GelMA脂质体缓释褪黑素可减少成骨细胞凋亡，改善骨质疏松症患者的种植体骨整合

抽象的

骨量的减少周围的植入物是植入物松动的主要原因，特别是在绝经后骨质疏松的患者。在骨质疏松症，过度的氧化应激，从而导致成骨细胞凋亡，大大有助于异常骨重建。由松果体合成褪黑激素（MT）促进成骨细胞分化和骨形成和已被有效地用于对抗氧化应激。因此，我们推测成骨细胞凋亡氧化应激诱导即MT衰减，促进成骨骨质疏松，改善假体周围的骨量。此外，考虑MT的分布和代谢，其全身用药会需要大量的MT，增加药物的副作用的可能性，所以MT的局部用药比全身用药更有效。在这项研究中，我们构建了复合粘合剂，水凝胶系统（GelMA-DOPA @ MT）在局部区域带来持续的MT版本。此外，MT-减少细胞凋亡引起的氢过氧化物（H₂O.₂-)诱导氧化应激，恢复MC3T3-E1细胞成骨潜能。此外，种植体周围的成骨细胞凋亡明显减弱，在去卵巢(OVX)大鼠中观察到种植体周围骨量增加。总之，我们的结果表明GelMA-DOPA@MT可以抑制氧化应激引起的成骨细胞凋亡，从而促进成骨，改善假体周围的骨质量。因此，这种局部、持续的MT释放系统是解决骨质疏松患者植入物松动的合适人选。

1.介绍

当今社会的人口正在老龄化。在老龄化带来的健康问题中，骨质疏松已成为最严重的问题之一，引起骨科医师的关注[1-3.］.骨质疏松症是一种以骨量损失和骨微结构破坏为特征的代谢性疾病，导致骨骼脆弱，增加骨折风险[4.那5.]. 衰老引起的骨质疏松症会产生连锁反应；植入后，内固定螺钉和椎弓根螺钉出现不同程度的植入松动，导致植入失败[6.-10.］.因此，提高骨质疏松症病理条件下内固定的稳定性已成为骨科临床研究的重点和挑战。

目前临床上主要的治疗方法有使用扩径螺钉、传统抗骨质疏松药物、骨水泥注射等[11.-13.］.在这些方法中，系统抗尿精药物，例如双膦酸盐，DeNOSumab，雷洛昔芬和萜烯酮，用于增强骨质疏松骨内固定的强度[14.那15.］.临床观察表明，这种方法可以增加全身骨密度，但由于需要长期药物治疗，药物需要通过体循环到达作用部位，因此种植体局部骨质疏松状态并没有明显改善[16.那17.］.此外，通过增加内固定螺钉的直径和长度，可以加强骨质疏松椎体内固定，提高其疗效[18.那19.］.在严重骨质疏松患者中，当螺钉直径超过椎弓根横截面积的70%时，容易发生椎弓根爆裂骨折，因此该方法不能满足这些患者的临床需要。

褪黑激素(MT)是松果体分泌的一种重要的类固醇激素，临床应用广泛[20.］.具体地，MT目前广泛用于调节各种功能，例如生物节律和免疫系统，并施加抗氧化，抗氧化和抗肿瘤效应[21-24］.越来越多的证据表明，氧化剂的产生和细胞对氧化应激的反应与植入生物材料的命运密切相关。已经证实，骨质疏松症介导的活性氧(ROS)积累可能有害地影响骨再生，导致种植体骨结合受损[25]. 此外，最近关于MT对骨和牙齿等硬组织影响的研究引起了广泛关注[26那27］.根据这些研究，MT在调节骨形成和骨生长中发挥重要作用，显示出促进骨分化的潜力，并能减少氧化应激引起的细胞凋亡，发挥抗骨质疏松作用[26那28-30.］.此外，考虑到MT的分布和代谢，全身给药需要大量的药物，增加了药物副作用的概率，因此局部给药比全身给药更有效。此外，在移植体局部使用MT的体内实验很少。因此，MT要想在局部植入区发挥抗骨质疏松的作用，必须在长期的原位持续稳定地释放。

