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研究文章|开放获取
李张Xuejun Wang Mengwen冯,郝张贾许,晶晶叮,菱镁Zijie Cheng钱, ”Peptidomics分析揭示肽PDCryab1抑制Doxorubicin-Induced毒性”,氧化医学和细胞寿命, 卷。2020年, 文章的ID7182428, 23 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/7182428
Peptidomics分析揭示肽PDCryab1抑制Doxorubicin-Induced毒性
李张
,1
Xuejun王,1
Mengwen冯,1
郝张,1
贾许,1
晶晶鼎,2
Zijie程,1
和
菱镁钱1,3
1心脏病学系,南京医科大学第一附属医院210029年南京,中国
2部门惯例、同仁医院、上海交通大学医学院长宁区仙霞路1111号,200336年上海,中国
3同仁医院心内科,上海交通大学医学院,长宁区仙霞路1111号,200336年上海,中国
文摘
阿霉素由于毒性存在剂量依赖的相关性(阿霉素)是有限的。Peptidomics蛋白质组学是一个新兴领域,吸引了太多的关注,因为它可以用来研究内源性肽的组成和内容在不同的生物体。内源性肽参与各种生物过程和候选药物开发的重要来源。探索相关肽变化DOX-induced毒性,并找到与心血管功能肽,肽的表达谱相比我们的心DOX-treated和控制老鼠的质谱分析。结果表明,在236年微分肽强力霉素治疗,其中22例调节,214人表达下调。接下来,我们预测,31日肽可能心血管功能进行每个前体蛋白的生物信息学分析领域,生物活性肽的预测评分,和每个肽与心脏事件的相关性。最后,我们证实肽(SPFYLRPPSF) Cryab可以抑制心肌细胞凋亡,减少活性氧的产生,改善心脏功能,改善心肌纤维化在体外和体内。总之,我们的结果表明,肽的表达谱在强力霉素治疗和心脏组织变化显著,这些差异表达肽有潜在的心血管功能。我们的研究表明一个新方向DOX-induced治疗的毒性。
1。介绍
阿霉素(阿霉素),一个典型的广谱、高效的抗肿瘤药物,广泛用于临床治疗各种恶性肿瘤,如乳腺癌,淋巴瘤,白血病(1]。然而,它的广泛临床应用受到累积毒性存在剂量依赖的相关性在多个器官,尤其是毒性(2]。研究表明,阿霉素可引起慢性心力衰竭时累积临床剂量超过400 - 700毫克/米2(成人)或300毫克/米2(孩子),这就极大地限制了临床治疗剂量的阿霉素(3]。目前发现的主要机制DOX-induced毒性氧化应激和细胞凋亡的心肌细胞4,5]。阿霉素可以诱导心肌细胞凋亡,可发展为慢性心力衰竭,通过大量的活性氧的生成和细胞钙超负荷心肌组织由于其高度的亲和力和倾向于积累在心肌细胞(6,7]。目前,除了dexrazoxane没有药物可以利用临床预防或治疗DOX-induced毒性。因此,为了找到一个干预策略,有必要探讨阿霉素引起的毒性机制从一个新的视角。
Peptidomics,蛋白质组学的一个新兴领域8),是一种方法,综合分析各生物样品的质谱肽(9,10]。它可以用于系统、定性和定量研究内源性肽的组成和内容在生理或病理条件下的生物。随着peptidomics的发展,3-50组成的一类小分子多肽氨基酸被发现在各种生命活动的重要参与者,包括细胞凋亡(11),免疫调节12],细胞分化[13),神经系统调节(14],和繁殖调控[15],因为他们的优势,比如容易合成、分子量小、无毒的代谢物,容易进入细胞,他们已经成为一个最喜欢的领域的新药研究和开发(16]。Humanin, 24个氨基酸肽,由开放阅读框编码线粒体16 s rRNA地区和显示心肌细胞保护和抗氧化剂和antiapoptosis属性(17,18]。Humanin可以增强保护作用的dexrazoxane DOX-induced毒性,这可能表明其作为佐剂dexrazoxane减少DOX-induced毒性(19]。Exenatide预处理抑制DOX-induced生产活性氧和细胞凋亡在心肌细胞通过自噬的upregulation和改善心脏功能障碍,表明其治疗潜力防止DOX-induced毒性(20.]。已组织Apelin是一种内源性肽配体的受体的激活可以防止心脏成纤维细胞和胶原蛋白的生产通过抑制鞘氨醇激酶1。此外,利用组织apelin反应性纤维化阶段可以预防心肌结构重构和心室功能障碍(21]。因此,考虑到肽,我们可能会发现新的线索保护DOX-induced毒性。
