文摘

上下文的需求增长可持续抗衰老的干预,水果加工的副产品是一种很有前途的生物活性化合物来源抗衰老的膳食补充剂的生产。Piquia (Caryocar仁)是一个本地亚马逊水果nonedible壳组成的65%。在目前的研究中,植物化学的概要piquia hydroalcoholic提取的壳(CV)以质/ MS分析。其抗氧化和延缓衰老的活动使用线虫进行了调查秀丽隐杆线虫作为一个在活的有机体内模型。简历主要由hydrolysable单宁和三萜皂甙。野生型和突变体的提取增强抗压性蠕虫通过减少细胞内活性氧(ROS)水平和增加他们的生存的致命剂量prooxidant胡桃酮。这些影响包括upregulationsod-3的差别,对这些gst-4和hsp - 16.2,研究了通过GFP荧光强度和记者在转录水平上存在的分析。简历野生型蠕虫的寿命延长在DAF-16 / FoxO -和SKN-1 / Nrf-dependent方式。综上所述,我们的研究结果表明piquia贝壳作为营养食品应用中潜在的候选人。还需要进一步的研究来验证我们的研究结果的相关性在人类抗衰老的干预措施。

1。介绍

人口老龄化导致一个指数与年龄相关的疾病的发病率增加,反映出极高的人民福利和卫生保健系统的成本1,2]。这个社会环境引发了全球对延缓衰老的膳食补充剂的需求。近年来,消费者越来越喜欢可持续补充植物性转移的注意食品、制药和化妆品工业向处理食物垃圾的产品与另一种生物活性化合物和低成本的来源少环境影响(3]。在这个框架中,从水果的副产品中提取和化合物分离显示潜力(4,5]。虽然水果的副产品的抗衰老的潜力通常归因于强有力的抗氧化活性显示的次生代谢物(如黄酮类、单宁和其他多酚),更详细在活的有机体内研究需要支持这些说法。

老化的结果之间复杂的相互作用的遗传,表观遗传、环境和随机因素(6]。多个变量之间的相关,氧化应激已经广泛支持作为一个老化过程,因此代表了一个相当大的因素发展的合适的治疗目标小说抗衰老的干预措施(7]。更详细的,随着年龄增长,先天抗氧化剂网络,允许生物平衡活性氧的水平(ROS)从内生和外生来源逐渐妥协8]。因此,ROS高于生理水平造成损害细胞分子,尤其是蛋白质,脂类和DNA(导致点突变)。氧化应激损伤的积累加上修复机制的下降导致线粒体功能障碍,失去proteostasis,基因组不稳定性,显示为衰老本身和与年龄相关的疾病的发作(9- - - - - -11]。因此,饮食的补充抗氧化剂,特别是植物起源、预防和症状被认为是一个关键战略管理与年龄有关的疾病,如身体虚弱,癌症、代谢综合征、心血管疾病和神经退行性疾病(12- - - - - -16]。

模型系统已经帮助理解氧化应激的作用在老化过程和识别植物化学的抗氧化剂与抗衰老的活动(17- - - - - -19]。用于药物发现的生物模型中老化研究,蛔虫秀丽隐杆线虫被认为是最具成本效益的替代哺乳动物测试(20.]。事实上,摩根大通药物数据库(DrugAge)编制超过500种化合物与抗衰老的特性,其中大部分是测试秀丽隐杆线虫(21]。的一些特点,使蛔虫衰老研究的理想平台是它的体积小,短的生命周期,大型的后代,寿命约三个星期。此外,高遗传温顺和透明度在整个生活允许解剖特征的可视化,荧光染料,基因编码的荧光标记(22]。最重要的是,秀丽隐杆线虫基因组完全测序,分享42%左右orthologues与人类疾病相关的基因,和许多基因突变株的衰老过程是现成的23]。

Piquia (Caryocar仁(Aubl)。珀耳斯)是一种不知道本机亚马逊的水果组成的65% nonedible壳(外部中果皮)(24]。纸浆,富含类胡萝卜素,是最利用水果的一部分。亚马逊的饮食的重要组成部分,通常食用煮熟的,用于烹调油的生产、化妆品、和药用目的(25,26]。也可食用的种子和化妆品的石油来源的准备。由于高含油量的果肉和种子,c .仁通常是指出作为一个潜在的作物生产生物柴油(27]。Piquia壳,富含单宁和皂甙,传统上用于生产油墨、吊床染料,和肥皂28]。以前作品的化学成分和生物活性piquia主要是集中在纸浆中提取,揭示酚含量高,在体外活性氧清除能力、antigenotoxicity和局部抗炎模型大鼠活动(29日- - - - - -32]。据我们所知,只有一项研究评估潜在的生物活性piquia壳,关注的多酚具有较强的自由基清除能力在体外(33]。piquia纸浆产生多个应用以来的贝壳作为副产品,我们假设piquia壳可能代表一个可持续的来源与潜在的抗衰老的抗氧化化合物的性质。

在这项研究中,我们的植物化学的成分特征hydroalcoholic提取piquia壳(CV)和研究其抗氧化和延缓衰老的活动秀丽隐杆线虫另外,探索行动的潜在机制。提取是评估其影响细胞内活性氧积累,防止致命的氧化应激,野生型和突变体基因表达和延长寿命的蠕虫在压力阻力和长寿基因秀丽隐杆线虫。CV-mediated基因表达变化进行了研究使用转基因菌株携带绿色荧光蛋白的记者感兴趣的基因和存在的分析。