由于其优异的粘合能力和生物相容性，明胶甲基丙烯酰基 - 多巴胺（GELMA-DOPA）已广泛用于骨组织工程[31-33］.脂质体以其良好的生物相容性和良好的药物释放控制能力而闻名，已被广泛应用于各种类型的药物传递[34-36］.在这项研究中，我们结合GelMA-DOPA，其具有在潮湿表面上潜在的粘合剂的功能，以制造复合植入系统通过减少成骨细胞凋亡诱导骨质疏松状态的植入物的骨整合MT（方案1)．

2。材料和方法

2．1.GelMA-DOPA的制备与表征

2.1.1。制造GelMA-COOH

如前所述，凝胶是制造的[37］.Briefly, 4 g of GelMA was dissolved in 80 mL of PBS in a flask by stirring (200 rpm) at 50°C. Then, 2 mL of triethylamine and 2 g of succinic anhydride in 40 mL of DMSO were added to the GelMA mixture. The resulting mixture was stirred overnight at 50°C under the protection of Ar, diluted in 200 mL of PBS, and neutralized with 0.1 M HCl. The product was poured into a dialysis bag ( ）透析了大约一周。将得到的液体在-80°C冷冻过夜，然后冻干得到GelMA-COOH。

2.1.2。制造GelMA-DOPA

邻苯二酚基序是成功构建粘合材料的关键因素。将儿茶酚基序与GelMA结合[38], 1 g of GelMA-COOH was dissolved in 10 mL of MES buffer (50 mM, pH 5), and the resulting solution was ultrasonicated for 30 min to remove any air bubbles. Then, 0.2 g of EDC, 0.3 g of NHS, and 0.2 g of dopamine hydrochloride were added to the solution. This whole process was carried out under the protection of Ar, and the mixture was stirred overnight at 25°C. Then, the solution was dialyzed against 0.01 M HCl in deionized water utilizing a dialysis bag ( ）持续4天，然后用0.01中和 我是NaOH。将所得液体在-80℃下冷冻过夜，然后冻干以获得GelMA-DOPA。

2.2。水凝胶的制备与表征

2.2.1。水凝胶的制备

GelMA，GelMA-COOH，和GelMA-DOPA溶解在PBS中的20％浓度（ )，和2-羟基-4-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮以1％加入到该溶液（ ）作为光引发剂[39］.此外，在不同浓度为5％至20％的不同浓度下溶解在PBS中，向液体中加入1％光引发剂。将上述的预旋转溶液分别倒入定制的圆形模具中，直径为15mm，深度为5mm，然后通过紫外线（UV）光在6.9mW / cm处光敏。²d (360-480 nm) 10秒。采用与制备上述水凝胶相似的方法，构建不同浓度(5-20%)GelMA-DOPA和相同MT含量的复合水凝胶;得到的水凝胶被命名为5GelMA-DOPA@MT、10GelMA-DOPA@MT和20GelMA-DOPA@MT。

2.2.2。在复合水凝胶的体外释药

不同的复合水凝胶的药物释放行为进行了探讨，确定MT释放曲线。All of the drug-loaded composite hydrogels were immersed in PBS at 37°C and shaken at 100 rpm to simulate vitro release. The release medium was replaced by the same volume of fresh PBS at the set time points, and the samples were investigated by high-performance liquid chromatography (HPLC). The analysis was performed with an ODS column (100-5 C18 column, 那5.0 μM粒度，J＆K化学，Ltd，上海）在30°C。洗脱Mt，流动相由去离子水和甲醇（30：70 )．流速为1.0毫升/分钟，检测波长为277nm。

