麦冬皂苷D通过促进CYP2J3上调增加SERCA2a与受磷蛋白的相互作用

抽象的

麦冬皂苷D (OPD)是一种中草药麦冬皂苷的化合物，据报道，OPD可诱导细胞色素P450 2J3 (CYP2J3)/环氧二十碳三烯酸(EETs)和钙的水平升高^2＋在大鼠心肌细胞。小是关于CYP2J3和Ca之间的具体机制知^2＋在这里，我们研究了CYP2J3是否通过激活Ca参与OPD对心肌的保护作用^2＋H9c2大鼠心肌母细胞内稳态相关蛋白复合物（SERCA2a和PLB）。利用荧光共振能量转移法测定了SERCA2a与PLB之间的相互作用。OPD可减轻心力衰竭，并催化钙的主动转运^2＋通过诱导PLB磷酸化和促进SERCA2a活性进入肌浆网。在心衰模型中，CYP2J3基因敲除后，这些OPD对心衰的有益作用被消除。总之，我们的研究结果确定了CYP2J3是OPD的关键胞内靶点，并揭示了CYP2J3依赖的胞内Ca调控机制^2＋．

1.介绍

细胞色素P450 2J3 (CYP2J3)是酶的细胞色素P450超家族成员之一，催化许多涉及药物和其他外源性药物代谢的反应。它们在心肌中高表达，并参与花生四烯酸(AA)的代谢。AA的代谢物是环氧二十碳三烯酸(EETs)，据报道有抗心律失常[1]，抗炎[2],凋亡[3.和抗氧化剂[4的作用，以及心血管保护的作用[5]．具体来说，EETs可以维持Ca^2＋通过上调肌浆网钙的表达，改善大鼠心肌细胞内稳态，缓解心衰症状^2＋- atp酶(SERCA)和受磷蛋白(PLB)。此外，据报道，CYP2J3过表达和eet水平升高通过维持肌浆网Ca降低心衰(HF)大鼠内质网应激信号和内质网应激介导的细胞凋亡^2＋- atp酶(SERCA2a)活性和细胞内Ca^2＋体内平衡(6]．

研究表明，SERCA2a活性和表达的降低是实验动物模型和患者HF的标志[7，8]．SERCA2a调节Ca^2＋再摄取到肌浆网(SR)和钙失调^2＋内稳态是心衰的起始事件[9]．此外，SERCA2a的活性可以被位于SR中一个名为受磷蛋白(PLB)的小固有蛋白调控。在去磷酸化状态下，PLB抑制SERCA2a活性和SR Ca^2＋交通工具。通过camp依赖的蛋白激酶(PKA)在Ser位点磷酸化PLB¹⁶残基或钙^2＋-钙调素依赖性蛋白激酶(CaMKII)¹⁷残余物缓解抑制Serca2a活性，从而增加了SR CA的速率^2＋摄取[10]．因此，SERCA2a-PLB Ca^2＋-调节系统与心血管疾病有关[11，12]．行业和学术研究人员广泛寻求Serca2a和PLB之间的调节互动的亲和力。例如，荧光共振能量转移（FRET）已被用于直接检测供体标记的SERCA2a与受体标记的PLB或受体标记的SERCA2A的相互作用，其中包含供体标记的PLB在膜中[12- - - - - -14]．我们之前的研究表明，从麦冬中分离的甾体苷opopogonin D (opopogonin D, opopogonin D, opopogonin D)可以通过上调CYP2J3/EET系统诱导SERCA2a的表达[12]然而，CYP2J3对OPD对Ca影响的相对贡献^2＋SERCA和PLB之间的内稳态和相互作用尚未被研究。CYP2J3是否参与调控SERCA2a与PLB之间的相互作用尚不清楚。

本文报道了从麦冬根中提取的一种CYP2J3激动剂。我们的研究结果表明，OPD通过诱导CYP2J3的表达，进而促进SERCA2a和PLB之间的相互作用，从而实现抗hf作用，这有助于维持Ca^2＋体内平衡。

