparaffinized分级系列乙醇(100%,95%,80%,和75%)5分钟,其次是抗原复苏。3%的部分被孵化H₂O₂在37°C,持续15分钟,用PBS,孵化与山羊血清为30分钟37°C,然后孵化主要兔单克隆anti-GPx4 (1: 100;ab125066 Abcam,剑桥,美国马)或anti-Nrf2抗体(1:100;一夜之间ab62352 Abcam)在4°C。第二天,部分与二次孵化山羊anti-rabbit抗体(ZsBio,北京)45分钟在37°C其次是ABC工作方案(ZsBio) 25分钟37°C和孵化3,3-diaminobenzidine (ZsBio)。十视觉领域被随机选择莱卡DM600B自动显微镜下为每个样本(徕卡微系统,海德堡GmbH,德国)。GPx4 Nrf2表达式和量化使用Image-Pro + 6.0(媒体控制论),和平均密度值(集成光密度除以相关区域)计算每个视野。

1.18。统计分析

被表示为定量变量 。所有的数据进行了分析使用GraphPad Prism 6.02 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。通过学生的两组之间的差异进行了分析 - - - - - -测试和多个组比较,单向方差分析(方差分析)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

2。结果

2.1。Ferroptosis被HG MC3T3细胞诱导

基于先前的报道,我们对待MC3T3细胞葡萄糖25.5毫米(HG),符合微环境的2型糖尿病,控制细胞治疗与5.5毫米葡萄糖(40]。HG显著抑制细胞生存能力,由CCK-8化验(图1(一))。以确定汞引起的细胞生存能力的下降是由于ferroptosis,我们把细胞与半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK测量细胞死亡。半胱天冬酶抑制剂未能阻止HG-induced细胞死亡(图1(一))。同样的,我们对待HG MC3T3细胞自噬抑制剂3-MA和坏死抑制剂Nec-1,产生细胞生存(图没有明显改善1(一))。与Fer-1然而,治疗的细胞,抑制ferroptosis,阻塞HG-induced细胞死亡(图1(一))。Ferroptosis是iron-dependent类型的细胞死亡定义为脂质过氧化作用。识别HG-induced铁细胞死亡的作用,我们与铁螯合剂治疗细胞MC3T3柴油,导致一个明显的增加HG-induced细胞死亡(图1(一))。相比之下,仅使用这些试剂(Z-VAD-FMK、Fer-1 3-MA, Nec-1,和柴油)没有影响的可行性MC3T3细胞(图1(一))。

GPx4 ferroptosis的一个标志,是明显减少了HG治疗,符合积极控制(erastin)的表达水平SLC7A11(图2 (b))。此外,添加Fer-1 HG-treated成骨细胞的表达水平显著提高GPx4和SLC7A11相比HG-alone组(图2 (b))。线粒体的变化被认为是一个主要特点ferroptosis [9]。因此,线粒体超微结构的变化观察MC3T3细胞治疗HG erastin,分别和线粒体出现一般较小和较管状,与darker-stained膜不同的中断内膜折叠(见图1 (c))。脂质ROS水平测量使用SOD和MDA工具包,和ROS水平通过流式细胞仪测定,表明脂质ROS水平增加了HG治疗(数据3 (c)和3 (d))。总的来说,我们认为ferroptosis参与HG-induced细胞死亡的过程中,这部小说表明细胞死亡方式可以打开新的治疗方案的临床治疗2型糖尿病。

2.2。褪黑素细胞MC3T3保护反对通过Nrf2 Ferroptosis / HO-1信号通路

我们决定如果MC3T3细胞生存能力受到HG-induced ferroptosis,补充褪黑激素获救。HG-induced减少细胞生存能力被1逆转,10,100μ褪黑激素,由CCK-8化验(图3(一个))。确认褪黑激素能增加细胞活力,我们表明,褪黑激素受体抑制剂的加入luzindole HG-treated细胞逆转褪黑激素(图的治疗效果3(一个))。不同浓度的褪黑激素治疗后也增加了细胞的生存能力与erastin(积极的控制(图)3 (b))。