2。材料和方法

2.1。植物材料和提取过程

熟的果实Caryocar仁收集在亚马逊Ducke森林保护区,玛瑙斯,巴西。hydroalcoholic提取(8:2乙醇/水)的壳在室温下进行。最后提取Caryocar仁果壳被旋转蒸发浓缩,喷雾干燥,产生一种暗黄色的细粉。所有实验,提取新鲜无菌水稀释,不溶性微粒被离心(10000 rpm在4°C)为5分钟。

2.2。植物化学的描述Extract-LC-MS / MS分析

质/ MS分析进行Finnigan LCQ-Duo离子阱质谱仪用ESI源(ThermoQuest,后于科学,史坦威,佤邦,美国),耦合热科学Accela高效液相色谱系统(泵+女士、autosampler和PDA探测器+)与EC 150/3 Nucleodur 100 - 3 C18ec列(Macherey-Nagel Dueren,德国)。一个梯度的水和乙腈(ACN)与0.1%甲酸每个应用30°C如下:0 - 15% ACN 15分钟;15% ACN 10分钟;15 - 35% ACN 20分钟;35% ACN 10分钟;35 - 50% ACN 20分钟;50 - 100% ACN 10分钟;和100% ACN 15分钟。流量为0.5毫升/分钟。注射量是20μl .所有样品都以积极的和消极的模式。女士是毛细管10 V的电压,操作源温度达到240°C,和高纯度氮作为鞘和辅助气体的流量80和40(任意单元),分别。离子被发现在50 - 2000的质量范围 。碰撞能量的35%被用于MS / MS的碎片。数据采集和分析被处决的Xcalibur™2.0.7软件(美国马热科学、沃尔瑟姆)。

2.3。在体外抗氧化活性

的在体外抗氧化活性的简历是通过标准的特征分析DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrydrazyl)和问题(trolox等效抗氧化能力)评估通过abt (2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)脱色,执行所述在我们之前的研究34]。维生素C (AppliChem GmbH,达姆施塔特,德国)和没食子酸(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国)作为积极的控制。

2.4。在活的有机体内抗氧化活性
2.4.1。秀丽隐杆线虫压力和维护

本研究中使用的所有菌株提供的秀丽隠遗传学中心(公司治理文化,明尼苏达大学,明尼阿波利斯,美国),即N2(WT),CF1038[daf-16 (mu86)),EU1[skn-1 (zu67)),VC475(hsp - 16.2 (gk249)),CF1553[(pAD76) sod-3p:: GFP + rol-6 (su1006)],CL2166[(pAF15) gst-4p:: GFP: NLS),TJ375(hsp - 16.2 - p:: GFP),TJ356[daf-16p:: daf-16a / b:: GFP + rol-6 (su1006)],LD1[skn-1b / c: GFP + rol-6 (su1006)],和大肠杆菌OP50(尿嘧啶营养缺陷型)。

虫子在固体培养线虫生长培养基(NGM),美联储在生活大肠杆菌OP50,维持在20°C (35]。获得同步的人群,鸡蛋被孤立使用漂白和蔗糖密度分离方法和允许在M9舱口一夜之间缓冲(36]。实验,刚孵化的L1蠕虫被转移到液体S-medium接种大肠杆菌OP50 ( )根据记者化验和治疗,在最后一卷2 mL /培养皿( )。所有化验进行20°C。

2.4.2。荧光显微镜和图像分析

分析不同治疗方法的效果在荧光记者GFP的表达(绿色荧光蛋白)和水平的DCF(2 ', 7 '二氯荧光素),生活蠕虫玻片上安装有一滴10毫米叠氮化钠(AppliChem GmbH,达姆施塔特,德国)。荧光图像( 和 )至少30蠕虫/治疗获得恒定曝光时间对于每一个实验,使用日本基恩士Biorevo bz - 9000型荧光显微镜(日本基恩士德国GmbH, Neu-Isenburg,德国)。荧光强度是densitometrically确定平均像素使用ImageJ版本1.52(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达),一个开源的图像处理和分析的软件。

2.4.3。光纤测量细胞内ROS水平测定

N2、CF1038 EU1, VC475蠕虫在L1幼虫阶段处理不同浓度的简历(50,100年和200年μg / mL),不包括对照组。EGCG的积极控制包括(25μ50 g / mL或μg / mL)。成年的第一天,虫孵化1小时20和20°CμM DCF-DA(2 ', 7 '二氯荧光素二醋酸盐)(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国),随后用M9缓冲洗净去除残余染料,并分析了荧光显微镜(37]。ROS水平表示为百分比的控制( )和计算均值像素强度蛔虫的全身。

2.4.4。生存分析Juglone-Induced氧化应激

N2、CF1038 EU1, VC475蠕虫在L1幼虫阶段治疗如前所述。成年的第一天,大约有80的蠕虫每次治疗都被转移到新板块包含刚接种S-medium和80年μM胡桃酮(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim,德国)38]。24小时后,幸存者被计算在内。虫子没有可见的回应温柔的接触刺激都得分死了。存活率表示为百分数( )。