2.材料和方法

２.１.抗体和试剂

OPD(高效液相色谱纯度:98%)和isoproterenol·HCl (ISO)分别购自美国国家药品和生物制品控制研究所(北京)和Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO，美国)。TransScript™First-Step RT-PCR SuperMixFast和SYBR®Green Master Mix购自TransGen Biotech Co.， Ltd.(北京，中国)。抗GAPDH和磷酸化PLB (p-PLB)的抗体(Ser¹⁶/苏氨酸¹⁷)来自Cell Signaling Technology Inc. (CST, Danvers, MA, USA)。抗CaMKII、p-CaMKII、p-T197-PKA、PKA、p-PLB (p-Ser¹⁶)， SERCA2-ATPase来自Abcam (Cambridge, UK)。抗p-PLB抗体(p-Thr1⁷)来自禅宗生物科学(中国成都)[15]，抗CYP2J3的抗体来源于Bioss (Boston, MA, USA)。万能磁性Co-IP试剂盒来自Active Motif, Inc. (Carlsbad, CA, USA)。正常兔IgG来自Cell Signaling Technology。俄勒冈绿色488 BAPTA购自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)。p-CMV-N-CFP-PLB、p-CMV-N-YFP-SERCA2a和pLVX-IRES-ZsGreen-1-CYP2J3来自Biomed(中国北京)。CaMKII (KN-93)和PKA (H-89)的特异性抑制剂购自Selleck Chemicals (Houston, TX, USA)。Helicid来自TargetMol(中国上海)。所有其他试剂均从商业供应商购买，除非另有说明。

２.２.细胞培养与处理

H9C2细胞，从美国型文化收集（Manassas，VA，USA）获得了源自胚胎BD1x大鼠心脏组织的原始克隆细胞系的亚克隆。将细胞在Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）中培养，其补充有10％胎牛血清（FBS）和青霉素 - 链霉素（100IU / ml），其在95％空气的潮湿气氛和5％CO₂在37°C。每个实验将细胞接种在96或6细胞培养皿中，并在含5% CO的湿润培养箱中培养₂．ISO溶于蒸馏水。将OPD、Helicid、H-89和KN-93溶于二甲基亚砜中，用DMEM稀释。

2．3.细胞生存能力分析

采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测细胞活力。简单地说，细胞以96孔的密度播种在板上 每井100毫升完全培养基。用不同浓度的OPD (1-80μmol/L），将细胞进一步在含有0.5%CCK-8的培养基中培养0.5-4小时 H450的吸光度 用微孔板阅读器测量nm。

2.4.无ER钙的测量^2＋

用不同浓度的OPD (0.25, 0.5, 1μmol/L)μmol / L)。24小时后，埃尔卡^2＋根据供应商的说明，使用GENMED Scientific Inc. (Arlington, VA, USA)的magu - fluo -4/AM试剂盒测量浓度，如前所述[16，17]．用1ml的5μmol/L magu - fluo -4/AM, 37°C, 30分钟，以优化装入急诊室。用D-Hank的溶液清洗细胞三次，以去除探针。相对ER Ca^2＋表示为对照的百分比。

2.5.钙的测量^2＋腺苷三磷酸酶活性

如前所述，用OPD和ISO处理H9c2细胞。用微孔板法检测SR中SERCA2a的酶活性。如前所述，获得SERCA2a囊泡用于测定其活性[18]，通过超微ATP酶分析试剂盒（中国建成）使用无机磷比色法检测。简而言之，该试验包括基于ATP分解为ADP和无机磷酸盐（Pi）理论的酶和磷反应atp酶的活性通过每mg组织或每h细胞蛋白中Pi的量和atp酶分解Pi的量来测定(μmol-Pi/mg-prot/h）被视为ATP酶活性的一个单位。最大SERCA2a活性值直接取自实验数据，并根据总蛋白浓度（mmol/g-protein/min）进行标准化。这些数据通过计算机软件（GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行非线性回归分析。

2.6。RNA分离和定量PCR

经上述相应药物处理后，提取总RNA。如前所述，用定量PCR (qPCR)对特异性mrna的表达进行定量。简单地说，用Trizol试剂从H9c2细胞中制备总RNA。使用DU-600紫外分光光度计(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)测定RNA完整性和浓度。所有OD260/OD280在1.8 ~ 2.0之间的RNA样本进行qPCR。用转录子第一链cDNA Synthesis Kit逆转录总RNA，获得cDNA。根据所提供的说明，使用ABI Prism 7500 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)，使用Trans Script™SYBR®Green Master Mix Kit进行qPCR。以GAPDH为内控，对每个靶基因进行定量。引物序列如表所示1．

