文摘
背景。肠道是重要疾病和器官损伤的司机。最近,过多的中性粒细胞胞外陷阱(网)的形成与粘膜炎症有关。肠黏膜的直接调查是必不可少的照亮危重患者肠道屏障的潜在机制。我们假设早期肠内营养(EN)可以减少肠道网和维护肠道屏障。方法。肠活检获得使用活检钳从危重外科患者复杂enterocutaneous瘘。蛋白质的表达紧密连接(TJ),粘膜炎症和细胞凋亡进行了评估。此外,NET-associated蛋白质在小肠标本进行评估病人的免疫印迹和免疫荧光分析。结果。危重患者肠道屏障明显受损接受早期全肠外营养(TPN),证明通过小肠绒毛萎缩,炎性浸润,肠上皮细胞凋亡增加,异常TJ表达式。早在这些肠道损伤明显减轻。另外,我们观察到的增加形成的网络结构和表达升高NET-associated肠子危重外科患者的蛋白质。早期EN与减少网和减少NET-associated蛋白质的表达。机械,TLR4通路的分析显示,TLR4显著增加,NFκB, MAPK信号在患者接受TPN相比,那些接受早期EN。结论。肠道屏障被中断在人类肠道疾病至关重要。我们的数据表明,净增加结构显示在肠道的危重外科病人,和早期治疗,减少净粘膜免疫的形成和保存。
1。背景
重要疾病破坏肠道完整性通过增加炎症反应和上皮细胞凋亡。肠道长期以来被认为是多器官功能障碍的“引擎”(MOD)对危重病人(1]。然而,原始证据理论只有被实验或回顾性数据支持。直接调查人类肠道粘膜的危重病人需要证实这个理论。越来越多的证据也表明,一个先进的方法针对人类肠道是最有效的方式展示肠道作为司机的角色重要疾病(1,2]。
营养支持是治疗重大疾病的基础。在缺乏肠内营养(EN),破坏黏膜的完整性有助于肠道屏障受损(3,4]。基于动物模型表明,越来越多的证据全肠外营养(TPN)有助于增加感染发病率由于粘膜损伤(5]。然而,肠道屏障和粘膜形态学的变化危重病人接受TPN或EN几乎被记录和了解甚少。岩钉等。6)最近调查了休克患者早期EN对肠粘膜的影响通过测量等离子体肠上皮细胞损伤的生物标志物。然而,精确的机制影响的营养在危重患者的肠道屏障仍然待定。因此,直接评估危重病人肠的深入理解是至关重要的肠道功能障碍的可能机制。
积累的中性粒细胞在牙龈空间会扰乱当地免疫环境和损害上皮屏障。2004年,一个新的机械作用是中性粒细胞中描述:激活中性粒细胞可以爆发网络式染色质细丝形成中性粒细胞胞外陷阱(网)在各种状态的炎症反应7]。最近的一项研究表明,网与溃疡性结肠炎患者的炎症级联(8]。增加肠道炎症反应是非常重要的在脓毒症患者和国防部的进展9]。网的贡献肠道炎症和肠道屏障功能障碍还有待阐明。因此,我们相比的影响网络结构的形成和TPN在危重病人接受。
我们研究的主要目标是研究变化在肠道黏膜疾病患者接受EN或TPN至关重要。二级目标是旨在评估网络结构的形成在肠道中危重病人的营养和比较不同路线的影响网络的形成。
2。材料和方法
2.1。伦理语句和人体组织
我们的研究是基于指南的建议执行临床试验伦理委员会的金陵医院。所有的病人提供书面知情同意之前,任何进一步研究过程的性能。
最近,肠道屏障功能的评价通过测量循环生物标志物对危重病人是有限的和间接的。此外,没有共识适当的等离子体生物标志物的截止点(10]。在我们的研究中,我们提出了一个理想的模型(enterocutaneous瘘(ECF))直接观察形态和调查期间肠道疾病至关重要。ECF患者腹部症状和瘘摄影图所示1(一)。肠道粘膜标本经皮通过瘘使用活检获得的。从所有参与者获得知情同意,收到了这个过程。
(一)
(b)
我们的前瞻性研究队列20 ECF患者承认了金陵医院外科重症监护病房(SICU)从2018年10月至2019年6月。SICU,属于普通外科学系,接收腹部创伤和围手术期患者。为关键的疾病,虽然早期EN是首选,TPN组仍用于一些特定的情况下,包括(a)无法容忍足够的卡路里摄入量,(b)持续呕吐、腹胀(c)增加,(d)肠梗阻的证据,(e)与其他未定义的瘘,腹腔感染复杂和高输出瘘(f)。喂养的路线是由图表回顾和讨论与家人和手术团队。在我们的研究中,根据航线组划分的营养:一个早期TPN组(TPN组, ),而另一组收到完整的肠内营养(EN组早期,早期 )为七天。7天,肠样本。登记患者的基线特征补充表所示1。在基线,没有早期EN和TPN组之间的区别。