在这项研究中,我们建立了一个由连续注射阿霉素毒性模型。Nano-LC-MS / MS质谱法是利用探讨内源性肽的组成的动态变化在小鼠心脏组织和筛选潜在功能肽DOX-induced相关毒性。随后,我们分析了差异表达肽用生物信息学方法和预测31肽可能心血管功能。最后,肽来源于Cryab验证了对抗心肌细胞凋亡,减少活性氧的生产。本研究使用peptidomics作为切入点来探讨的方法预防或改善阿霉素引起的毒性,为研究提供新想法DOX-induced毒性。
2。材料和方法
2.1。老鼠
六个雄性C57BL / 6小鼠体重16 - 20 g从上海购买满足实验动物有限公司有限公司,南京医科大学SPF实验动物中心。实验开始后一个星期动物被购买。实验动物被随机分配到两组:对照组和阿霉素组,每组12只老鼠。阿霉素组小鼠腹腔注射5毫克/公斤阿霉素注射一周总共4的累积剂量20毫克/公斤22),而对照组腹腔注射同等体积的生理盐水。所有动物实验进行了按照指南的护理和使用实验动物发表的美国国立卫生研究院(NIH出版物85号- 23,1996年修订),由南京医科大学动物实验伦理委员会(中国南京)。
2.2。超声心动图和组织学的决心
阿霉素或盐水管理后,动物是维持2周;老鼠和1.5%异氟烷麻醉,允许自然呼吸,然后进行超声心动图检测小鼠心脏功能。高分辨率小动物超声成像系统(Vevo 3100)是用于获得M-mode超声波测量注射阿霉素组和正常组的老鼠。主要测量指标包括射血分数(EF)和部分缩短(FS)。其他超声心动图参数包括左心室收缩末期直径(LVEDs)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期前壁厚度(LVAWs)和左心室舒张末期前壁厚度(LVAWd)。此外,左心室部分缩短(FS %)计算 ;左心室射血分数(EF %)计算 , ,和 。由二氧化碳窒息后小鼠安乐死,心室组织收集并立即在4%多聚甲醛固定48小时。样本脱水,石蜡包埋,分为5μ米厚片上滑动切片机(徕卡、胡桃胡同、德国)。然后,心肌部分脱蜡、水化和沾着马森的三色的,在显微镜下观察心肌纤维化的程度。蓝色的胶原染色使用ImageJ量化软件(版本1.52吨、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)。
2.3。肽提取
加Tris-HCl心脏组织样本的体积比1:3,加热,煮10分钟,然后在冰水浴冷却,然后被超声波在100 Hz超过5 s, 5 s和超声破碎法的间隔为2分钟。然后,最后1 M冰醋酸浓度添加到样品管,和涡旋振荡进行了2分钟。然后,乙腈与最终的浓度增加了约50%。样品管在离心机 在4°C 10分钟;之后,上层清液被转移到一个干净的EP为冷冻干燥管。接下来,添加80%的丙酮溶液,漩涡,震动,在水浴ultrasonicate 2分钟和4°C,高速离心液 30分钟,然后取上层清液转移到一个干净的EP为冷冻干燥管。最后,增加200μl 0.1%的组织解决方案再溶解和去除盐与C18示例加载80μg,冷冻干燥,备用。
2.4。LC / MS和肽识别
我们认为老鼠很小的核心。为了使样品质量检测到质谱更充分的,我们用四只老鼠的心混合到一个样本。四个强力霉素治疗的老鼠心脏组织混合作为一个强力霉素样品和4个正常老鼠心脏组织混合作为一个控制样本,共三组阿霉素和三组控制。缩氨酸被确定通过问Exactive nano-LC-MS / MS +质谱仪(热)与LC1000夫妇。溶剂(Milli-Q(微孔、Billerica MA)与0.1%的甲酸和2%的乙腈水)和溶剂B(90%与0.1%甲酸乙腈)用于色谱分离。肽和5%溶剂筛选了B 5分钟300 nl /分钟的速度,5 - 40%溶剂B 65分钟,40 - 80%溶剂B 1分钟,80%溶剂B为4分钟,然后5%溶剂B / 20分钟。Q Exactive加(热费希尔)中执行一个information-dependent数据采集模式,使MS和MS / MS收购之间自动切换。女士光谱得到的质量范围350 - 2000 m / z。Xcalibur软件(热科学、版本3.1.66.10)被用于自动峰鉴别,10 s动态排斥,串联质谱分析排名前20的前体蛋白离子的30%归一化碰撞能量。确定多肽的强度计算MaxQuant label-free量化软件(版本1.6.6.0)和使用。