2.7。免疫印迹分析

使用BCA蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚酰酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质，并使用标准方案进行印迹[19]．用密度法定量表达，并与GAPDH表达归一化。然后，所有组都归一化到各自的对照组。

2.8。CoimMunoprecipition测定

采用共免疫沉淀(co-IP)方法检测SERCA2a和p-PLB/PLB之间的物理关联。根据制造商的协议，使用万能磁co-IP试剂盒(Active Motif)进行co-IP检测。简单地说，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/抑制剂溶液处理H9c2细胞，通过简单的离心收集并在裂解缓冲液中裂解。以SERCA2a抗体(CST)或IgG作为对照，免疫沉淀蛋白复合物。免疫沉淀在4°C过夜。复合物与蛋白G磁珠在4°C旋转器上孵育1小时。树脂用500洗涤四次μL完整的co-IP/洗涤缓冲液。SDS-PAGE(10%凝胶)检测，PLB/p-PLB抗体检测。

2.9。免疫荧光Colocalization

检测SERCA2a和PLB/p-PLB蛋白在iso诱导HF中的共定位。H9c2细胞在含10%胎牛血清和青霉素链霉素(100 IU/mL)的DMEM中培养，95%空气和5% CO的湿化气氛中培养₂在37°C下，每个实验将细胞接种在激光共聚焦小盘上，并在含有5%CO的37°C加湿培养箱中生长₂．药物处理24 h后，取出细胞培养液，用1× PBS冲洗细胞。细胞在100%冰冷的甲醇中室温固定10-15分钟，干燥15分钟。然后，用1× PBS/IFA洗涤2次，5分钟，用0.3% Triton-X 100在1× PBS/IFA中渗透10分钟，再用0.03% Triton-X 100洗涤2次，5分钟。用5% BSA和1× PBS/IFA阻断细胞1 h。然后，用合适的一抗(rabbit-SERCA2a, mouse-PLB, rabbit-p-PLB;稀释1:1000)在4°C过夜。洗涤后，用相应的二抗(fitc标记的山羊抗小鼠IgG和rbitc标记的山羊抗兔IgG)孵育细胞，1:50 0再稀释1小时。46-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)以1:20 00的稀释度在黑暗中加入细胞1小时。然后，细胞用0.03% Triton-X 100洗涤6次，5分钟，用延长®Gold抗褪色试剂密封。切片用LSM800共聚焦激光扫描显微镜检查。采用了浸油方案Neofluar 60/0.75目标。利用488和543 nm波长的氩氪激光激发成像绿色和红色通道的双荧光。在TIFF格式中获取图像并进行共定位分析。采用ImageJ Pro Plus软件进行定量分析。

2.10。H9c2细胞培养与小干扰RNA转染

H9c2细胞的接种密度为 /有6口井的盘子。在镀后12小时，细胞与80 nmol/L CYP2J3小干扰RNA (siRNA)和对照siRNA在1ml Opti-MEM培养基中孵育6小时，如前所述。6 h后，加入新的无血清DMEM，加入OPD和ISO。细胞再孵育24或48小时进行不同的实验。

2.11. 小分子激酶抑制与代谢靶点

H-89和KN-93μmol / L;Selleck)、PKA和CaMKII特异性抑制剂对PKA/Ser进行了研究¹⁶拉钮,CaMKII /刺¹⁷-PLB信号通路介导了OPD的作用。用上述含h -89和KN-93的培养基处理细胞6 h，最后在含ISO (1μmol/L)， OPD浓度最高(1μmol / L)。

2.12.分子生物学和HEK293T细胞培养

大鼠PLB融合到青色荧光蛋白(CFP)的c端，大鼠SERCA2a融合到增强型黄色荧光蛋白(YFP)的c端。用Qiagen公司的质粒提取试剂盒(plasmid DNA Maxiprep Kit;日耳曼敦,医学博士,美国)。HEK293T细胞在聚赖氨酸包覆的培养皿中培养。培养皿中填充含有10%热灭活FBS的完整DMEM培养基。细胞密度达到10%后，按照厂家说明书进行转染。HEK293T与质粒共孵育6 h，用MEM培养基代替完全DMEM培养基。在FRET实验中，将CFP-PLB质粒和YFP-SERCA2a质粒共转染HEK293T细胞，浓度为500 ng/μl