2.4.5。压力Resistance-Related基因的表达

(1)DAF-16和SKN-1的亚细胞定位。TJ356和LD1转基因蠕虫在L4阶段治疗荧光显微镜成像之前一个小时。那时每个虫分类根据观察GFP的表达模式(胞质、中间或核)如前所述,我们组(39]。

(2)量化sod-3, gst-4, hsp 16.2表达基底应力条件下和/或Juglone-Induced氧化应激。CF1553、CL2166 TJ375转基因蠕虫在L1阶段治疗。经过48小时的治疗,成虫暴露到20μ米的胡桃酮24 h,然后分析了荧光显微镜(37,40]。结果显示比例的控制( )计算平均像素强度的虫子的尾巴(sod-3),整个身体(gst-4),或(hsp - 16.2)。

(3)量化相对sod-3、gst-4和hsp - 16.2 mRNA水平:RNA净化和存在。N2蠕虫在L1阶段治疗如前所述。72 h后,收集的蠕虫是重力,洗了三次M9缓冲去除残留大肠杆菌OP50, flash在液态氮冷冻。总RNA分离和纯化使用FastGene RNA溢价净化设备(日本遗传学欧洲GmbH, Dueren,德国)。RNA纯度和浓度进行了测定,分光光度法在260和280海里。纯度和完整性是进一步证实了琼脂糖凝胶。1的互补脱氧核糖核酸合成μ克的纯RNA使用日本FastGene Scriptase II工具包。执行中存在使用PCR生物系统SyGreen混合(美国宾夕法尼亚州韦恩PCR生物系统公司)在罗氏LightCycler 96系统(德国罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。结果提出了折叠相对mRNA水平(2- - - - - -ΔΔCt),从计算ΔΔCt值归一化cdc-42作为参考基因。PCR引物的序列使用以前发表的(41]。

2.5。寿命

同步N2、CF1038 EU1蠕虫是生长在接种S-medium直到成年的第一天。蠕虫被分为治疗组约100人。产卵期间,蠕虫是每天都转移到新接种液体培养基中提取和后方每隔一天。蠕虫与内部孵化后代或挤压的生殖腺审查。蠕虫不再回应一个温柔的接触与铂丝得分为死亡,排除在盘子。结果表示为百分数的生存。

2.6。摄食行为、开发和繁殖
2.6.1。大肠杆菌OP50增长和食物摄入量

心血管治疗的效果大肠杆菌OP50增长和食物摄取的野生型蠕虫是评估通过吸光度的变化在600纳米42]。简单地说,200年μ我刚大肠杆菌OP50接种S-medium ( )每口井是孵化20°C有或没有200μg / mL CV 96孔板。每24小时测量一段72 h使用标(Tecan、Mannedorf、瑞士)。结果表现为褶皱大肠杆菌OP50增长规范化的吸光度天0(各自的治疗 )。食物摄入量的化验,大约20蠕虫(N2在L1阶段)被添加到接种S-medium有或没有200μg / mL的简历,在200年的最后一卷μ信用证。由于观察到氧化的植物提取物,井包含noninoculated S-medium有或没有植物提取物被用作空白。测量所述。结果提出了折叠食物摄入量规范化的吸光度天0 ( )。

2.6.2。身体区域

主体区域的N2蠕虫治疗从L1阶段简历决心使用贴现分析蠕虫成像(部分2.4.3)。结果表示为百分比的控制( )。

2.6.3。育规模

同步N2蠕虫在L4幼虫阶段被放置一个接一个个人NGM琼脂板上。一个大肠杆菌OP50草坪提供了食物来源。在治疗组中,植物提取物添加到200细菌浓度的草坪μ克/毫升。蠕虫是每天都转移到新鲜培养基,24小时后,鸡蛋被数为5 d用解剖显微镜。后代数量的结果表示为每个虫每天下蛋的数量( )。

2.7。统计分析和数据解释

所有图都使用棱镜8 macOS版本执行8.2.1 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有化验除了寿命的统计差异组使用一个计算——或者双向方差分析(窝大小测定)其次是图基的多个使用GraphPad棱镜的对比测试。寿命化验分析kaplan meier其次是生存率较使用IBM SPSS统计Macintosh版本25.0(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。

3所示。结果与讨论

3.1。植物化学的成分的简历

简历的植物化学的成分被质/ MS(图分析1)。总共有43的峰值特征和33化合物分子质量的初步确认,分裂模式,基于文献数据(表和吸收1和2)。总的来说,简历中含有多酚属于主要组的hydrolysable单宁(包括ellagi和鞣花鞣质)和三萜皂甙。酚类化合物显示了强劲的吸收,并在负模式更好的特征,而对于皂甙,没有检测到,吸收和正离子模式提供了更详细的结构信息。


图1
总离子流色谱图(PDA)和(TIC) hydroalcoholic提取的Caryocar仁果壳质/女士得到的负面(ESI)和积极的(ESI +)模式。数字峰值对应表中给出的初步确认化合物1和2(问:规范级别)。
表1
初步hydroalcoholic提取的多酚类物质的识别Caryocar仁果壳质/ MS分析(ESI)。
表2
初步的hydroalcoholic提取三萜皂苷的识别Caryocar仁果壳质/ MS分析(ESI +)。