2.2.3。吸水率试验

为测定不同浓度、不同类型水凝胶GelMA-DOPA吸水能力，将制备的水凝胶进行冻干，获得冻干样品[40］.随后，这些样品称重（WO），浸渍在PBS中。在每个设定的时间点，所有的水凝胶称重（WT）;然后，被吸引到描述水凝胶的吸收水的能力的曲线。吸水率百分比计算由下式：

2.2.4。体外降解试验

根据先前报告的程序进行降解试验。简而言之，将制备的水凝胶浸入PBS中，并在37℃下孵育24小时以达到平衡溶胀状态。然后，称量溶胀的水凝胶，并将其初始质量记录为W0。将溶胀的水凝胶移动到37℃下在PBS的II型胶原酶（2U / ml）的溶液中孵育，同时在100rpm处振荡。在设定时间点，称量剩余的水凝胶，并将质量记录为WT并用于描述降解程度。

2.3。机械表征

2.3.1。压缩实验

柱状交联水凝胶37℃浸泡在PBS中，孵育24 h至水凝胶肿胀。不同浓度的GelMA-DOPA，浓度从5 - 20%不等( ）用等效力测试仪器以0.5 mm/min的速度压缩。GelMA, GelMA- cooh, GelMA- dopa和GelMA-DOPA@MT在20%时也用类似的方法进行了研究。利用线性区域内的所有斜率来确定不同水凝胶样品的压缩模量。

2.3.2。GelMA-DOPA胶粘剂特性研究

通过标准搭接剪切试验对GelMA-DOPA的粘接性能进行了研究。简单地说,200年μL的预交联溶液GelMA, GelMA- cooh, GelMA- dopa，或GelMA-DOPA@MT(所有这些预交联溶液浓度均为20%)应用于骨表面。第二根骨头的Ti侧与预交联液体接触，产生重叠(粘连)区域，约为 ．在UV照射10秒后，样品在PBS中浸泡2 h以创造潮湿的条件。然后，在湿条件下立即进行搭接剪切试验，直到50n测压元件以1mm /min的速度破坏。

2.4。凝胶 - 多帕的体外生物相容性

为了检验GelMA-DOPA及其衍生物的生物相容性，根据产品说明书，使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测定来定量评估生物相容性，并使用活/死测定来定性评估生物相容性。MC3T3-E1细胞(2000个细胞/孔)接种于96孔板中，与GelMA、GelMA- dopa和GelMA-DOPA@MT的渗滤液共同孵育。采用CCK-8法测定脱氢酶水平，间接测定每隔1天活细胞数。在488和568 nm激发波长下，使用荧光显微镜观察活/死检测的图像。此外，通过在MC3T3-E1细胞( ）在48孔板中上述水凝胶的表面。然后，每隔1天用扫描电子显微镜（SEM）观察样品表面。