关于脂质过氧化,褪黑激素和Fer-1显著恢复ROS水平和过氧化脂质生成,包括谷胱甘肽和MDA含量和SOD活性(图3 (d))。流式细胞术还显示,褪黑素显著降低ROS生产,特别是100年μ褪黑素,但这种改进被褪黑激素受体抑制剂抑制luzindole(图3 (c))。治疗与褪黑素细胞和Fer-1 GPx4的蛋白质含量明显增加,表明褪黑激素和Fer-1抑制ferroptosis MC3T3细胞(图4(一))。

除了这些功能之外,先前的研究表明,褪黑素也是一种有效的内源性抗氧化(25,41]。在最近的研究中,褪黑激素是清除ROS(图所示3 (c))。Nrf2信号通路是ROS的直接下游通路,调节相关基因的转录氧化介质和维持细胞氧化还原内稳态平衡。Nrf2、NQO1、HO-1表达被抑制在HG -, erastin-induced ferroptosis,如图所示,西方墨点法和rt - pcr。然而,这些蛋白的表达水平明显增加了用不同浓度的褪黑激素治疗和Fer-1(数字2(一个)和2 (b)),这表明褪黑激素抑制ferroptosis通过激活Nrf2 / HO-1通路。

进一步说明Nrf2通路的作用HG-induced ferroptosis,我们撞倒了NRF2使用NRF2-siRNA表达式。免疫印迹证实显著减少Nrf2表达转染后(图4(一))。褪黑激素增加NRF2-siRNA-transfected HG细胞的生存能力,如CCK-8试验(图所示4 (b))。蛋白质的浓度GPx4和SLC7a11 ferroptosis的重要指标。因此,我们发现这些蛋白质在细胞MC3T3西方墨点法,并没有发现显著变化NRF2-siRNA组的表达水平,这表明ferroptosis抑制剂Fer-1不是Nrf2 / HO-1通路密切相关(图4 (c))。然而,100年μ褪黑素显著降低GPx4的表达和SLC7a11与HG-alone组相比,表明积极的表达Nrf2 / HO-1通路的抑制是一个重要的先决条件ferroptosis褪黑激素(图4 (c))。

2.3。褪黑素预防HG-Induced抑制成骨分化在体外

我们评估了成骨细胞osteogenesis-associated蛋白质功能和OCN。功能抑制破骨细胞的功能,因此减少功能表达式可以作为生物标志物的骨吸收。OCN促进骨生成,对骨矿化至关重要,因此骨生成的生物标志物。功能和OCN HG 100 +褪黑激素水平调节μM组相比HG-alone组,而相反的趋势观察NRF2-siRNA HG和100μ褪黑素组(图5(一个))。为进一步验证,我们发现高山,OCN,通过rt - pcr MC3T3细胞功能mRNA水平。增加褪黑激素浓度显著增加成骨细胞的成骨细胞的能力与HG-alone组相比,但骨NRF2-siRNA组显著降低(图5 (b))。我们也评估ferroptosis和褪黑激素的影响的能力MC3T3细胞分化成成熟的成骨细胞和形成矿化细胞外基质,用茜素红染色。经过14天的文化,接受HG - 100细胞μM褪黑素显示增加矿化结节形成与HG-alone组相比,而相反的结果在HG + NRF2-siRNA组(图5 (c))。这些结果表明,汞的存在,褪黑素可能与成骨的能力呈正相关通过Nrf2 / HO-1通路。

2.4。褪黑激素增强骨形成和改善2型糖尿病大鼠的骨密度

在这项研究中,我们建立的2型糖尿病大鼠模型结合使用intralipids骨质疏松症和小剂量链脲霉素,模仿2型糖尿病作为一种广泛使用的模型。糖尿病主要表现为体重减轻、高血糖、胰岛素抵抗(ISI),因此我们证实模型的有效性通过检查体重、血糖水平和ISI的模型动物。体重显著低于模型与正常大鼠相比,光纤光栅在高和ISI低与正常大鼠相比,模型(图6(一))。这些结果验证我们的2型糖尿病动物模型。