没食子酸、鞣花酸和各自的衍生品以前报道的主要酚类化合物c .仁提取壳和纸浆(33,43]。山峰2 - 5,12,18,22对应的化合物已经报告c .仁。据我们所知,初步确认hydrolysable单宁对应峰值1,8,9,13,14,15,16,17,19,20.,23,26第一次报告吗Caryocar峰值。1与 355 (mh+]- - - - - -和碎片离子m / z337 (mh+- h2O)- - - - - -初步确认是chebulic酸(44]。峰8与 469 (mh+]- - - - - -产生的碎片离子 425 (mh+有限公司2]- - - - - -所描述的Wyrepkowski et al。45]valoneic酸双内酯。山峰9和15可能对应于galloyl-valoneoyl-glucoside同分异构体。在负模式中,他们显示 801 (mh+]- - - - - -主要碎片离子 757 (mh+有限公司2]- - - - - -。这种离子给进一步碎片离子 633、613和301之前报道galloyl-decarboxy-valeoyl-glucoside [46]。山峰13,20.,26,表现出相同的quasimolecular离子 951 (mh+]- - - - - -,同样的 在171 nm,分裂模式相同,似乎同分异构体相同的物质。由于主要碎片离子 907 (mh+有限公司2]- - - - - -到301年,一个典型的MS / MS片段内酯化后产生hexahydroxydiphenoyl (HHDP)集团为鞣花酸,他们初步分配给HHDP-valoneoyl-glucoside,提出Yisimayili et al。47]。根据相同的作者,峰值14,也与 951 (mh+]- - - - - -但是不同的吸收和碎片,被确认为galloyl-HHDP-DHHDP-hexoside。峰23与 907 (mh+]- - - - - -HHDP-valoneoyl-glucoside的主要碎片离子质一样,而且,其分裂模式非常相似。因此,这种化合物和HHDP-decarboxy-valoneoyl-glucoside初步确认。峰16与 925 (mh+]- - - - - -和一个主要碎片离子 301显示相同的分裂模式描述为phyllanthusiin C Catarino et al。48]。峰17与 969 (mh+]- - - - - -和主要碎片离子 925 (mh+有限公司2]- - - - - -,633年和301年被初步确认为phyllanthusiin B相比相同的作者。峰19有一个quasimolecular离子 785 (mh+]- - - - - -主要碎片离子 301年,另一个典型的碎片离子 633 (mh+-galloyl]- - - - - -。根据Taamalli et al。49)和Yisimayili et al。47),这种分裂模式对应于digalloyl-HHDP-glucose。

初步确定了三萜皂苷已经描述的茎皮和水果c .仁和c . glabrum(50- - - - - -52]。源碎片数据表2对应于之前报道的分裂模式。

3.2。在体外抗氧化活性

DPPH和abt化验进行描述在体外抗氧化活性的简历(表3)。提取显示强大的自由基清除活性与抗坏血酸,一个著名的强有力的抗氧化剂作为积极的控制在我们的研究中。没食子酸,之前报道的主要化合物c .仁提取并还发现了在目前的提取研究中,化验显示最高的自由基清除能力。这些结果,虽然没有直接的生物学意义,可以作为进一步研究抗氧化活性的比较值Caryocar种虫害提取物。

表3
在体外抗氧化活性的Caryocar仁壳提取物(简历)。
3.3。在活的有机体内抗氧化活性,秀丽隐杆线虫

DAF-16 / FoxO和SKN-1 /联盟是关键转录因子调节压力的抵抗,蛋白质体内平衡和寿命秀丽隐杆线虫(55]。这些转录因子的活动并行控制但独立的胰岛素/ igf - 1 (IIS),一个的进化途径调节衰老从蠕虫到哺乳动物。在适宜的条件下,DAF-16和SKN-1被相同的IIS通过磷酸化激酶(SGK-1和AKT-1/2)和胞质保留19,56]。在不同类型的压力,减少了IIS信号释放抑制导致核易位和顺向应激反应基因的转录激活或抑制。其中,DAF-16直接调节的转录sod-3、编码阶段我抗氧化剂酶超氧化物歧化酶3 (SOD-3)和coregulates热休克因子1 (HSF-1)的表达hsp - 16.216.2、编码的热休克蛋白(hsp - 16.2) (57,58]。SKN-1主要参与第二阶段解毒基因的调控,如gst-4、编码为谷胱甘肽年代转移酶4 (GST-4) [56]。

在目前的研究中,我们最初的抗氧化活性测试简历通过评估其影响在活的有机体内清除活性氧和抵抗致命的氧化应激。行动的机制参与了抗氧化活性的简历被进一步探讨分析提取的效果在激活下游DAF-16 SKN-1和各自的目标sod-3,gst-4,hsp - 16.2。

3.3.1。ROS对Juglone-Induced氧化应激水平和生存

在第一组实验中,我们评估了影响基底上的简历提取野生型蠕虫的ROS水平(N2)使用oxidation-sensitive荧光探针DCF (59]。提取物能够显著降低细胞内活性氧积累的浓度剂量依赖性的方式(图进行测试2(一个))。在最大浓度测试(200μg / mL),简历减少活性氧的水平 与未经处理的控制( )。

(一)
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图2
细胞内活性氧积累在基底应力条件下的野生型(a)和突变蠕虫daf-16(b),skn-1(c)hsp - 16.2(d)处理Caryocar仁果壳(简历)。结果表示为 至少有三个独立的实验中,计算从DCF蠕虫的整个身体强度( ,与未经处理的控制)。