2.2。组织学、免疫组织化学和免疫荧光
人类肠活检在福尔马林固定石蜡和嵌入。苏木精和伊红染色(圆))执行,和赵的评分系统是用来评估肠道损伤。评估杯状细胞的密度,周期性acid-Schiff (PAS)染色法和碱性blue-PAS染色,如前所述[11]。
免疫组织化学(包含IHC)染色、幻灯片和anti-IL-1孵化β抗体(Servicebio、GB11113、武汉),anti-IL-6抗体(Servicebio、GB11117-1、武汉),anti-TNF -α抗体(Servicebio、GB11188、武汉),anti-Bax抗体(Servicebio、GB11007-1、武汉)和anti-Bcl-2抗体抗原后(Servicebio、GB12318、武汉)检索(柠檬酸缓冲)和组织背景关闭(山羊血清)。然后,幻灯片是孵化biotin-linked第二抗体(goat-anti-rabbit) 20分钟,与链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(年代/合)20分钟和轻拍(Servicebio、K5007、武汉)5分钟(12]。与苏木精染色的部分,然后脱水。最后,在显微镜下观察染色。
紧密连接的定位和表达(TJ)蛋白质和蛋白质NET-associated immunofluorescent探测到染色使用ZO-1抗体(ab96587;Abcam)、occludin (ab216327 Abcam) claudin-1 (ab180158 Abcam),鼠标反MPO (ab25989 Abcam),兔子反NE (ab131260 Abcam)和兔反citH3 (ab5103 Abcam)。DAPI用于复染色DNA。图片是使用徕卡DMI 4000 B荧光显微镜获得的。
2.3。免疫印迹
样品化验,0.1 g的肠道是均质和ultrasonicated然后裂解缓冲处理。所有的蛋白质样本煮混合后能较量的缓冲区。从肠道检测蛋白质的表达水平,通过sds - page凝胶分离。总蛋白的凝胶被转移到PVDF膜。膜被封锁的牛奶然后孵化主要感兴趣的蛋白抗体在一夜之间在4°C。接下来,膜与HRP-labeled孵化二级抗体。蛋白的表达在光密度量化单位使用图像实验室软件(美国CA Bio-Rad)和归一化到相应的样本的表达GAPDH(中华人民共和国凯基生物生物技术)。
2.4。细胞凋亡的评估
细胞凋亡的检测肠组织使用TUNEL末端转移酶(dUTP尼克结束标签)染色根据制造商的指示,如前所述[13]。
2.5。统计分析
使用SPSS软件进行统计分析。结果表示为 除非另有说明。比较两组的未配对使用,单侧的学生 - - - - - -测试。对蛋白质和细胞因子的表达,一个配对的学生 - - - - - -测试使用。所有值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。早期EN的影响在粘膜形态学和生化障碍疾病至关重要
形态学,绒毛萎缩和绒毛高度下降所示TPN组和早期EN改进绒毛形态(图1 (b))。此外,他走时肠子的染色显示重要的肠粘膜损伤,就是组织破坏和炎性细胞的浸润在病人接受TPN(图1 (b))。但是,早期EN显著缓解这些伤害。此外,使用PAS和碱性blue-PAS染色,我们的研究结果显示,杯状细胞的数量显著增加早期EN组相比与TPN组(补充图1)。
3.2。早期肠内营养改善肠道免疫环境
密集的网络配合胃肠道上皮细胞的免疫细胞保持肠道炎症平衡(5]。包含IHC染色显示,促炎因子,包括il - 1β、il - 6和TNF -α在TPN组相比显著增加早期EN组(数字2(一)-2(c))。抗炎细胞因子il - 10,主要来源于上皮内淋巴细胞、肠上皮屏障是一个至关重要的因素。图2(d)表明,il - 10表达显著减少在TPN组与EN组。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。早期EN恢复对危重病人肠物理屏障