动态骨histomorphometry参数计算使用钙黄绿素双标记探讨褪黑素对2型糖尿病大鼠骨形成的影响。钙黄绿素注射两次(12和2天)在大鼠被牺牲了。interlabel距离是在2型糖尿病与对照组相比显著降低(图6 (b))。3月,矿化表面/ BS, BFR melatonin-treated组都显著增加(50或10毫克/公斤)与2型糖尿病组(数字6 (b)和6 (c))。

分析褪黑激素对骨微观结构的影响,我们评估动态小梁骨形成标记,包括BFR / BV和MAR和静态指标包括BMD,结核病。N, Tb.Th。动态和静态分析胫骨透露,骨骼结构是在2型糖尿病与正常大鼠相比明显恶化。我们额外的糖尿病大鼠注射大剂量褪黑激素(HMT, 50毫克/公斤)或低剂量褪黑激素(以前,10毫克/公斤)和测量上述参数在这些老鼠和老鼠(T2DM组)病人在2型糖尿病控制。HMT和以前都促进了骨小梁的形成和增加BMD, BV /电视,结核病。N,结核病。Th(图7(一)和7 (b))。这些结果表明褪黑素提高了骨微结构与糖尿病大鼠。

GPx4 ferroptosis的生物标志物。我们发现GPx4蛋白质含量在包含IHC骨组织。GPx4广泛分布在皮质和松质骨。骨头ferroptosis水平明显高于在2型糖尿病组与对照组相比,但较低的HMT和牵头组织与2型糖尿病组(图8)。Nrf2骨组织也被包含IHC和HMT和航空航天组显著高于在2型糖尿病组(图8)。这些结果暗示ferroptosis显著增加2型糖尿病老鼠的骨骼组织,但褪黑素可以减少通过Nrf2 ferroptosis / HO-1通路。

3所示。讨论

T2DOP上有越来越多的研究,但最好的动物模型使用尚不清楚42]。当前研究的目的是探讨糖尿病并发骨质疏松的机制,这需要一个模型,模仿糖尿病的病理过程。因此,我们创建了一个鼠模型T2DOP使用intralipids和低剂量链脲霉素,已广泛用于模拟2型糖尿病(43,44]。我们也对成骨细胞与HG(25.5毫米)来创建一个糖尿病微环境在体外,先前报道40]。结果表明,汞可以抑制成骨细胞的活性和骨微观结构在活的有机体内和在体外。

其复杂的机制意味着研究二型糖尿病的发病机制一直不佳。我们之前发现铁过载和氧化应激T2DOP发病的重要因素[45,46]。最近发现的程序性细胞死亡形式称为ferroptosis,表现为细胞内铁和脂质活性氧的积累,科学家已经引起了极大的兴趣,因为它在2012年首次报道(9]。然而,ferroptosis的研究仍处于起步阶段,目前还没有简单或精确检测方法存在ferroptosis [47]。在这项研究中,我们发现抑制HG对成骨细胞的影响生存ferroptosis抑制剂Fer-1可以逆转,和柴油。电子显微镜显示,HG影响成骨细胞中线粒体的形态通过增加双层线粒体膜上的密度和减少线粒体内嵴。这种形态变化是符合erastin的影响,作为一个积极的控制。HG也增加了细胞内ROS,促进了脂质氧化的积累,减少GPx4 ferroptosis-related蛋白质在细胞的表达水平。总的来说,这些结果表明,ferroptosis HG诱导的成骨细胞。