2.13。质粒检测和时间分辨FRET成像

按照上述步骤将质粒转染HEK293T细胞。两种重组质粒的DNA测序结果正确，可用于下游实验。为了验证CFP-PLB质粒和YFP-SERCA2a PLB在HEK293T细胞中的转染效果，转染24小时后，将细胞裂解，电泳分解细胞裂解液中的蛋白，然后进行western blot分析(见章节)2．7）．将混合物与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗(1:20 00)在室温下孵育1小时，并使用ImageQuant LAS 500 (Healthcare Bio-Sciences AB，乌普萨拉，瑞典)进行可视化。荧光成像采用倒置显微镜，配备Plan-Apochromat 100×/1.40 Oil DIC M27物镜。对于表面荧光成像，通过装有427/10 nm (CFP)和504/12 nm (YFP)窄带滤光片和多波段二色镜的激励滤光轮引入照明。发射是用背薄的电子倍增电荷耦合器设备相机(LSM 880;AxioObeserver, Zeiss, Oberkochen，德国)通过排放过滤轮，472/30 nm (CFP)和542/27 nm (YFP)。“无棱镜”全内反射荧光(TIRF)采用458 nm Ar激光线，通过多波段二向色镜直接穿过物镜。TIRF发射是用上述滤波器选择的。为了实现空间分辨、受体选择性光漂白，采用激光线滤光片将514 nm激光线定向到样品上。使用由两个平凸透镜组成的开普勒望远镜，漂白光束聚焦到标本上的一个点。 Laser photobleaching exposure time was controlled by a Uniblitz shutter and was typically for 54.55 s with 20 frames. The above activity was measured using software (ZEN). Image records from multiple experiments were averaged together to reduce error. Analysis of the evolution of the line-out profiles was performed by fitting image data with a custom analysis program written in Graphpad Software.

2.14。统计分析

所有数据表示为 (SD)。组间比较采用单因素方差分析。 被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．OPD对H9c2细胞活力的影响

用不同浓度的OPD（1-80）处理细胞 μ摩尔/升），和H9c2细胞的生存力通过CCK-8实验检测。细胞活力与OPD孵育后明显下降。结果表明，响应刺激由OPD对细胞活力分别为浓度依赖性的。高浓度的OPD对细胞活力明显的抑制作用。为了研究OPD的对心肌细胞的0.25，0.5和1的影响，OPD浓度 μmol/L用于后续实验(图1）．

３.２．OPD激活H9c2细胞和HEK293T细胞中CYP2J3的表达

为了确定OPD对心肌细胞中CYP2J3蛋白表达的影响，我们进行了免疫印迹分析和QPCR。opd定性地诱导了预期的CYP2J3 mRNA和蛋白质表达（图2（a）），按照先前的结果[16，20.]．接下来，我们使用代表心力衰竭状态的iso诱导细胞模型来确定OPD对CYP2J3的影响。制备H9c2细胞裂解物，用于检测CYP2J3免疫反应蛋白;用GAPDH表示蛋白载量。从图2（b）， OPD和ISO共处理各浓度CYP2J3 mRNA和蛋白表达均增加。ISO是一个β- 肾上腺素能受体激动剂，其在体外和体内诱导HF [21]。在ISO诱导的HF组中，CYP2J3的表达降低。数据表明，将CYP2J3 siRNA转染到H9c2细胞，抑制CYP2J3的表达，消除了ISO对CYP2J3降解的抑制作用，说明了OPD的作用（图2（c）和2（d）)pLVX-IRES-ZsGreen-1-CYP2J3质粒转染HEK293T细胞24小时 h、 用OPD处理细胞24小时 H通过激光共焦聚焦检测CYP2J3的荧光强度（图2 (e))与CYP2J3组相比，OPD治疗组的荧光强度显著增加。

