安定及其消毒副产物促进斑马鱼胚胎神经系统的早期发展

文摘

广泛使用的安定,中枢神经系统抑制剂,发现无处不在在地表水和饮用水。此外,一系列副产品如2-methylamino-5-chlorobenzophenone (MACB)后生成氯消毒过程。然而,信息几乎没有对这些新兴的神经生物学效应在低剂量化学物质,特别是在婴儿和儿童。在这里,我们暴露了斑马鱼(鲐鱼类)胚胎安定和MACB为0.05,0.5,和5 nM,相当于环境水平。安定和MACB体节数增加,促进了神经发展的转基因斑马鱼(Tg (elavl3: EGFP)幼虫)在72小时postfertilization(高通滤波器)。安定和MACB也扰乱了体内平衡的腺苷酸,缬氨酸、蛋氨酸、反丁烯二酸在斑马鱼胚胎12高通滤波器。此外,斑马鱼的运动行为活动显著增强后120小时持续暴露于安定或MACB。此外,信使rna表达水平oct4,sox2,nanog调制多能性和自我更新,调节安定和MACB斑马鱼胚胎。总之,安定和MACB刺激发育神经发生和可能诱发神经会很低剂量。这些结果表明,精神药物的慢性接触可能造成潜在的威胁,神经系统的发展阶段。

1。介绍

饮用水污染制药和个人护理产品(PPCPs)带来了全球关注,因为它具有药理作用的效能甚至在低浓度(1- - - - - -3]。精神药物是一种PPCPs和在环境中无所不在地发现4,5]。安定(DZP)作为主要规定的精神药物,通常用于治疗焦虑障碍(6),陷入困境的全球约14%的人(7]。与广泛的应用程序或滥用8),大量的DZP被排泄和丢弃释放到环境中。因此,DZP废水中发现,地表水、饮用水和持续水平高达几百毫微克每升(9- - - - - -11]。

作为一种抗焦虑、镇静药物,DZP可以抑制中枢神经系统(CNS)的不同部分通过提高γ-氨基丁酸的突触后抑制类型(GABAA) [12]。然而,有人担心,该药物对胎儿发育造成不利影响由于其口服吸收快,生物利用度高、长半衰期,容易穿透血脑屏障和blood-fetal障碍(13]。Wistar鼠的后代提供神经行为毒性DZP产前接触不同剂量后,表现为早期生理发育和神经行为发育延迟14),尽管新生儿畸形证据当孕妇暴露于安定是矛盾的13]。新生的婴儿软盘综合症是有据可查的产前接触后安定在怀孕的最后三个月期间,新生儿的特点为张力减退,体温过低,嗜睡,呼吸窘迫,乳儿困难,降低自我调节,中枢神经系统压力迹象在第一产后一个月(15,16]。2016年的一项调查研究显示,产前暴露于苯二氮会导致严重损害新生儿的听觉和视觉认知17]。所有上述证据是基于剂量接触DZP规定。一些信息是可用DZP在低剂量的暴露的不利影响。DZP同一个家庭药物、去甲羟基安定发现改变行为和野生欧洲鲈鱼的摄食率(如丁)浓度中遇到effluent-influenced地表水(1),而野生斑马鱼暴露浓度的抗焦虑药物去甲羟基安定低至0.57μg / L显示减少同种的报警信息素反应(18]。大脑神经化学为野生型斑马鱼也改变了28天之后去甲羟基安定为0.57μg / L的水平,和5 -羟色胺营业额(比5-HIAA / 5)减少(19]。作为一个重要的饮用水来源,PPCPs可以转移到自来水,因为不是专门跟踪药物治疗技术。尤其担心这些药物可以产生一系列副产品氯化,比他们的前体(更严重的毒性作用20.- - - - - -22]。2-Methylamino-5-chlorobenzophenone (MACB)被确认为支配氯化后化学DZP氯化消毒过程(5,23在北京的自来水),无所不在地发现。尽管如此,几乎没有信息的发展和行为学的影响DZP和单克隆抗体在低剂量的暴露对新生儿和婴儿,虽然MACB预测更有可能积聚在神经系统和有毒/诱变比的前体药物基础上定量构效关系(24]。