Nrf2是一个著名的转录因子在抗氧化作用中扮演着重要的角色,也被认为是一个重要的调节因子ferroptosis [48,49]。Nrf2 / HO-1信号通路最近被证明作为内源性抗氧化剂,对抗氧化应激损伤在多个器官和病理损伤机制50]。实验证实,Nrf2 / HO-1信号通路的激活增强多种抗氧化剂的表达和保护心肌细胞氧自由基造成的损害(51]。太阳等人发现激活的Nrf2途径防止ferroptosis在肝癌细胞(32]。Nrf2-ARE通路的激活从而导致肿瘤细胞的抗GPx4抑制,抑制这个途径逆转肿瘤细胞的抗ferroptosis [33]。Nrf2可能防止铁诱导损伤,而长期铁暴露导致铁积累,胞质活性氧的形成,并增加HO-1 mRNA表达,伴随着核易位Nrf2及其诱导靶蛋白NQO1 [52]。这个证据证实了假设Nrf2调节细胞内铁代谢通过Nrf2 / HO-1轴通路调节ferroptosis [48]。与先前的报道一致,目前的研究表明,在成骨细胞通过抑制Nrf2 / HG诱导ferroptosis HO-1信号通路,促进细胞内铁过载和脂质氧化T2DOP积累。

褪黑素是一种神经内分泌激素,主要由松果体分泌的、具有多种生理作用,包括生物节律的调节,改善睡眠质量,提高免疫力,发挥抗氧化应激、抗肿瘤、抗衰老的效果(21,53]。大量研究调查了褪黑激素和NRF通路之间的关系。邓等人表明褪黑素减少神经损伤通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路和扭转manganese-induced氧化损伤(41]。此外,通过Nrf2 / HO-1褪黑素皮质星形胶质细胞激活信号通路在脑出血的小鼠模型,以增加抗氯高铁血红素毒性和氧化应激(54]。在最近的研究中,褪黑素细胞内脂质ROS水平降低和增加GPx4活动通过Nrf2 / HO-1信号通路的激活、抑制引起ferroptosis HG的影响,从而增加造骨细胞和骨微结构的成骨能力在活的有机体内和在体外。NRF2击倒使用核抑制褪黑激素对成骨细胞活动的有益作用,进一步表明Nrf2信号通路中发挥了关键作用的干预褪黑激素的骨质疏松症。

褪黑激素是目前认为提高骨质密度和降低骨质疏松症的发病率(34,55,56];然而,褪黑激素的浓度用于治疗骨质疏松症仍然是有争议的。基于现有文献中,我们使用五褪黑激素浓度与积极的和消极的影响在活的有机体内和在体外:10到50毫克/公斤褪黑激素在活的有机体内测试和1、10和100μM褪黑激素在体外测试(34,57,58]。结果首次证明,褪黑激素抑制糖尿病骨质疏松症。与之前的报道,褪黑激素的影响不存在剂量依赖的相关性,高和低剂量改善骨微观结构和促进骨形成在活的有机体内和在体外。这些结果表明褪黑素可能适合T2DOP的治疗。

4所示。结论

总之,目前的研究结果为二型糖尿病的途径提供了第一个证据。虽然ferroptosis和Nrf2 / HO-1信号通路之间的关系已经被报道在各种疾病,这项研究提供了第一个结果证明HG通过增加活性氧诱导ferroptosis /脂质过氧化在T2DOP谷胱甘肽耗竭。重要的是,褪黑素显著降低ferroptosis和提高成骨细胞的成骨的能力通过Nrf2 / HO-1通路在活的有机体内和在体外。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。没有任何形式的好处或将收到一个商业方直接或间接地通过本文的作者。

作者的贡献

杨Maowei概念化和设计研究。张Hongdong马团长和执行研究和获得的数据。Hongdong妈,通过王、李和海地分析和解释数据。Hongdong马和小君太阳起草了手稿。Hongdong马和通过王同样有助于本研究。

确认

本研究中国国家自然科学基金项目的支持下,基金辽宁省教育部、辽宁省自然科学基金,和沈阳市科技基金(L2013301 81471094, 81170808, 2015020725, f12 - 277 - 1 - 47)。

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