３．３．OPD通过CYP2J3在ER诱导SERCA2a和p-PLB共定位

为了确定使用共焦显微镜的SERCA2a是否共定位与PLB /对PLB，在H9c2细胞三种蛋白通过免疫荧光检查的共定位。结果表明的SERCA2a和PLB /对PLB之间的一些共定位到不同的程度。的SERCA2a和对PLB（图之间OPD诱导共定位3 (b))，而在OPD处理后H9c2细胞中SERCA2a和PLB蛋白共定位降低(图3（a））．进行CYP2J3的siRNA的转染测试CYP2J3功能中的SERCA2a / PLB和的SERCA2a /对PLB的共定位。CYP2J3 siRNA的转染后，H9c2细胞用OPD和ISO处理如上所述以确定OPD的在HF细胞的诱导（图4(一)和4 (b)）．图像显示H9c2细胞中SERCA2a(绿色)和p-PLB(红色)蛋白的免疫荧光以及OPD后它们共定位模式的变化(1μmol/L)μmol/L)，如上所述。嵌入的散斑图根据共定位估计每个检测到的抗原的数量。黄色的同域像素位于散点图的对角线上。与NC组相比，si-CYP2J3组红色(p-PLB)强度降低。与opd治疗NC组相比，si-CYP2J3组p-PLB强度增加。

3.4.OPD通过CYP2J3增加SERCA2a和p-PLB之间的物理联系

为了评价OPD对p-PLB与SERCA2a相互作用的影响，我们用OPD和ISO处理H9c2细胞。提取细胞总蛋白。用蛋白G琼脂糖珠预清后，细胞裂解液用或不用抗serca2a抗体孵育，然后用蛋白G琼脂糖珠孵育。用抗p-PLB和PLB的抗体对共ip蛋白复合物进行洗脱和western blotting分析。p-PLB和PLB可见共同ip谱带(图5(一个))所用抗体在westernblot分析中可检测到衣壳蛋白。co-IP分析表明内源性SERCA2a蛋白以OPD依赖的方式与p-PLB特异性共IP（图5(一个)）．为了确认CYP2J3在Serca2a和P plb / Plb蛋白之间的相互作用中的调节功能，用CyP2J3 Si-RNA转染H9C2细胞24小时，重复免疫沉淀。最初用抗筛选的抗体探测膜，然后用抗免疫沉淀蛋白的抗体探测。结果表明CYP2J3的抑制减轻了Serca2a和P plb之间的物理结合（图5（b））．此外，OPD可能诱导CYP2J3的表达，促进SERCA2a与p-PLB的相互作用。

3．5．OPD增加Ca^2＋- atp酶活性和Ca^2＋补充ISO 24 H后ER的摄取情况

ISO支持的Ca^2＋ER的摄入量明显低于对照组。此外，与iso治疗组相比，OPD支持Ca^2＋摄取要高得多(图6 (b)和6 (c)）．其次，探讨了OPD对Ca的可能作用^2＋腺苷三磷酸酶。Ca的活性^2＋- atp酶在iso处理的HF细胞中较未处理的心肌细胞弱。重要的是，治疗与OPD明显改善钙的活性^2＋- atp酶的剂量依赖性(图6（a））．

3.6。OPD激活HF细胞中的PLB磷酸化

验证OPD是否转录调节CA涉及的蛋白质的表达^2＋我们通过qPCR检测SERCA2a和PLB亚基编码mRNA的稳态水平。正如已经在蛋白水平上观察到的，与对照组相比，opd处理组的SERCA2a和PLB mRNA表达增加(图)7）．PLB的磷酸化状态可以消除PLB对SERCA2a的抑制作用，导致SR-Ca升高^2＋增强心肌细胞的收缩和舒张性(Ca^2＋和兴奋收缩耦合在心脏中）。我们实际测量了与蛋白质的磷酸化形式更明显增加的总PLB的显着降低，导致P-PLB / PLB比率显着增加。与此发现一致，更高效的细胞内Ca^2＋在H9c2细胞中观察到动态变化。值得注意的是，与iso诱导的细胞相比，opd处理的细胞表现出明显更高的p-PLB/PLB比值(图)8(一个))和angii诱导(图8 (b))心力衰竭心肌细胞。