这里,我们利用斑马鱼作为新生儿模型来确定潜在影响DZP和MACB环境浓度。我们表明,DZP MACB体节的斑马鱼胚胎数量增加10个小时后曝光。周边和中枢神经元量化在胚胎HuC-GFP线。增强神经元增殖验证了DZP——MACB-treated斑马鱼幼虫。此外,斑马鱼幼虫表现出持续接触DZP和MACB后多动。多能性调控的转录因子网络也调节对斑马鱼胚胎。这些发现支持这样的观点:精神药物在环境浓度的神经发育造成严重危险的阶段。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

DZP与 %是购自美国国立食品和药物控制(中国,北京)。MACB与 %在实验室合成。二甲亚砜(DMSO)是由Sigma-Aldrich ( 美国圣路易斯%)。DZP原液和MACB(10毫克/毫升)准备在DMSO和存储在-20°C。

2.2。斑马鱼和治疗

野生型(WT)和转基因(TG)线CZ160 (TG (elavl3: EGFP)]斑马鱼从中国购买了斑马鱼研究中心(武汉)在3个月大水生栖息地的再循环系统和维护(Apopka Pentair水生栖息地,FL)。神经元Elav-like (nElavl或神经胡)蛋白质是rna结合蛋白,这是早期神经元标记早期开发和维护是至关重要的成熟神经元的轴突内稳态(25,26]。在转基因HuC-GFP (Tg (elavl3: EGFP)], GFP表达在神经元(27]。HuC-GFP表达式可能发生在所有的神经过程,是重要的标志在大脑和脊髓的早期发展28]。水是维持在28.5°C, pH值为7.5,500∼780的电导率μ美国举行了斑马鱼的光周期14:10明暗,喂食了卤虫无节幼虫每天两次。

受精胚胎,成年斑马鱼分离与产卵盒2男1女过夜。隔板是移除在下次光周期的开始。然后,孵化结束在30分钟内,胚胎与胚胎中收集和清洗三次。随后,胚胎被选为暴露实验1小时postfertilization(高通滤波器)在6厘米高硼硅玻璃盘DZP和MACB。我们的研究表明DZP的浓度或MACB在饮用水(约0.05海里5]。斑马鱼胚胎( )暴露在MACB 0.05 nM, 0.5 nM, 5 nM和三个复制。车辆是0.01% DMSO组。实验期间,百分之五十的新兴市场再度保持最佳和相同浓度的测试材料。气候恒温孵化的胚胎孵化28°C(江南仪器有限公司,宁波,中国)。12个高通滤波器,60胚胎被送往检测腺苷酸,缬氨酸、蛋氨酸、反丁烯二酸。胚胎与乙腈提取,分析lcms - 8045(日本岛津公司公司(日本)。

2.3。发育评估

胚胎被认为在立体显微镜(UOP SZM76,中国),和照片拍摄 图像分辨率计算体节10点12和16个高通滤波器,分别。HuC关键部件的启动子驱动的表达绿色荧光蛋白(GFP)表达在神经元。DZP和MACB神经发展的影响评估在低浓度使用TG胚胎(TG (elavl3: EGFP)]。成年男性(或女性)WT与女性(或男性)TG在产卵盒分开过夜。TG幼虫收集72高通滤波器和使用激光共焦成像花期(TCS SP8、徕卡、德国)激发波长为425 nm和排放在600海里。HuC-GFP的长度测量准确。

2.4。运动行为分析

胚胎暴露于胚胎中不同DZP或MACB浓度1高通滤波器。斑马鱼(120高通滤波器)的行为评估使用光/暗周期。简单地说,在104高通滤波器,斑马鱼幼体在300年被加载到96孔板μL胚胎的媒体和允许适应一夜之间在28.5°C。120高通滤波器,斑马鱼被放入一个盒子跟踪系统,可以适应十分钟,就在他们受到交变10分钟循环一小时的黑暗与光明。幼虫在油井的速度每分钟计算为每个单独的幼虫( 幼虫)。

2.5。总RNA提取和定量实时PCR(存在)

为了调查是否oct4表达与孵化率高前50个高通滤波器,RT-qPCR被用来检测的基因表达oct4,sox2,nanog在斑马鱼胚胎。总共30胚胎(处理5 nM)或幼虫被收集在24日,48岁,分别和72高通滤波器。总RNA斑马鱼幼体使用试剂盒提取试剂(热费希尔科学,美国)根据制造商的指示。RNA样本的浓度来衡量Nano下降,和基因组DNA被RNase-free DNase。1μg的RNA样品被用来合成第一链cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、日本)。执行中存在使用SYBR绿色qPCR大师(美国BioRad)混合实时PCR系统(美国应用生物系统,罗氏生命科学)。在20μPCR反应系统的L, 1μ互补脱氧核糖核酸模板,0.8的Lμ0.8 L的底漆,μ反向引物,7.4的LμL (nuclease-free水和10μL SYBR绿色qPCR大师混合涨跌互现。PCR反应条件被设定为50°C 2分钟,3分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,60°C, 1分钟,2分钟72°C。相应的一对引物序列被NCBI(表设计1)。定量聚合酶链反应(qPCR)的表达水平进行评估oct4,sox2,nanog基因的实时PCR系统三次。