2．5．细胞培养

MC3T3-E1细胞在矿化培养基中培养(α-最低基本介质(α-MEM）（HyClone公司，洛根，UT，USA）在含有10％胎牛血清和1％青霉素 - 链霉素）在5％CO₂在37°C。为诱导MC3T3-E1细胞分化，细胞在成骨分化培养基(含10%牛血清的Dulbecco 's modified Eagle培养基，100μg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin, 50 μg/mL l -抗坏血酸，100 nM地塞米松，10 mMβ甘油磷酸)。过氧化氢(H₂O.₂)MT从Sigma（美国密苏里州圣路易斯）购买。3-TYP（一种sirtuin3抑制剂）购自Selleck。首先，将这些细胞分为四个实验组：（1）对照组，细胞经药物处理αmem;(2) H₂O.₂基，细胞与治疗α-MEM含有H₂O.₂(400 μ米)一次;(3) MT组α-MEM含有H₂O.₂(400 μm）和褪黑激素（10 μm，剂量模拟褪黑激素系统途径到局部系统），和（4）凝胶-dopa @ mt组，细胞处理α-MEM含有H₂O.₂(400 μM）一次，并且补充有GelMA-DOPA @ MT（先前收集20GelMA-DOPA @ MT渗滤液）。其中前三组生长媒体和褪黑素只是每天更换，并每天收集在其最后一组生长培养基含有渗滤液。然后，将细胞随后分成5个实验组：所述（1）对照组，细胞与治疗α-mem 24小时，（2）h₂O.₂基，细胞与治疗α-MEM表示12h和h₂O.₂(400 μM) for 12 h, the (3) GelMA-DOPA@MT group, cells pretreated withα-MEM for 12 h and then treated withα-MEM含有H₂O.₂(400 μM） 盖尔玛呢-DOPA@MT（以前收集的20GelMA-DOPA@MT（a）12小时 h、 （4）3-TYP组，用3-TYP（50）预处理的细胞 μm）12小时然后用α-mem补充了h₂O.₂(400 μM） 12天 h、 和（5）格尔玛-DOPA@MT+3-TYP组，用3-TYP（50）预处理的细胞 μM） 12天 h、 然后进行药物治疗α-mem补充了h₂O.₂(400 μM)和GelMA-DOPA@MT(之前收集的20GelMA-DOPA@MT渗滤液)12小时。

2.6。实时RT-PCR分析

用三唑试剂（Invitrogen）收集总RNA。通过NanoDrop One（Thermo Fisher，USA）测定总RNA浓度，并且RNA在20中使用RNA进行逆转录 μl反应体积包括Primescript RT主混合物（Takara，Japan）和20的PCR扩增 μL反应体积包括10 μL勿忘我 - 不是QPCR主混音（Biotium，USA），0.5 μ每个引物的L值是2μ大号的cDNA，和7 μL-无核糖核酸酶dH₂O。使用LightCycler 96实时PCR检测系统（美国罗氏）进行反应。将循环阈值标准化为GAPDH水平。以下引物序列用于扩增ALP、OCN、Osterix、Bax、Bcl-2、Sirt3和GAPDH:ALP-5 -CAGCGGTAGGGAGCAGTTTC-3和反向5. -ccctgcacctcatccctga-3 那OCN Forward 5. -GaggctctgagaAgcataAA-3和反向5. -AGGGCAATAAGGTAGTGAA-3 那Osterix向前5 -TGAGCTGGAACGTCACGTGC-3和反向5. -aagaggaggccagccacaca-3 那伯灵顿向前5 -AGACAGGGGCCTTTTTGCTA-3和反向5. -AATTCGCCGGAGACACTC-3 那Bcl-2正向5 -GCTACGTCGTGACTTCGC-3和反向5. -CCCCACCGAACTCAAAGAAGG-3 那Sirt3前进5 -GAGCGCCTACAGAC-3和反向5. -GGAAGTAGTGAGTGACATTGG-3 那和GAPDH转发5 -GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3和反向5. -CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ．每个样品测试三次以减少错误。

2.7。蛋白质分离和Western印迹分析

Protein samples were resolved by 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for 2 h and electrophoretically transmitted to a PVDF membrane (Merck Millipore, USA). After blocking nonspecific binding sites with 5% skim milk for 60 min at room temperature, the membranes were incubated overnight at 4°C with primary antibodies against SIRT3 (1 : 1000; ab189860), Bax (1 : 1000; ab32503), Bcl-2 (1 : 1000; ab59348), ALP (1 : 1000; ab95462), Osterix (1 : 500; ab22552), OCN (1 : 500; ab93876),β-actin (1: 1000;ab8227)， so2 (1: 5000;ab13533)和ac - so2 (1: 5000;ab137037)(全部来自英国剑桥的Abcam)。然后，在Tween 20的tris缓冲盐水中冲洗膜，并与相应的二级辣根过氧化物酶偶联抗体(1:10 00)室温孵育2 h。用化学发光HRP底物(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)检测这些蛋白。

2.8. 碱性磷酸酶染色

培养两周的在成骨培养基后，MC3T3-E1细胞用碱性磷酸酶（ALP）染色温育。简单地说，我们洗MC3T3-E1细胞三次PBS。After fixation in 4% paraformaldehyde for 15 min, the cells were washed three times with PBS and then incubated in a BCIP/NBT working solution (Beyotime Biotech, Jiangsu, China) in the dark for 20 min. The staining outcomes were observed under a microscope.