阐明DAF-16的角色和SKN-1观察活动,淘汰赛对这些转录因子突变体被(分别CF1038和EU1)。虽然在较小程度上,简历也显著降低活性氧的水平在两个突变体(数字2 (b)和2 (c))。为skn-1突变,简历显示一个u型的剂量反应曲线,最高的ROS清除活动在100年μ克/毫升。这个结果可能表明prooxidant影响提取的高剂量的直接后果缺乏重要的解毒基因。此外,在hsp - 16.2突变体(VC475),简历与轻微降低活性氧的积累浓度测试(图之间的区别2 (d))。代表生活蠕虫的荧光图像的量化分析活性氧可以补充信息(图中找到S1)。

山口et al。33)也证明了一个piquia壳提取物清除自由基的能力在体外。细胞抗氧化试验,提取能够抑制氧化减少近100% ROS水平,LPS-stimulated巨噬细胞模型,它几乎抑制一氧化氮的产生,一个充当促炎介质的自由基。

为了调查的简历是否对急性氧化应激产生了耐药性,生存分析下致命剂量的prooxidant胡桃酮进行使用之前测试的菌株。胡桃酮、萘醌隔绝胡桃树(胡桃regial .)是常用的作为氧化应激诱导物秀丽隐杆线虫(60,61年]。根据集中应用,它可以通过氧化还原循环引起轻微到致命的氧化应激机制。基于先前的调查在我们实验室进行,我们选择80μM胡桃酮诱发致命的氧化应激(62年]。野生型线虫处理200μg / mL的简历是最耐80μM胡桃酮(图3(一个)),的存活率 相比 胡桃酮组( )。正如预期,daf-16突变,此前表现出更高水平的ROS,氧化应激(图显示更高的灵敏度3 (b))。为skn-1突变,最高的存活率与治疗组与ROS(图的最高水平3 (c))。这一结果表明,轻度prooxidant CV 200的效果μg / mL积极的反应介导的skn-1突变体对致命的氧化应激,暗示激效剂量反应(63年,64年]。类似的结果被报道为其他丰富的单宁酸植物提取物(65年)和一些膳食抗氧化剂,如咖啡因和相关methylxanthines [41],tomatidin [66年],槲皮素(67年]。变异虫的hsp - 16.2显示抗氧化能力只有在处理200年μg / mL的简历(图3 (d))。综上所述,我们的研究结果表明,增强简历治疗抵抗引起的压力,很明显,没有严格的依赖daf-16,skn-1,hsp - 16.2。然而,如果采取定量,这些结果也可能让我们得出这样的结论:没有DAF-16信号负面影响简历的抗氧化能力,自daf-16突变体显示整体ROS水平较高和较低的存活率与野生型相比蠕虫。

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图3
的影响Caryocar仁果壳(CV)野生型(N2)和突变体的存活率蠕虫daf-16(b),skn-1(c)hsp - 16.2(d),暴露于80μM胡桃酮诱发致命的氧化应激。存活率表示为 至少有四个独立的实验( , ,和 ,相比胡桃酮)。
3.3.2。压力Resistance-Related基因的表达

植物提取物富含多酚以前发现发挥抗氧化和lifespan-promoting效果秀丽隐杆线虫诱导的转录活动DAF-16 SKN-1,从而调节基因的表达与压力阻力和长寿37,68年,69年]。澄清哪些基因是通过控制调节的简历来增强抗氧化应激秀丽隐杆线虫最初,我们分析了影响DAF-16和SKN-1的激活。不同浓度的影响的简历的亚细胞定位模式两个转录因子确定使用转基因菌株TJ356和LD1携带平移GFP DAF-16 SKN-1,记者分别(数字4(一)和4 (b))。简历治疗诱导DAF-16细胞核(图的易位4 (c)),但未能激活SKN-1(图4 (d))。100年DAF-16核本地化诱导μ克/毫升 的蠕虫,相比未经处理的控制( )。

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图4
的影响Caryocar仁果壳(CV)的胞内定位DAF-16 SKN-1。(a)代表图像与核TJ356蠕虫,中间,和胞质DAF-16:: GFP本地化。(b)代表的图像与中间值和胞质SKN-1 LD1蠕虫::GFP本地化。(c) DAF-16的胞内定位。(d) SKN-1的胞内定位。蠕虫的结果给出的意思是百分比显示每个模式的定位至少有三个独立的实验。DAF-16:: GFP,误差显示蠕虫展出的平均百分比 ,和统计差异也指这种定位模式( , ,与未经处理的控制)。SKN-1:: GFP,误差显示蠕虫展出的平均百分比 。

DAF-16和SKN-1目标基因的表达水平,sod-3,gst-4,hsp - 16.2,随后被确定使用菌株携带GFP记者耦合的催化剂各自的基因和通过存在分析。最初,我们使用转基因株CF1535调查的表达sod-3::GFP基底压力条件下,在轻微的氧化应激,诱导剂量的20倍μM胡桃酮。这个胡桃酮的浓度是为了诱导应力resistance-related基因的表达在不影响蠕虫的生命机能(62年,70年]。