TJ完整性受损的关键因素是肠道上皮通透性增加(12]。ZO-1的结果表明,该表达式,occludin, claudin-1显著增加肠道粘膜早期EN组相比TPN组(图3)。受损的肠道绒毛通过显微镜进一步验证。如补充图所示2TJ的超微结构的形态学和细胞桥粒肠子中断TPN组。然而,TJ和细胞桥粒近完整的病人接受。
(一)
(b)
(c)
(d)
肠上皮细胞凋亡是一种重要的促进剂TJ(中断13]。TUNEL-positive细胞的数量增加肠道粘膜TPN组所示,虽然早期EN治疗显著减毒的肠上皮细胞凋亡(图4(一))。此外,伯灵顿proapoptotic蛋白质的表达和抗凋亡蛋白bcl - 2评估检查肠道细胞凋亡水平。包含IHC染色和免疫印迹结果显示增加表达的伯灵顿和减少bcl - 2表达的TPN组相比早期EN组(数字4 (b)和4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。NET-Associated蛋白质调节肠道的危重病人,早期在治疗后可能会降低
增加网的形成与肠道损伤有关。然而,网不稳定的临床等离子体生物标志物和酶促降解[14]。更好的检测本地网络结构的形成是需要调查的潜在机制。显微分析检测到阳性染色citH3和MPO(图5(一个))、NE和MPO(图5 (b)),重叠与扩散DNA支架和确认增加肠道中网络结构的形成至关重要的疾病。图5还显示,早期EN与肠道粘膜的减少网的存在。净形成PAD4充当司机,肠道免疫印迹显示明显降低早期EN组相比TPN组(补充图3)。我们下一个评估网的其他三个组件,包括东北的表达、MPO、citH3。这些NET-associated蛋白质的表达减少肠道的病人接受早期EN。
(一)
(b)
3.5。早期EN TLR4通路的影响
TLR4的表达蛋白在肠道在我们的病人评估。结果表明,早期EN与降低肠道而TLR4表达与TPN组。NF的κB通路激活TLR4可能启动炎症基因的转录。补充图4表明p-IKKβ导出,κBα,p-p65蛋白质大大减少早期EN组相比与TPN组。TLR4 MAPKs是另一个重要途径激活。p38, ERK和物信号是评估使用免疫印迹。我们的研究结果表明,p-p38和p-ERK水平明显降低早期肠道EN组(补充图4 b)。有趣的是,p-JNK蛋白质的表达显示两组之间没有显著差异。
4所示。讨论
肠道长期以来被认为是关键的司机疾病(1]。在正常生理条件下,肠道健康维护起着重要的作用。然而,多个元素的危重患者肠道受损,可能恶化MOD。我们研究了这些变化的潜在机制并提供坚实的证据的重要性,在人类肠道疾病至关重要。我们研究了肠道屏障的变化在危重病人接受不同类型的早期营养。我们的研究结果表明,患者接受TPN显示一个受伤的粘液屏障,增加炎症反应,TJ蛋白异常,细胞凋亡增加肠道标本与美联储伤肠胃。这一发现与增加肠道中的网络结构的形成。过度形成网最近建议为粘膜损伤(15,16]。免疫荧光图像表明,网络结构的强度和分布显著增加接收TPN在危重患者的肠道。因此,肠道屏障功能障碍的可能与增加NET-associated有关蛋白质和网络结构。
在目前的研究中,萎缩性粘膜也是TPN治疗患者中显示;早期EN治疗明显有助于恢复粘膜形态。这些发现表明肠上皮细胞之间的相互作用和营养方面扮演着重要的角色在维持细胞功能和新陈代谢活跃。在一项研究老鼠的脑损伤,未得到食物的老鼠,延迟EN相比,表现出显著的萎缩性粘膜和更快的上皮细胞的凋亡。此外,提出重启EN清醒休眠肠粘膜细胞,可诱导上皮细胞提高蛋白质合成(17]。粘蛋白分泌的酒杯吧也扮演着一个重要的角色,以保护肠道上皮细胞对细菌入侵。在目前的研究中,早期EN治疗有助于保持杯子的数量在人类肠道疾病至关重要。