所有MS / MS数据分析MaxQuant软件,和UniProt_mouse数据库(UniProt释放2019 _11)是基于非特异性消化技术的搜索。碎片离子的质量公差MaxQuant 0.050 Da和父离子为10.0 PPM。氧化蛋氨酸被指定为一个变量修改。选择标准的差异表达肽的褶皱变化大于2值< 0.05(学生的 - - - - - -测试)。
2.5。生物信息学分析
肽等电点(π)和分子量(MW)获得的信息在线(https://web.expasy.org/protparam/)。首先,UniProt数据库(http://www.uniport.org/)被用来找到微分肽的来源。6.8功能注释工具大卫生物信息学资源(https://david.ncifcrf.gov/)被用来阐明的潜在功能的前体蛋白鉴定肽生物过程,分子功能,细胞组件类别的基因本体论(去)注释和KEGG通路。第二,微分肽的前体蛋白的关系与各种心血管疾病和细胞凋亡进行了分析使用GeneAnalytics网站(http://geneanalytics.genecards.org/)和Cytoscape 3.5.1软件。第三,生物活性肽的预测通过肽士兵23,24)(http://bioware.ucd.ie/罗盘/ biowareweb /,士兵的分数超过0.5显示可能的活动)为了找到潜在的肽。蛋白质相互作用分析了使用字符串的网站(https://string-db.org/版本:11.0)和Cytoscape 3.5.1软件。不同种类的氨基酸序列进行了分析使用蛋白质数据库在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/),结果与DNAMAN(9.0版)软件。
2.6。多肽合成和管理
以下肽序列合成实验:PDCryab1: RKKRRQRRR-SPFYLRPPSF, PDCryab2: RKKRRQRRR-SPFYLRPPSFLR, PDCryab3: RKKRRQRRR-SPFYLRPPSFLRAPS, PDCryab4: RKKRRQRRR-TSLSPFYLRPPSFL,和争夺肽PDCryab1: RKKRRQRRR-LSFRFPSPYP。我们使用争夺肽作为控制肽,与Cryab共享相同的氨基酸,但作为一个争夺肽测序。
RKKRRQRRR序列是一个cell-penetrating 9个氨基酸组成的肽在hiv - 1乙(49-57)。所有的肽的纯度是95%以上。上海的多肽合成肽生物科技有限公司(上海,中国)。肽水晶在无菌水溶解获得10毫米和稀释的存储解决方案相对应的最终浓度实验。细胞的实验中,肽被添加到文化上层的强力霉素治疗前2小时。
2.7。细胞培养和实验设计
鼠心肌细胞的H9c2细胞系是购自上海生物科学学院的细胞库。H9c2细胞培养在无菌孵化器(37°C, 5%的公司2)与high-glucose DMEM补充10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素。H9c2细胞每2天,亚文化是在良好的条件在实验中使用。
初始细胞实验,细胞被分配到6组:对照组(I),(2)阿霉素(1μ米)治疗组(阿霉素),(3)强力霉素和PDCryab1 (50μ米)(25,26]cotreatment集团(阿霉素+ P1) (IV)强力霉素和PDCryab2 (50μ米)cotreatment集团(阿霉素+ P2), (V)强力霉素和PDCryab3 (50μ米)cotreatment集团(阿霉素+ P3)和(VI)强力霉素和PDCryab4 (50μ米)cotreatment集团(阿霉素+ P4)。此外,对于随后的细胞实验,细胞被分配给以下组:对照组(我),(2)PDCryab1 (50μ米)治疗组,(3)阿霉素(1μ米)治疗组(阿霉素),(IV)强力霉素和PDCryab1 (10μ米)cotreatment组(10),(V)强力霉素和PDCryab1 (20μ米)cotreatment组(20)和(VI)强力霉素和PDCryab1 (50μ米)cotreatment组(50)。这些治疗24小时后,收集细胞进行适当的分析。