3.7。抑制PKA和CaMKII级联并不能消除OPD对PLB磷酸化的影响

我们已经知道，PLB在Ser位点被PKA磷酸化¹⁶残基或CaMKII¹⁷残渣(22]．为了研究OPD激活这两个激酶通路是否导致plb介导的SERCA2a的磷酸化调控，我们使用PKA和CaMKII通路的化学调节剂，如H-89 (PKA抑制剂)和KN-93(CaMKII抑制剂)进行了一系列实验。结果表明，丝氨酸磷酸化之间存在明显的分离¹⁶和刺¹⁷分别经AngII和ISO处理后的PLB残留量。H-89 (PKA抑制剂)选择性诱导Ser降低¹⁶血管紧张素Ⅱ和OPD共处理（图中的磷酸化9（a））．也就是说，OPD参与PLB-Ser的磷酸化¹⁶通过血管紧张素Ⅱ诱导PKA级联。作为结果，我们研究了PKA和对PKA的后血管紧张素Ⅱ和OPD共处理的表达。我们发现，OPD诱导PKA级联的血管紧张素Ⅱ治疗的HF细胞活化（图9 (c)）．有趣的是，CaMKII似乎在血管内皮素诱导的HF细胞模型中没有被激活(图)9 (c)）．在ISO处理中，KN-93 (CaMKII)选择性诱导Thr降低¹⁷OPD应用后磷酸化(图9（b））．OPD选择性诱导PLB-Thr磷酸化¹⁷通过ISO处理H9c2细胞中的CaMKII途径。OPD诱导ISO处理HF细胞中磷酸化CaMKII的表达（图9 (d))，表明两个位点的磷酸化都有潜在的选择性机制。这一点在后续的实验中得到了进一步的探讨。

3.8.表达SERCA2a和PLB的HEK293T细胞的FRET分析

为了优化HEK293T细胞的瞬时转染条件，用YFP-SERCA2a和CFP-PLB感染细胞(图)10 ()）24小时。通过电泳萃取总细胞蛋白，通过电泳分解，并在进行Western印迹分析之前转移到硝酸纤维素膜，以确定PLB和Serca2a的表达用作加载对照。结果表明，Serca2a（170kDa），PLB（35kDa）和GAPDH（25kDa）的预期带尺寸，其指示了合适的转染条件（图10 (b)）．当两个荧光探针靠近(<100 Å)时，它们会发生FRET [23，24]．通过选择性光博在YFP的选择性光博中检测到YFP-SERCA2A和CFP-PLB之间的褶皱。在短暂的YFP暴露于514nm激光照射的聚焦点后，CFP荧光在局部增加（图10 (c)箭头)。CFP-SERCA荧光强度(漂白剂后/预漂白剂)表明，约18%的CFP-SERCA荧光增加仅限于靶位点(图)10 (c)）．受体光漂白后给体增强是FRET的诊断方法[25]．OPD预处理6 h后，观察到YFP-SERCA2a与CFP-PLB之间的FRET变化(图)10 (d)，箭头）。在YFP光漂白后，CFP的强度没有显著变化（图10 (d)）．这可能是由于OPD阻断了PLB的未磷酸化状态。

3.9.OPD诱导孕烷X受体核易位

众所周知，妊娠X受体(PXR)是一个“主调节器”或“异种传感器”的代谢和清除各种内源性和外源性化合物[26]．当配体(处方药、草药补充剂、维生素和其他内生菌)与PXR结合时[22，靶基因通过转录诱导上调。CYP3A4是PXR最重要和研究最深入的靶基因，是至关重要的药物/外源性酶，代谢约50%的所有药物和外源性药物[27]．此外，PXR还调节其他几种重要的药物/外源性代谢酶的表达，如CYP2C9、CYP2B6、CYP2C19、CYP3A5 [22]．与CYP2亚家族的其他亚型(如CYP2C、2D和2E)相比，CYP2J的调控相对不足。此外，CYP2J3的转录调控因子仍不明确。我们之前的研究表明，OPD以浓度依赖的方式促进PXR从细胞质转位到细胞核(图)(11日)）．为了确定PXR对CYP2J3的调控作用，将PXR- sirna转染H9c2细胞后，CYP2J3的表达降低(图)11 (b)）．此外，在Helicid (PXR特异性抑制剂)处理后，OPD逆转了PXR表达的下降(图)11 (c)）．在iso诱导的HF H9c2细胞中转染si-PXR后，CYP2J3的表达降低，OPD可以逆转这种下降(图)11 (d)）．