代表生活蠕虫的荧光图像的量化分析sod-3可以在补充信息(数据吗S2和S3)。基底应力条件下,100年μg / mL简历的荧光强度显著增加 ,与未经处理的控制( )(图5(一个))。相比之下,在200年μg / mL,我们可以观察GFP强度明显降低。一个轻微的20倍μM胡桃酮导致一个更明显的诱导sod-3::GFP简历浓度测试(图5 (b))。的最大upregulation 发生在100年μg / mL,相比胡桃酮治疗( )。

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图5
的影响Caryocar仁果壳(CV)超氧化物歧化酶3 (sod-3)表达在基底和轻微的氧化应激,诱导剂量的20倍μM胡桃酮。(一)sod-3基底应力条件下::绿色荧光蛋白表达水平。(b)sod-3::GFP表达水平在juglone-induced氧化应激。(c)相对sod-3基底应力条件下野生型蠕虫的mRNA水平。(d)相对sod-3野生型蠕虫的mRNA水平下20μM juglone-induced氧化应激。数据是代表三个独立的实验。表达绿色荧光蛋白表达水平 ( , ,和 ,相对于各自的控制)(# # ,与未经处理的控制)。相对mRNA水平意味着折叠相对mRNA水平,提出了计算ΔΔCt值归一化cdc-42作为参考基因( , ,相比胡桃酮)。

的表达sod-3也在转录水平通过存在分析调查。的mRNA水平sod-3基底应力条件下遵循相同的模式GFP强度(图5 (c))。正如预期的那样,在100年蠕虫对待简历μg / mL,相对mRNA水平高于未经处理的控制。这个结果,结合GFP强度和DAF-16本地化模式之前观察,表明在100μg / mL简历诱发的易位DAF-16导致upregulation核sod-3,其目标基因。

治疗200μg / mL简历导致最大减少ROS水平 (图2(一个));然而,在这个浓度,的表达水平sod-3是减少了。这个结果显然是矛盾的,因为低水平的ROS通常与更高的抗氧化酶的表达水平sod-3(37,71年]。尽管如此,一个类似的效应也为其他植物化学的和合成抗氧化剂。槲皮素和白藜芦醇保护秀丽隐杆线虫从氧化应激,降低细胞内活性氧的水平,尽管这两个化合物的表达减少sod-3(72年,73年]。标准的抗氧化剂抗坏血酸、叔丁基羟基茴香醚(BHA),据报道和抗坏血酸钠也减少ROS水平秀丽隐杆线虫同时减少的表达sod-3(74年]。根据作者,大幅减少ROS水平引起的强有力的抗氧化剂会导致缺乏细胞氧化的负担,导致的压迫sod-3表达式。很可能,这个论点解释200年的这一研究获得的结果μg / mL简历。我们的研究表明,200年μg / mL是阈值抗氧化剂浓度的简历停止引起的表达sod-3。

在氧化应激,mRNA水平和之间的负相关sod-3::观察GFP强度(图5 (d))。信使rna的相对水平测定在野生型蠕虫,GFP强度是决定使用一个突变菌株携带转录的记者。在秀丽隐杆线虫研究转录融合方法是经常使用或者存在调查基因表达的变化。然而,转录记者可能缺乏潜在的监管元素位于超出了5 结束或3 - - - - - -unstranslated地区,导致误导的基因表达模式(75年]。从这一事实推理,简历治疗的表达的影响sod-3可能是更好的存在所代表的数据而不是GFP强度。在任何情况下,这些结果值得进一步关注。

考虑到gst-4和hsp - 16.2应力诱导基因,我们测试了简历的影响这些基因的表达水平只有在轻微的氧化应激。一剂20μM胡桃酮之前报道了我们和其他研究小组作为一个温和的氧化应激刺激,就是能强烈诱导的表达gst-4::GFP和hsp - 16.2::绿色荧光蛋白(37,39,70年,73年]。因此,在这项研究中,蠕虫juglone-induced应力下显示GFP强度强,未经处理的蠕虫(图中几乎检测不到6(一))。简历治疗的荧光强度降低gst-4::GFP (CL2166)和hsp - 16.2::GFP (TJ375)剂量依赖性的方式(数字6 (c)和6 (d))。在200μg / mL,简历的表达减少gst-4::绿色荧光蛋白的 和hsp - 16.2::绿色荧光蛋白的 ,相比胡桃酮控制( )。代表生活蠕虫的荧光图像的量化分析gst-4和hsp - 16.2可以在补充信息(数据吗S4和S5)。

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图6
的影响Caryocar仁果壳(CV)热休克蛋白16.2 (hsp - 16.2)、谷胱甘肽年代转移酶4 (gst-4)表达在温和的氧化应激,诱导剂量的20倍μM胡桃酮。(一)代表CL2166的图像(gst-4::GFP)和TJ375 (hsp - 16.2::GFP)蠕虫。(b)相对的mRNA水平gst-4和hsp - 16.2治疗和胡桃酮治疗野生型蠕虫。(c)gst-4::绿色荧光蛋白表达水平。(d)hsp - 16.2::绿色荧光蛋白表达水平。(e)相对gst-4信使rna水平的野生型蠕虫。(f)相对hsp - 16.2信使rna水平的野生型蠕虫。数据是代表三个独立的实验。表达绿色荧光蛋白表达水平 ( ,相比胡桃酮)。相对mRNA水平作为意味着折叠相对mRNA水平相比 ,归一化到cdc-42作为参考基因( , ,相比胡桃酮)。