2.8。分析细胞生存能力
细胞生存能力是决定细胞计数kit-8 (CCK-8)工具包(Dojindo分子技术,Inc .,熊本,日本)根据以下步骤。的亚文化H9c2细胞被播种在96 -孔板的密度 细胞/好,到达依从性阶段,细胞治疗用药物如上所述。10毫升CCK-8试剂的添加到每个避光和维护在37°C的孵化器。孵化2小时后,光吸收的强度在450 nm波长测量标。
2.9。免疫印迹分析
H9c2细胞中的蛋白质提取与裂解缓冲(包括PMSF里帕和1%)和由BCA量化分析工具(23229;热费希尔科学)。蛋白质样本与1 x SDS混合加载缓冲区和变性沸腾5分钟的95°C。在冰上冷却4分钟后,样本的蛋白质分离10% sds - page凝胶,然后转移到硝化纤维素膜(美国微孔)。被屏蔽后5%脱脂牛奶在室温为1.5小时,特定的抗体,即anti-PARP (1: 1000, # 9542, CST), anti-caspase3 (1: 1000, # 9665, CST),β肌动蛋白(1:2000,# 4970,CST),和antitubulinα/β(1:2000,# 2148,春秋国旅),孵化了膜在一夜之间在4°C。膜是洗一次TBST缓冲5次每次5分钟。蛋白表达是由图像实验室软件定量分析(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。免疫印迹结果是由微管蛋白或规范化β肌动蛋白。
2.10。检测活性氧、SOD和MDA
活性氧(ROS)检测活性氧的检测设备(Beyotime,中国)根据标准程序。H9c2细胞通道6-well板的密度 细胞/。达到80%的细胞融合后,细胞治疗药物为指定的时间。DCFH-DA荧光探针被稀释到10μ在没有血清DMEM。6-well板介质被转移到一个干净的离心管保护,和1毫升的稀释DCFH-DA荧光探针是添加到每个和孵化37°C在黑暗中20分钟。孵化后,上层的丢弃,血清DMEM培养基的细胞被洗了两次,然后用PBS洗两次。ROS荧光强度的细胞被倒置荧光显微镜观察和量化ImageJ软件。SOD和MDA测定试剂盒(南京建成Biocompany)是用于检测细胞上清液中SOD和MDA水平一直保留根据协议。
2.11。线粒体膜电位
JC-1线粒体膜电位测定工具包(Beyotime,中国)是用于分析线粒体损伤根据制造商的指示。简而言之,这些细胞被洗PBS和孵化与JC解决方案10分钟37°C。然后,这些细胞被洗和稀释缓冲又分析了激光扫描共焦显微镜。
2.12。TUNEL分析
细胞被播种( 细胞每)6-well盘子。阿霉素治疗后,这些细胞被洗两次与PBS和4%多聚甲醛固定。凋亡细胞被可视化与TUNEL染色根据制造商的协议(Promega)。TUNEL荧光强度/ DAPI荧光密度是用来计算阳性细胞的百分比,和密度是评估使用ImageJ软件1.26(韦恩Rasband、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)。
2.13。LDH释放
LDH水平检测LDH释放试验装备(Beyotime,中国)。反应的解决方案是根据制造商的指示准备的。细胞上清液或血清(120μ信用证)收集和混合反应的解决方案(60μ信用证),然后混合物被添加到96孔板。这些细胞被包裹在锡箔和孵化瓶在RT为30分钟。最后,吸光度检测标在490 nm波长。
2.14。组织学染色
心被收获,并立即在4%多聚甲醛固定48小时。样本脱水,石蜡包埋,分为5μ米厚片上滑动切片机(徕卡、胡桃胡同、德国),和小天狼星红染色苏木精和伊红())。yocyte横向区域测量通过荧光素isothiocyanate-conjugated编剧(L4895;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)染色。定量数字图像分析系统(Image-Pro + 6.0)是用来测量心肌细胞的横截面积从图像捕获从异硫氰酸荧光素(FITC)共轭麦芽凝集素- (WGA)(表达载体,热费希尔科学)染色部分。
2.15。实时聚合酶链反应