2.6。统计分析

Prism 7.0 (Graphpad棱镜软件,CA)是用于统计分析。进行了数据分析使用单向方差分析(方差分析)与图基的多重比较测试比较的意义。所有数据都显示为 ,和 被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在斑马鱼DZP MACB促进体节发展

确定的发展影响DZP MACB,我们暴露了斑马鱼胚胎这两种化学物质5 nM然后监控从1增长高通滤波器(小时postfertilization)实验结束。我们发现发展的体节是不同组间(图1(一))。DZP显著( )增加胚胎的数量从4到5段与DMSO-treated斑马鱼胚胎高通滤波器(图10点1 (b))。体节增加到7在斑马鱼DMSO-treated 12高通滤波器。DZP MACB进一步加速了胚胎段发展在这个阶段。然而,没有观察到的差异在16个胚胎体节的高通滤波器组(图1 (b))。因此,斑马鱼是敏感DZP和MACB体节发展初期的阶段。

3.2。评估对神经发育的影响

体节的组织基础节段神经组织(29日),我们进一步确定神经DZP和MACB GFP标记神经rna结合蛋白HuC斑马鱼胚胎。胚胎孵化DZP或MACB解决神经发育期间从1高通滤波器72高通滤波器(图2(一个))[30.,31日]。HuC-GFP的表达水平是衡量身体的长度与绿色荧光72高通滤波器(图2 (b))。DZP显著( )促进神经元增殖在0.5和5纳米(图2 (c))。神经系统对MACB更敏感,身体长度显著增加为0.05 nM曝光。这些结果表明,DZP MACB可以加快神经发育过程在低浓度。

3.3。幼虫的运动行为

以前的研究已经表明DZP和MACB饮用水污染程度干扰幼鱼的神经发育;我们进一步探讨DZP的行为效果和MACB幼虫鱼使用暗光测试(32,33]。幼虫的眼睛可以检测光信号,判断(34]。例如,幼虫运动时高黑暗和低光暴露暗光周期(35]。幼虫的运动距离接受DZP和MACB提出了在暗光周期(数字3(一个)和3 (c))。我们的研究结果表明,DZP MACB治疗显著兴奋活动水平的幼虫光(数字3 (b)和3 (d)),MACB在运动神经元的兴奋性影响是显而易见的(图3 (c))。没有行为差异在所有团体在黑暗时期(数字3 (e)和3 (f))。因此,DZP MACB刺激多动症对斑马鱼幼体环境剂量。

3.4。的营养水平的胚胎

进一步研究DZP的影响和MACB neurometabolic,我们分析了胚胎内源性物质的胚胎处理DZP或MACB 5海里。斑马鱼胚胎是完全依赖于他们自己的营养在卵黄囊保持增长和发展36]。结果表明,MACB腺苷酸水平增加(AMP)(图4(一)),生成环腺3 ,5 - - - - - -一磷酸(营)。营地是一个重要的信号分子提高轴突再生(37]。缬氨酸促进细胞致敏(38),由DZP表达下调,MACB(图4 (b))。此外,蛋氨酸的水平也下降了DZP和MACB(图4 (c))。缬氨酸和蛋氨酸可能影响脑源性神经营养因子(BDNF)的活动(39]。此外,反丁烯二酸在多发性硬化症(MS)治疗神经保护作用[40]。反丁烯二酸的代谢是中断(图4 (d)),这表明神经发育障碍DZP——MACB-treated斑马鱼胚胎。这些结果表明DZP和MACB可能会扰乱神经代谢低剂量。