2.9。茜素红的染色

在成骨培养基中培养三周后，用茜素红S（ARS）染色MC3T3-E1细胞。简而言之，我们用PBS洗涤MC3T3-E1细胞三次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中固定20分钟。然后，将细胞冲洗并在ARS染色溶液（pH4.2; Cyagen Biosciences，Santa Clara，Ca，USA）中孵育20分钟。最后，DDH.₂o用于洗涤细胞三次。

2.10。TUNEL染色

在成骨培养基中培养3天后，采用一步TUNEL凋亡检测试剂盒(Beyotime Biotech, Jiangsu, China)检测MC3T3-E1细胞，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

2.11. 动物

雌性SD大鼠(8周龄， ）从JOINN Laboratories（中国苏州）购买。所有喂养动物的细胞都是无特定病原体（SPF）类隔离器。涉及动物的实验由张家港市中医院动物护理委员会研究所批准。

2.12。外科手术

所有的动物都接受了麻醉。24只大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)，其余6只大鼠行假手术。3个月后，用双能x线骨密度仪(DEXA;以评估骨质疏松模型是否已成功开发。一旦确定成功，30只大鼠接受双侧远端无菌钛钉植入(Adil，中国苏州)。将植入物侧向放置于每只大鼠股骨远端。根据不同的组，没有在植入物周围注射特定的药物。将30只动物随机分为5组:单纯种植体(对照组)、卵巢切除+种植体(OVX组)、OVX+种植体+GelMA (GelMA组)、OVX+种植体+MT (MT组)、OVX+种植体+GelMA-DOPA@MT (GelMA-DOPA@MT组)，每组6只。MT和GelMA-DOPA@MT组收到每日ip管理太(σ)50毫克/公斤体重之间5:00点到6:00点为4周后植入安装,而另一组老鼠都在相同的条件下注射生理盐水。此外，在安乐死前10天和2天，所有大鼠均注射钙黄素(Sigma) 10 mg/kg。 In the last part of the experiment, the rats were sacrificed, followed by the collection of their bilateral femurs for subsequent studies.

2.13。放射性分析

含钛植入物的股骨( 每组）用高分辨率microcomputed断层扫描仪（μCT，SKYSCAN 1176;SKYSCAN，Knotich，比利时）。股骨18进行扫描 μ每层M，X射线参数设定为50kV的电压，电流为500 μA，和0.7°的旋转工序。A round region with a diameter of 1.8 mm around one-third along the titanium rods of distal femurs was chosen to evaluate related morphometric parameters, including BMD (g/cm^3.），骨体积/总体积（BV / TV，％），骨头表面/骨体积（BS / BV，1 / mm）时，骨表面/总体积（BS / TV，1 / mm），并且骨小梁数（TBN，1 /毫米）。有关的三维（3D）图像的处理后进行分析。

2.14。组织学和免疫组织化学分析

所有的股骨在4℃下保存后的组织学和免疫组织化学分析μCT。整个左股骨( 每组）用于硬组织截面染色。嵌入环氧树脂（45347，Sigma）后，将每个试样切成10 μm厚切片沿垂直轴用硬组织切片机(EXAKT 300CP，德国)。取硬组织切片进行钙黄素染色，荧光显微镜成像。使用Bioquant Osteo 2017 (Bioquant Image Analysis Corporation, USA)计算矿物配位率(MAR)。