从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(热费希尔科学)。核糖核酸的浓度决定通过测量吸光度比260/280 nm使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(热科学)。反转录的RNA进行使用PrimeScript™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(RR047A;豆类、东京、日本),分析了互补中存在使用SYBR®预混料交货Taq™(RR420A;豆类、日本东京)。数据归一化到GAPDH的水平,并进一步分析了使用2−ΔΔCT方法。
2.16。统计分析
实验数据和统计图表分析GraphPad棱镜8软件。所有的数据呈现的 (SD)。统计测量的差异与一个未配对的双向的学生 - - - - - -与Bonferroni调整为多个测试或双向方差分析比较。当值< 0.05,差异被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。Peptidomics研究过程使用老鼠心脏组织
我们使用雄性C57BL / 6小鼠构建动物模型腹腔内注射阿霉素的毒性,然后收集心脏组织中提取肽进行质谱分析。流程示意图如图1(一)。Dox-induced心脏功能障碍在阿霉素注射组显著下降,这是由EF和FS(减少表示数字1 (b)和1 (c))。马森的染色结果显示心脏纤维化改变,就是明证心肌纤维断裂和减少心肌细胞区域(数据1 (d)和1 (e))。因此,我们建立了一个由阿霉素注射毒性模型。
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3.2。识别相关的微分肽表达谱DOX-Induced毒性
质谱结果显示2945检测肽,其中236是差异表达(值< 0.05和褶皱变化≥2)(柔软。表1)。在DOX-induced毒性组,22肽调节和214肽表达下调(图2(一个))。热图显示显著差异cardiotoxic肽概要文件的组织接受阿霉素和正常心脏组织(图2 (b))。47个抗菌肽表达只在对照组和5肽表达在强力霉素组(柔软。表2)。三肽具有7个不同的前体蛋白在柔软的上市。表3。我们发现不同的肽长度的分布相对较大,主要集中在两个范围:上行线,22日至23日的氨基酸(图中2 (c))。我们也探讨了分子量(MW)和等电点(PI)差异表达的肽,发现差异表达的MW肽是分布在0.8和2.8 kDa,表达下调的肽主要集中在1.0 - -2.0 kDa范围和调节肽集中在0.8 - -1.0 kDa(图-1.8和1.2 kDa范围2 (d))。等电点分析表明,总体来说,π的差异表达肽主要是4 - 7和π(图8 - 10范围2 (e))。的分配调节和表达下调与肽,肽是一致的和没有显著差异之间的分配调节和表达下调组。此外,我们分析了相关性的分布微分肽MW和π。附近的肽主要是集群分成四组:π4π6π8,π(图102 (f))。
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3.3。分析四个乳沟网站差异表达的肽
基于肽描述数据,我们分析了c端和差异表达肽氨基端乳沟的场所,主要包括以下四个乳沟网站:c端前肽,氨基酸的氨基端氨基酸的肽,c端氨基酸的肽,和随后的肽的氨基端氨基酸。调节肽组,亮氨酸(L)是最丰富的前肽,氨基酸的糖基丙氨酸(A)是最丰富的氨基酸在确定的N端肽,丙氨酸(A)和亮氨酸(L)是最丰富的氨基酸的糖肽,和天冬酰胺(N)是最丰富的氨基酸在随后的N端肽(图3(a))。表达下调组,最丰富的氨基酸在上面的四个乳沟网站蛋氨酸(M),丙氨酸(A),亮氨酸(L)和丙氨酸(A),如图3(b)。236年的四个乳沟网站肽调节和表达下调群体是不同的。
3.4。生物信息学分析
预测236年的势函数差异表达肽,我们去执行路径分析他们的前体蛋白。分析结果显示分子功能,生物过程,细胞蛋白质(数据差别在对这些组件4(一)- - - - - -4 (c))。有趣的是,我们发现表达下调的蛋白质主要是与聚(A) RNA绑定,运输,和线粒体功能。表达下调的蛋白质分析显示跨膜转运活动,ATP合成、线粒体呼吸链(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。KEGG路径分析表明,微分的前体蛋白肽主要是参与氧化磷酸化和代谢信号通路,是心肌损伤的发生和发展密切相关(图5(一个))。接下来,我们分析了交互的网络这些微分肽的前体蛋白使用字符串的网站(https://string-db.org/版本:11.0)。我们发现多个交互网络,蛋白质相互作用网络的主要在线粒体氧化磷酸化(图有关5 (b))。