4.讨论和结论

OPD是一种从麦冬中分离出来的甾体甙，近年来因其在不同心血管疾病中的抗炎和抗氧化作用而日益引起人们的关注[28- - - - - -30.]．我们前期研究首次报道OPD可诱导CYP2J3和CYP2J2表达。具体而言，OPD显著降低了细胞内Ca^2＋通过上调大鼠心肌细胞CYP2J3/EETs的水平来缓解心肌超负荷。此外，OPD促进Ca^2＋通过调节钙来维持体内平衡^2＋处理蛋白质，包括SERCA2a和PLB[29]．本实验室上述研究首次报道OPD可有效诱导CYP2J并影响钙调素的表达。但OPD是否能直接影响SERCA2a与PLB的相互作用，CYP2J3是否参与调节SERCA2a与PLB的相互作用，尚无深入研究。本研究是对上述工作的进一步研究。首次证实OPD可直接增强SERCA与磷酸化PLB之间的相互作用。我们之前的两项体内研究通过缺血再灌注模型和心肌肥厚动物模型验证了OPD的心血管保护作用[20.]．在本研究中，我们报道了体外OPD通过CYP2J3诱导SERCA2a和PLB相互作用，从而发挥其抗hf作用，证实了CYP2J3是OPD的直接胞内靶点，为OPD的作用机制提供了重要的见解。原代心肌细胞是来自心肌组织的细胞，与心肌组织最接近。在进一步的研究中，我们将验证OPD对小鼠心衰的影响，如TCA心衰模型或原代心肌细胞。本实验室前期实验结果表明，OPD (0.1μmol / L ~ 80μmol/L)对细胞无明显毒性作用( ）．OP-D(0.1~200)处理不同时间和浓度的细胞μmol/L)， MTT法检测HUVECs的活力，结果表明高浓度(80μmol/L)对细胞活力有明显抑制作用(>85%)[20.]．同样，在本实验中，OPD对H9c2细胞没有明显的毒性作用。