胡桃酮也增加了的表情gst-4和hsp - 16.2在野生型蠕虫在转录水平。的表达gst-4和hsp - 16.2分别增加了8.5倍和9.3倍,相比,未经处理的控制(图6 (b))。两个基因,GFP强度与相对mRNA表达水平(数据一致6 (e)和6 (f))。在蠕虫受到相同剂量的胡桃酮和200年μg / mL的简历,gst-4和hsp - 16.2表达下降到0.33和0.17倍,分别相比胡桃酮治疗( )。

GST-4二期解毒酶,催化一些外生和内生的接合疏水亲电试剂与谷胱甘肽的形式,导致活性氧的解毒和异型生物质化合物(76年]。hsp - 16.2作为分子伴侣蛋白,结合部分变性蛋白质,避免蛋白质聚合。膳食抗氧化剂抑制应激的能力编码这些蛋白的基因表达被广泛解读为证明他们减少氧化应激的能力秀丽隐杆线虫(38,77年- - - - - -79年]。因此,以上的差别,对这些gst-4和hsp - 16.2引起简历进一步证实了提取的保护能力秀丽隐杆线虫从氧化应激,大概从可能引起的损害。

3.3.3。寿命延长

几项研究在植物提取物含有多酚和/或皂甙报告之间的关联(压力阻力和延长寿命的80年- - - - - -85年]。简历改善氧化应激状态秀丽隐杆线虫在另一组试验中,我们测试了它对野生型蠕虫的寿命的影响。提取显著诱导浓度测试(图寿命延长7(一))(表4)。在200μg / mL,最大扩展观察,简历增加野生型蠕虫的中位数生存于23日至27日d(17.29%)相比,未经处理的控制( )。考虑到前面提到的研究,它是合理的假设简历延长的寿命秀丽隐杆线虫由于其整体抗氧化活性。

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图7
野生型(a)和突变蠕虫的寿命daf-16(b)和skn-1(c)处理Caryocar仁果壳(简历)。寿命表示为代表的生存比例至少三个独立的实验。
表4
均值和中位数的野生型(N2)和突变蠕虫的寿命daf-16(CF1038)和skn-1(EU1)处理Caryocar仁果壳(简历)。

澄清的作用DAF-16和SKN-1 CV-mediated寿命扩展,我们调查的影响200μg / mL的简历在转录因子的突变蠕虫的寿命。简历未能扩展两个突变体的寿命(数字7 (b)和7 (c))(表4)。基于这些结果,我们可以推断,简历延长秀丽隐杆线虫寿命在DAF-16 SKN-1依赖的方式。

而绝大多数的研究证实增加压力宽容和延长寿命之间的关系,越来越多的证据表明,对抗氧化应激本身不完全解释抗氧化剂延长寿命的机制(86年]。在某种程度上,我们的研究是符合这个证据。首先,简历治疗没有延长寿命daf-16和skn-1突变体,但显著提高了氧化应激状态减少活性氧的水平和增加生存的致命剂量的胡桃酮。此外,增强抗压力和延长寿命的最可能发生的不同的作用机制。压力抵抗显然不是严格依赖DAF-16 SKN-1,尽管它涉及DAF-16的激活和upregulation的直接目标,sod-3。相反,需要DAF-16和SKN-1 CV-mediated延长寿命的研究,证实IIS的参与信号的观察效果。

3.3.4。摄食行为、开发和繁殖

饮食限制是最好的干预措施来延长寿命和压力阻力的特征秀丽隐杆线虫(87年]。简历治疗在最高浓度测试并不影响细菌生长没有影响蠕虫的摄食行为,评估通过细菌清除率。蚯蚓处理200μg / mL的简历显示类似的食物摄入模式的未经处理的蠕虫(图中可见8(一个))。这个结果提示我们排除饮食限制的机制,通过简历提高压力阻力和延长寿命秀丽隐杆线虫。

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图8
的影响Caryocar仁果壳(CV)摄食行为,发展,和繁殖的野生型蠕虫。(一)大肠杆菌OP50增长和食物摄取的细菌清除率。(b)身体的野生型蠕虫成年的第一天。(c)窝大小。数据是代表三个独立的实验。细菌生长和摄入了褶皱的吸光度计算天0。体面积表示为百分比比未经处理的控制( )。窝大小代表数量的卵虫生殖期间( )。

根据可弃置躯体论,在老化过程中,生物体中各种生理过程之间如何分配他们的代谢资源努力生长,生存和繁殖88年]。如果更高的能源投入寿命扩展(生存),精力充沛的资源分配主要为维持细胞内稳态(如抗氧化防御,核酸修复系统,和蛋白质)造成损害的身体生长和繁殖。简历中提取富含多酚,以前扩展秀丽隐杆线虫寿命符合可弃置躯体论(89年]。评估心血管治疗是否会影响生长和/或繁殖,我们测量的影响蠕虫的身体区域和窝大小。简历200μg / mL并不影响身体大小的野生型蠕虫也每日卵虫的数量,与未经处理的蠕虫(数字8 (b)和8 (c))。显然,这些结果排除可支配体细胞作为解释简历中促进长寿的能力秀丽隐杆线虫。