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3.5。预测心肌保护肽
首先,我们试图确定的前体蛋白差异表达肽与心血管疾病有关,氧化磷酸化,并通过GeneAnalytics网站(心肌细胞凋亡http://geneanalytics.genecards.org/)和Cytoscape 3.5.1软件。前体蛋白和各种心血管疾病之间的相关性如图所示6(一)。前体蛋白之间的相关性和心肌病如图6 (b)。前体蛋白与氧化磷酸化和心肌细胞凋亡相关数据所示6 (c)和6 (d)。接下来,我们使用了UniProt数据库(https://www.UniProt.org/)研究差异表达的功能肽及其前体蛋白质和肽士兵(http://bioware.ucd.ie/罗盘/ biowareweb /,士兵的分数超过0.5显示可能的活动)的概率预测差异表达参与了生物活性肽。最后,我们筛选31差异表达肽可能心肌保护作用(表1)。热图显示小的组内差异31肽和大型行为活动组(图之间的区别6 (e))。
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3.6。初步的功能肽来源于Cryab探索
研究表明,Cryab蛋白在心肌保护中发挥着重要作用。首先,我们验证了蛋白质水平Cryab之前和之后的强力霉素治疗。我们的结果表明,蛋白质含量Cryab强力霉素治疗后显著降低(图7(一))。因此,我们不知道是否有可能有一个保护作用,打击关键肽。在31日预测肽,六肽来自Cryab和强力霉素组中表达下调。因此,我们选择四肽具有相对较高的士兵分数的初步功能与H9c2细胞实验:SPFYLRPPSF (45 - 54), SPFYLRPPSFLR (45-56) SPFYLRPPSFLRAPS(45-59)和TSLSPFYLRPPSFL (42-55)。我们叫这些肽PDCryab1-4(肽来源于Cryab)。随后,我们初步验证了这四个功能肽在H9c2细胞。我们证实了PDCryab1 (SPFYLRPPSF)肽可以显著提高DOX-treated心肌细胞(图的可行性7 (b))。分析PDCryab1各物种所示(SPFYLRPPSF)保护柔软。无花果。1。PDCryab1具有高度的同源性在不同的物种,特别是智人、鼠标、鼠属。HCD MS / MS的注释PDCryab1肽(SPFYLRPPSF)源自Cryab序列生成氨基酸45 - 54所示柔软。无花果。1 b。PDCryab1保护细胞免受DOX-induced细胞损伤,通过增加细胞生存能力和减少LDH释放(数字7 (c)和7 (d))。研究函数的PDCryab1 DOX-induced毒性,细胞凋亡和ROS生产水平进行了评估。结果表明,PDCryab1可以减少PARP和caspase3(图的激活7 (e))。同时,20μM PDCryab1也减少活性氧的生成(图7 (f))。除此之外,我们还提供了关于早期细胞凋亡和PDCryab1数据可以降低细胞凋亡率,所表示的线粒体膜电位和TUNEL分析(数据7 (g)和7 (h))。最后,我们验证了在上层清液SOD和MDA含量。我们的研究结果表明,PDCryab1明显减轻氧化应激,就是明证增加SOD和MDA含量降低(图7(我))。
(一)
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3.7。PDCryab1体内的功能分析