另外，OPD以Ca为靶标^2＋内稳态。本研究结果显示，PLB的减少可以恢复衰竭心肌细胞的频率响应[31，32].细胞内钙^2＋SR处理系统在维持正常的心脏泵血活动中起重要作用[31，32]．PLB被认为是正常心功能的重要调节剂[34]．在这项研究中，我们证明在两种HF细胞模型中，OPD与PLB下调和p-PLB和SERCA2a上调有关(图)8(一个)和8 (b)）．PLB和SERCA2a的表达可能与Ca的大小有关^2＋在SR中储存，并最终影响细胞内钙^2＋释放和心脏收缩力。PLB的上调可能通过提高舒张期Ca而对心脏性能有害^2＋归因于SERCA2a的抑制。心脏兴奋-收缩偶联的中央调节器是PKA和CaMKII。一个有趣的现象表明，OPD通过增加PKA活性促进Ser16而不是Thr17处PLB的磷酸化，在AngII诱导的HF细胞模型中，而在ISO诱导的HF细胞模型中，OPD对CaMKII没有影响，OPD通过增加CaMKII活性促进Thr17而非Ser16处PLB的磷酸化，对PKA无影响。同时，使用一系列抑制剂证实了这一现象（图9）．研究揭示CaMKII可以被Met281/282的氧化和Thr287的磷酸化激活[34]．我们的结果表明，在iso诱导的HF细胞模型中，OPD激活CaMKII的磷酸化。CaMKII被ISO磷酸化，OPD影响磷酸化状态。相比之下，ox-CaMKII变化很小。氧化性CaMKII被AngII激活，而OPD释放氧化(图)12)有趣的是，磷酸化CaMKII没有明显变化（图9）．既往研究表明，OPD可以清除ROS，保护内皮细胞免受H₂O₂-诱导的氧化应激[29]．OPD可能减轻血管内皮素介导的氧化负担，从而降低ox-CaMKII的表达。在心脏，CaMKII的自磷酸化在β肾上腺素的信号(32，33]．HF和许多疾病都与显著的氧化应激有关。据报道，ROS可导致体外蛋氨酸残基的动态PTM，这表明AngII和内皮素-1 (ET-1)通过主要的氧化依赖途径激活CaMKII [34]．其潜在机制可能与iso诱导有关β-肾上腺素能信号和血管内皮素诱导的主要氧化依赖途径[35]．我们在两个HF细胞模型中检测了CaMKII的氧化和磷酸化表达(图)11）．这是第一次发现和确认OPD在不同因素诱导的心力衰竭模型中具有PLB磷酸化位点的选择性。上述结果表明，通过直接促进PKA或Camkii的磷酸化或通过降低Camkii的氧化水平来保护心肌细胞保护心肌细胞。所有数据显示，通过CYP2J3介导OPD诱导的SERCA2A相互作用和与PLB的分致化（图3.- - - - - -5）．此外，我们的结果支持OPD促进PXR从细胞质转位到细胞核(图)3.- - - - - -5）．PXR siRNA显着抑制了CYP2J3的表达（图10 (b)和10 (c))PXR最初被发现是一种转录调节的核受体[36]．在我们之前的研究中，敲除PXR可能会减少OPD对CYP2J3的诱导作用[16]．但是，由于这一现象在当时才刚刚被发现，所以当时的数据还不是很充分。因此，在本研究中，我们继续验证并进一步证实PXR参与了OPD对CYP2J的转录调控，并得到了详细的结果。进一步表明PXR可能参与了CYP2J3的调控。核受体，包括PXR、CAR和AHR，对CYP酶有调节作用。这是首次发现并证实PXR参与CYP2J的转录诱导。是否有其他核受体或转录因子参与CYP2J的转录调控还有待进一步研究。综上所述，我们发现CYP2J3介导了SERCA2a和PLB之间的相互作用，提示CYP2J3的适当表达和功能对于维持Ca至关重要^2＋体内平衡。事实上，CYP2J3表达和翻译修饰的改变与心肌肥厚、心肌I/R损伤和其他Ca紊乱的发生和发展有关^2＋调节疾病[37- - - - - -40]．本实验室围绕OPD开展了系统的研究，证明OPD对心衰有很好的药理作用，主要是通过诱导CYP2J促进SERCA2a活性，维持细胞内钙稳态，进而保护心肌细胞。说明OPD作为一种治疗心血管疾病的药物具有良好的前景和发展价值。能否成为治疗心力衰竭的药物需要根据新药开发的指导原则进行，但OPD作为治疗心力衰竭的先导化合物是毫无疑问的。为此，我们的研究结果确定CYP2J3是一个有吸引力的靶点，OPD是一个有前景的HF治疗先导(图)13）．

缩写

烦恼:	荧光共振能量转移
PXR:	孕烷X受体
门诊部当:	Ophiopogonin D
SERCA2a:	Ca2 +-ATPase2a.
拉钮:	受磷。

数据可用性

细胞活力、内质网钙含量测定^2＋和Ca^{2 +}-ATPase活性、qPCR、western blot分析、共免疫沉淀分析、免疫荧光共定位、小干扰RNA转染、时间分辨FRET成像]用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

信息披露

本声明承认，本文件遵守资助机构、出版商和其他从事支持研究的组织建议的透明报告和临床前研究科学严谨性原则。

的利益冲突

作者声明他们的工作没有利益冲突。我们声明，我们没有任何与所提交的工作相关的利益冲突的商业或联合利益。

作者的贡献

王宇光设计了这项研究。贾旺进行了实验，分析了数据，并起草了手稿。尤文婷、王宁宁、周伟、葛云轩、马增春、谭洪玲协助实验。贾旺和王玉光写了手稿。王宇光和岳高审阅了手稿。

致谢

我们感谢黄博士给我们的有用建议，感谢杨博士提供的细胞。本研究由王玉光、王佳和高越设计。Jia Wang进行实验，分析数据，起草手稿;尤文婷，王宁宁，周伟，葛云轩，马增春，谭红玲协助实验。手稿由王佳和王玉光撰写。王玉光和高悦审阅了手稿。我们衷心感谢所有帮助过我们的人。这项工作得到了国家科学基金会的支持[81873032]。本研究由国家重点研发计划资助。2018 yfc1704500]。

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