小鼠和细胞培养的研究结果表明,受损TJ蛋白与促炎细胞因子和增加产量的上升后TPN治疗。我们之前的研究表明增加促炎细胞因子的生产有助于增加上皮细胞凋亡(13]。在目前的研究中,我们证实,增加当地人类肠道中促炎因子与交替TJ蛋白的表达和细胞凋亡增加病人接受TPN等等。这些重大变化促炎因子的生产启动链效应导致的损害的细胞机制,保护肠上皮屏障在生理条件下(18]。抗炎反应受到il - 10在维持上皮屏障很重要。证据来自体内对小鼠的研究表明,在TPN il - 10表达明显下降,这是与受伤的套和上皮通透性增加。太阳et al。19)表明,外源性il - 10管理局明显缓解TPN-associated TJ蛋白表达减少。在我们的研究中,在剥夺与降低il - 10的水平,和早期治疗显著增加il - 10表达在肠道的危重病人。
最近的研究调查,过度的网络结构的形成是导致脓毒症的发展或插件20.]。高浓度的净生物标志物已报告在危重患者中,但是目前,方法检测净形成仅限于间接测量循环(21,22]。此外,循环水平的净标记不稳定和酶促降解。因此,检测本地网络的形成是迫切需要研究的重要疾病。最近,网提出了直接诱导上皮细胞死亡(23],它会加重肠道屏障功能障碍。朗et al。24)报道,蚊帐的退化可能扭转nonobese糖尿病小鼠肠道炎症和损伤。此外,迪et al。8)表明,网被释放在结肠粘膜组织和建议过度感应网有助于肠道炎症级联放大的。李等人。16)最近表明,净DNase降解可能保护DSS-induced实验性结肠炎,和DNase治疗预防血清炎性细胞因子的增加。在目前的研究中,我们发现危重患者的肠道显示增加蛋白质的NE和MPO水平,网的两个主要组件。我们如果图像进一步表明,NE和MPO colocalize DNA和citH3,表明网络结构发生在危重患者的肠道。因此,削弱的网络结构所示EN-treated早期患者。需要进一步调查描绘的潜在机制参与间隙肠道网。
TLR4信号是一个重要的途径的肠道粘膜腔的感官变化环境。我们的研究发现TLR4的表达显著增加肠道的危重患者接受早期TPN相比早期EN。有一个新兴的理论,改变微生物种群在患者接受TPN诱导肠道屏障功能障碍,包括增加许多革兰氏阴性细菌。营养发挥重要作用在调节肠道免疫相声bacteria-mucosal [25,26]。扩大革兰氏阴性细菌已经建议TLR4信号通路的激活27]。虽然我们没有报告微生物数据,增加TLR4表达的结果将符合以前的出版物。最近的研究表明,TLR4信号通路与网络结构形成的增加(28]。在这项研究中,TLR4信号可能参与肠道净形成。
本研究的主要局限是,所有患者遭受了ecf,这影响了肝肠循环也会影响肠道的架构。此外,所有患者病危,因为相关的条件/发病率,有额外的对肠上皮细胞的影响。然而,它确实是困难和危险的执行系统消化内镜在危重病人。我们提供一个先进的方法来评估使用ECF模型肠道病变。
肠道的概念作为重要疾病的司机已经建立了超过30年。肠道微环境的失调可以驱动脓毒症的恶化和诱导遥远的器官损伤。然而,不存在当前的治疗目标肠道屏障或渗透率在危重病人的床边。临床模型(ECF)在我们的研究有助于调查所选药物疗法对当地的影响肠道粘膜,而迫切需要进一步的研究来确定目标时粘膜疾病至关重要。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Qiongyuan胡、华坚任和中成药在香港同样导致了纸。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81772052)和江苏省研究生创新研究与实践项目(KYCX19_0052)。
补充材料
补充表1:外科ICU患者的人口统计学和临床变量。补充图1:影响早期肠道营养生化上的障碍。(一)PAS染色和AB-PAS染色进行确定数量的肠道内肠酒杯吧。补充图2:关键疾病破坏肠道紧密连接的形态。(A)在患者接受肠样品TPN, TJ超微结构受伤。TJs几乎完好无损在肠道的早期EN组。补充图3:NET-associated蛋白质的表达决心在危重患者的肠道。免疫印迹显示PAD4, NE、MPO和citH3表达肠样品,比较TPN和早期EN组。补充图4:早期肠内营养对TLR4信号的表达水平。(A)的水平TLR4、IKKβ,我κBα在肠道,p65蛋白分析危重病人接受不同类型的营养。(B)营养对MAPK信号传导的影响,包括p38的兵,和物,在人类肠道疾病至关重要。(补充材料)