为了进一步研究PDCryab1的功能,我们建立了一个DOX-induced毒性模型。20毫克/公斤的累积剂量阿霉素(阿霉素)是管理通过4周注射ip(图8(一个))。阿霉素注射组的体重显著减少,而PDCryab1注射阿霉素(图期间废除了这一效应8 (b))。治疗PDCryab1显著改善了心脏功能,超声心动图分析(数据就证明了这一点8 (c)和8 (d))。我们还执行天狼星红染色,我们的研究结果显示,治疗PDCryab1缓解DOX-induced心脏纤维化(数字8 (e)和8 (f))。此外,我们验证了心肌细胞区域通过他染色,WGA的染色。我们的研究结果表明,干预PDCryab1改善DOX-induced心脏损伤,就是明证增加心肌细胞面积和减少LDH释放(数字8 (g)- - - - - -8 (j))。最后,心脏组织正在收获,以证实心脏标记,曾帮工和法国巴黎。我们的研究结果显示,治疗PDCryab1显著降低的mRNA水平曾帮工和法国巴黎,暗示PDCryab1(数据产生的有利影响8 (k)和8(左))。
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4所示。讨论
我们都知道,阿霉素广泛用于各种肿瘤的治疗是一个基本的化疗药物。然而,阿霉素引起的毒性已经成为一个越来越严重的问题,挑战许多心血管领域的专家(27]。尽管已经有许多研究DOX-induced毒性近年来,这个问题还没有被解决。到目前为止,我们使用peptidomics全面分析肽概要文件相关的变化DOX-induced毒性并成功地识别差异表达肽在心脏组织。通过分析这些差异表达肽的理化性质和生物信息学,我们提供新的见解的临床问题DOX-induced毒性。
在这项研究中,我们确定了总共236肽表达差异超过2倍的变化。这些肽少于25个氨基酸组成,分子量小于3.0 kDa,这表明肽识别在这项研究中都是有效的。许多这些肽起源于相同的前体蛋白,这吸引了我们的注意力。众所周知,大多数蛋白质肽是由解理,和蛋白酶卵裂过程中发挥关键作用的具体识别乳沟网站(28]。此外,不同的乳沟网站被蛋白酶将有一个很大的影响在裂解肽的生物功能29日]。我们的发现也表明,蛋白酶遵循特定规则的过程中蛋白质的乳沟。物理化学性质,包括肽长度、分子量、等电点、和乳沟网站,有利于我们选择潜在的肽。首先,脂溶的肽很容易进入细胞。第二,有很长的半衰期的肽细胞中稳定。第三,相对低肽长度很容易进入细胞。
通过生物信息学分析的微分肽,细胞组件这些肽富含线粒体内膜和线粒体呼吸链,和这些肽的生物功能丰富与ATP的合成和代谢。线粒体是阿霉素的主要目标细胞器在心肌细胞(30.]。一些研究表明,阿霉素优先积累在心肌细胞的线粒体,导致线粒体肿胀和线粒体功能障碍(31日,32]。路径分析结果表明,这些肽主要参与氧化磷酸化和代谢途径。在能量代谢,ATP是主要的能源供应复合体内,及其形成的主要机制是氧化磷酸化。阿霉素引起的线粒体能源供应下降会导致心脏代谢的变化。三磷酸腺苷和磷酸肌酸的水平的心DOX-treated老鼠下降,表明线粒体能量代谢下降(33]。此外,阿霉素可以抑制心肌葡萄糖的使用的同时减少机会的长链脂肪酸,这可能最终导致心肌能量代谢障碍的发展(34]。因此,衰减造成的心肌代谢变化阿霉素是一种策略来减轻DOX-induced毒性和这些肽可能扮演关键角色。
心肌细胞凋亡是一个重要的生物事件DOX-induced毒性(4]。研究发现,一些生物活性肽,如ICL1-9 [35]和pNaKtide [4,26),心肌细胞凋亡过程中发挥保护作用。在这项研究中,许多前体蛋白质差异表达的肽参与心肌细胞凋亡的调控,包括热休克蛋白beta 1 (Hspb1) [36),alpha-crystallin B链(Cryab) [37),热休克蛋白beta-6 (Hspb6) [38),肌动蛋白α心肌1 (Actc1) [39]。Cryab最丰富的小热休克蛋白在心肌细胞(sHSP),它可以对抗心肌缺血/再灌注损伤和对正常心脏功能至关重要40]。此外,Cryab可以抑制新生小鼠心肌细胞的凋亡治疗H2O2(37]。一些研究表明,肽通常发挥生物学作用类似的前体蛋白(41]。如表所示131的肽,我们预测活动,6来自Cryab,和所有的强力霉素治疗组中表达下调,结果符合上述理论。因此,我们推测这六肽可能参与调节Cryab在心肌细胞和可能Cryab一样的功能。有趣的是,肽来源于Hspb1都是调节和表达下调,而Hspb1被公认为一种蛋白质的保护作用。这些多肽的功能值得进一步的验证。如果调节肽也有心血管效应,肽是否具有相同的函数作为其前体蛋白需要进一步澄清。