3.5。检测基因表达有关oct4,sox2,Nanog

探讨分子机制调节增殖和分化,我们分析了transcription-related因素的表达在10高通滤波器斑马鱼胚胎。Octamer-binding转录因子4 (oct4性别决定地区),SRY (Y)框2 (sox2),同源框的蛋白质nanog调节胚胎干细胞的分化成特定的细胞。我们的研究结果表明,DZP和MACB调节表达的水平oct4和sox2在5纳米(数字5(一个)和5 (b))。这种趋势符合加速体节增长12高通滤波器和增强运动能力在120高通滤波器。此外,比DZP MACB的风险更高,因为MACB也表达水平的调节nanog(图5 (c))。因此,DZP和MACB促进了神经系统的早期发展中斑马鱼胚胎通过增加多能性和自我更新率(图5 (d))。

4所示。讨论

制药污染饮用水中对人体健康构成风险已引起了极大关注。一组不同的接触化学物质已被证明在低浓度影响婴儿神经发育由于血脑屏障(BBB)[不成熟的发展30.,41]。在我们之前的研究中,我们发现广泛应用DZP已经被污染的饮用水和MACB消毒副产物生成。因此,我们进一步研究了他们在斑马鱼神经毒理学和代谢的影响。我们证明DZP MACB体节的数量增加和神经元调节多能性和自我更新转录因子的表达,促进神经系统的早期发展中斑马鱼胚胎。

体节的总数中形成somitogenesis紧密固定在一个给定的物种。体节是源自于近轴中胚层和位于两侧的神经管。Somitogenesis是至关重要的发展重要性和控制外围脊神经,分化的椎骨,骨骼肌(42]。它表明DZP和MACB微量污染物的剂量会影响胚胎早期发育。的迅速出现somitogenesis DZP——或者MACB-treated集团表明神经抑制剂可以加速早期发展在低浓度(nM),这是类似于抗抑郁药文拉法辛的影响(10 ng)刺激神经发生在斑马鱼胚胎43]。幼虫行为表型观察响应周期的暗光可以评估游泳行为在这些早期阶段。虽然行为测试相对比较简单,它可用于屏幕早期神经功能障碍引起的外源性化合物(44]。DZP MACB治疗显著增加幼虫的活性在黑暗中而不是光,这可能与增加主要在斑马鱼神经发生。因此,DZP和MACB neuroexcitatory效果和刺激幼鱼的自发运动在低剂量。

AMP促进营水平提高轴突再生(37),这就解释了为什么DZP和MACB加速斑马鱼运动。此外,AMP严格控制活化蛋白激酶(AMPK)的活动,保持能量代谢体内平衡和调节生长和扩散通过营养信号(45]。AMP的增加可能会损害蛋白质平衡和减少的水平缬氨酸和蛋氨酸46]。此外,反丁烯二酸可以清洁过程中活性氧保护神经元和神经胶质细胞炎症40]。DZP MACB反丁烯二酸的援助的水平下降,隐含在早期胚胎发生炎症。因此,DZP和MACB可能干扰能量平衡和蛋白质体内平衡。

许多转录因子可以调节胚胎干细胞的分化成特定的细胞。的oct4POU-domain转录因子家族的成员,在胚胎干细胞多能性和自我更新所需(ES)在胚胎发展。的sox2是一种转录因子,是至关重要的维持自我更新或未分化的胚胎干细胞多能性,包括神经干细胞。同源框蛋白nanogESCs是一个转录因子,帮助维持多能性通过抑制细胞测定的因素。DZP MACB促进的表达水平oct4和sox2加速斑马鱼胚胎的早期神经发育(47,48]。此外,MACB调节的表达oct4和nanog。在以前的研究中,抗精神病锂增强oct4和nanog促进重组表达取决于GSK3主要目标β(49]。因此,MACB增强增殖和分化的体细胞可能取决于GABAA受体或其他目标。gaba ergic神经元对海马和皮层的早期发展至关重要50]。先前的研究表明,DZP可能下调gaba ergic突触调制神经行为的区分²⁺动力学(51]。此外,细胞内钙动员需要调节发展和组织模式在斑马鱼胚胎52]。因此,有可能通过调节细胞内钙MACB加速发展中胚胎。

5。结论

总之,DZP MACB加快了发展胚胎体节的转录因子和神经元通过上调饮用水污染水平。与此同时,DZP和MACB促进能量代谢,导致兴奋的行为。我们的研究结果强调,精神病药物在低剂量刺激神经起源。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

党委赵,黄小勇,朱亏,Bing邵设计研究。赵党委和小勇黄进行了研究。Jiachen史和(贾提供新的分析工具。党委赵,黄小勇,朱亏,Bing邵分析和写论文。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(21677019),资本基础医学研究和开发(2018-1-302),和北京博士后研究的基础。

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