EGCG、多酚与没食子酸的一部分结构,一直找到改善压力阻力和延长寿命秀丽隐杆线虫(62年,90年- - - - - -92年]。由于这一背景下,它被用于作为一个积极的控制在这个研究。EGCG和简历显示同样的结果;既减少了细胞内ROS水平救了致命剂量的胡桃酮蠕虫,激活DAF-16,下调逆境应答基因(hsp - 16.2和gst-4),和扩展寿命DAF-16 SKN-1-dependent方式。

我们最好的知识,从多酚在简历初步确认,只有没食子酸和鞣花酸以前在调查秀丽隐杆线虫,关于他们的假定的抗氧化剂和lifespan-promoting效果。在一项研究中比较几个多酚延长寿命的机制,扫罗et al。89年证明了没食子酸(100 - 300μM)和鞣花酸(50μ米)能够显著延长野生型蠕虫的寿命再辅以生活细菌(如在本研究中执行),但未能增加氧化应激下生存。在浓度更高,没食子酸没有毒性,而鞣花酸表现出毒性作用,减少蠕虫的寿命在基底和氧化应激条件下。根据作者,高卢和鞣花酸的lifespan-promoting活动似乎并没有与他们的抗氧化性能。显然,鞣花酸可能不仅通过激效机制,而且热量限制模仿,因为它影响秀丽隐杆线虫通过chemorepellent摄食行为活动。这对简历提取效果没有被观察到。类似于我们的结果,蠕虫的生长和繁殖没有显著影响,表明高卢和鞣花酸,不像其他多酚类物质,不采取行动符合可支配体细胞理论。

另外两个研究,鞣花酸,在同一浓度之前测试,未能扩展野生型蠕虫的寿命(93年,94年]。Ryu et al。93年]此外显示urolithin的能力,鞣花酸的消化代谢产物,大幅延长的寿命秀丽隐杆线虫(45.4%)和由mitophagy调节线粒体功能。这些观察结果表明,未来hydrolysable单宁的消化代谢产物的研究,而不是他们的代谢前体,可以提供重要的见解的单宁酸的抗氧化和抗衰老的潜在植物提取物对人类健康。

关于皂苷含量,没有一个确定的三萜皂苷的简历还没有被调查。然而,一个孤立的三萜皂苷人参(95年),一个甾体皂苷芦笋racemosus(96年),和植物提取物特别丰富的三萜皂苷(97年,98年)以前报道提高压力阻力和延长寿命秀丽隐杆线虫。研究马吉德et al。(50),皂甙仅占总成分的0.5%的甲醇提取piquia贝壳。自皂甙能促进跨细胞膜极性化合物的运输,如果没有生物活性,它们可能有助于提高简历的生物活性化合物的生物利用度99年]。

当然是需要更多的研究来澄清这化合物,化合物或组合,负责简历施加的抗氧化和抗衰老的活动秀丽隐杆线虫。尽管如此,我们假设自由高卢和鞣花酸的存在可能是行列式的生物活性在此报道。这些酚酸具有低分子量,因此可能比hydrolysable单宁生物,包括高聚合化合物裂解成酚酸在肠道被吸收。

4所示。结论

综上所述,我们的结果表明潜在的piquia壳膳食补充促进压力阻力和延长寿命秀丽隐杆线虫。这些影响与独特的作用机制。改善氧化状态和提高抗juglone-induced DAF-16和SKN-1氧化应激并没有严格的要求,而piquia-mediated寿命扩展显示是依赖于两个转录因子。

在一个场景中增加对延缓衰老的干预措施的需求,我们的研究强调了水果的低估了潜在浪费作为生物活性化合物的来源,这可能是对生产的抗衰老的膳食补充剂或其他应用程序在一个工业规模。piquia外壳的具体案例,进一步的研究需要使用脊椎动物生物模型来演示其外壳是否有资格作为保健品。这样的研究应该解决消化后提取的生物利用度,其安全性,特别考虑的潜在毒性鞣花鞣质和皂甙的双重角色antinutrients或吸收增强剂。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

核磁共振,H.P., and M.W. conceived and designed the study. M.R. and H.P. performed experiments and analyzed data. P.W. performed LC-MS/MS analysis and analyzed data. E.L. collected the plant material and performed the extraction. M.R. wrote the original draft. M.W. supervised the study, administrated the project, and acquired the funding. All authors read, reviewed, and edited the manuscript and approved the submitted version.

确认

核磁共振被Cusanuswerk-Studienforderung财务支持。秀丽隐杆线虫菌株所提供的公司治理文化,这是由美国国立卫生研究院资助的科研基础设施项目办公室(P40 OD010440)。我们承认金融支持德意志Forschungsgemeinschaft资金计划内开放获取出版、巴登-符腾堡州科技部,研究,和艺术,Ruprecht-Karls-Universitat,海德堡。

补充材料

图S1:代表N2的荧光图像,CF1038, EU1, VC475蠕虫活性氧积累的量化分析。图S2:代表CF1553蠕虫的荧光图像的量化分析sod-3::GFP在基底应力条件下的水平。图S3:代表CF1553蠕虫的荧光图像的量化分析sod-3::GFP在juglone-induced氧化应激水平。图S4:代表CL2166蠕虫的荧光图像的量化分析gst-4::GFP在juglone-induced氧化应激水平。图S5:代表TJ375蠕虫的荧光图像的量化分析hsp-16::GFP在juglone-induced氧化应激水平。(补充材料)