在这项研究中,PDCryab1 (SPFYLRPPSF)是一个表达下调的肽强力霉素治疗组来自Cryab蛋白,不同物种之间具有较高的同源性,并没有被报道。我们先前的实验表明,PDCryab1可以抑制心肌细胞凋亡,减少活性氧的产生,改善心脏功能,改善心肌纤维化。虽然我们已经证实PDCryab1有心肌保护作用在体外和体内,对我们的研究仍有一定的局限性。例如,解理或修改的类型是否会影响PDCryab1的功能还有待验证。此外,具体机制PDCryab1发挥其生物学功能也特别重要,并将我们的未来研究的重点。
肽AEGPAAVTLAAPAFSRALNRQL强力霉素治疗组中表达下调。在sHSP域和交互的TGFB1I1地区Hspb1蛋白质。Hspb1可以抑制氧化应激引起的细胞凋亡和保护心肌36]。域是一个地区在一个蛋白质,有一个独立的结构和功能,和这个函数通常不依赖于其它地区的蛋白质分子。因此,肽位于域地区更有可能有独立的生物活性42]。AEGPAAVTLAAPAFSRALNRQL Hspb1领域中,它的预测生物活性指数为0.59(0.5以上),这表明它可能有凋亡的影响,可能是另一个治疗的目标DOX-induced毒性。此外,Hspb1可以与VEGF和转化生长因子(TGFB1I1)调节血管生成43),这种肽是在该地区,与TGFB1I1交互。我们推测,这种肽可能也发挥了未知在血管生成中的作用。
肽来源于Hmgb1也吸引了我们的注意力。其序列DPNAPKRPPSA (91 - 101)。高机动组框1 (Hmgb1)是一种dna结合蛋白核非组蛋白的蛋白质,扮演着一个重要的角色在心血管疾病的发生和发展44]。一般来说,被动释放Hmgb1坏死细胞和活细胞可以主动分泌某些病理条件下(45]。研究表明,阿霉素可显著提高Hmgb1在心肌细胞的表达水平,导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍,沉默Hmgb1可以从DOX-induced保护心肌毒性(45,46]。此外,Hmgb1也被证明是参与DOX-induced autophagy-related毒性和预计的生物标志物DOX-induced毒性(47]。然而,最近的一项研究表明,Hmgb1可能上调Hspb1的表达和减弱DOX-induced心肌病的心肌细胞凋亡48]。因此,Hmgb1无疑DOX-induced心肌细胞凋亡中起着重要的作用,但具体Hmgb1对心肌细胞凋亡的影响仍有待澄清。在这里,我们找到了一个肽来源于Hmgb1表达下调的强力霉素治疗组和高生物活性的预测评分。这种肽是位于地区cytokine-stimulating活动和磷酸化位点(100)。函数的说明这个肽不仅将有助于澄清具体Hmgb1对心肌细胞凋亡的影响,但也提供了一个新的干预策略DOX-induced毒性。
总之,我们使用peptidomics阐明机制DOX-induced毒性和探索毒性保护策略;236年成功筛选差异表达肽在这项研究中。通过生物信息学分析和实验验证,PDCryab1成为候选人对DOX-induced保护心肌细胞凋亡。我们的研究提供了一种新的方法治疗DOX-induced毒性。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
李张、王Xuejun和Mengwen峰进行了实验,分析数据,并写了手稿。郝张和贾许执行一些动物实验和生物信息学分析。晶晶鼎参与一些体外实验。Zijie Cheng和菱镁钱造成了研究设计和概念和监督项目。李张、王Xuejun和Mengwen冯贡献同样这项工作。
确认
本研究由国家自然科学基金支持的中国(81873540号,81570209),江苏省研究生研究和创新项目(没有。SJKY19_1356),临床前沿技术和关键项目的科技部门江苏省(没有。BE2019752)。
补充材料
补充图1:保护分析和HCD MS / MS肽PDCryab1的注释。(一)保护分析PDCryab1 (SPFYLRPPSF)在不同的物种。(B) HCD MS / MS注释的肽PDCryab1 (SPFYLRPPSF)源自Cryab生成氨基酸45 - 54。在20 ppm带注释的所有碎片离子。柔软。表1:236个差异表达肽和前体蛋白(阿霉素与控制)。柔软。表2:独特的肽的识别。柔软。表3:同一肽来源于几个前体蛋白质。(补充材料)
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