完整股骨用15%乙二胺四乙酸(EDTA, Sigma)脱钙1个月。 各组)取钛螺钉后石蜡包埋。将标本切成5块μ米部分，其用于苏木精和伊红（H＆E）染色。最后，通过中性香脂（Solarbio）和拍摄的被密封的部分。用光学显微镜，在BV / TV和炎性区域使用BIOQUANT骨2017进行了计算。

用于免疫荧光染色和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP划痕末端标记(TUNEL) (Beyotime Biotech，中国)。所选感兴趣区域(ROI)位于骨骺下方的Ti螺钉周围。简单地说，切片用二甲苯脱蜡，然后用透明质酸酶在37℃梯度水化和抗原回收1小时，在室温下用胃蛋白酶25分钟。然后用血清封闭切片30分钟。接下来，石蜡切片与一抗ALP (ab95462)和Rux2 (ab192256)(均来自Abcam)在4°C下孵育12小时。随后，用PBS冲洗切片，用二抗(ab150077)在室温黑暗中孵育60分钟。PBS冲洗，TUNEL检测液37℃孵育30分钟。之后，用PBS冲洗，并加入DAPI贴装介质(ab104139)。最后，玻片在2-8°C黑暗中保存10分钟，荧光显微镜检测。阳性染色由Bioquant Osteo 2017测定。 The selected region of interest (ROI) was around the Ti screws below the epiphysis.

2.15. 统计分析

结果表示为 偏差。Kolmogorov-Smirnov试验用于测试统计正常性。通过单向ANOVA与Tukey的多重比较测试使用SPSS 25.0，用单向ANOVA确定统计显着性 具有统计学意义的差异。

3.结果

3．1.GelMA-DOPA@MT的体外鉴定

体外研究了具有不同量的MT脂质体的GELMA-DOPA的药物释放行为。如图所示1（a）中，样品表现出的，因为它们的水凝胶网络中的各种差别释放特性。在这些样品中，5GelMA-DOPA @ MT显示出约5天内的最短持续释放期间，和20GelMA-DOPA @ MT显示出几乎25天最长连续释放时间。在样品之间的释放特性的差异可以归因于在水凝胶网络的密度。例如，5GelMA-DOPA @ MT具有最宽松的水凝胶网络，同时20GelMA-DOPA @ MT显示出最密集的水凝胶结构。20GelMA-DOPA @ MT释放MT的一个不显眼的突发中的第几天和连续释放MT大约20天，这奠定了基础，以促进骨再生。

因为它们是重要的特征，探讨了水凝胶的吸水率和降解。如图所示1（b）当水凝胶的制备浓度相同(20%)时，不同材料(GelMA、GelMA- cooh、GelMA- dopa和GelMA-DOPA@MT)组成的水凝胶的吸水率没有显著差异。如图所示1 (c)，不同浓度（5-20​​％）的水凝胶中吸水差异存在显着差异，吸水性范围 为5 gelma-dopa 20 gelma-dopa。然而，水凝胶的降解表现出与吸水相似的趋势，如图所示1 (d)和1（e）．相同浓度(20%)的水凝胶降解速率相似，表明GelMA、GelMA- cooh、GelMA- dopa和GelMA-DOPA@MT在浸泡27天后完全降解。同时，不同浓度的水凝胶降解时间也不同，5 gelma - dopa为5天，20GelMA-DOPA为28天。

在种植过程中，承受一定外力的能力是至关重要的;因此，我们通过压缩试验进一步表征了不同改性的GelMA水凝胶。如图所示1（f）和1（g），在相同浓度的水凝胶的压缩模胶中没有显着差异，这是 GelMA, 对于Gelma-Dopa，和 对于GelMA-DOPA @ MT。载有药物的复合水凝胶表现出类似的其他三组的机械性能，提供用于多功能植入了极好的基础。此外，根据该结果在图中所示1（h）和1(我)压缩试验表明GelMA-DOPA浓度与所制水凝胶的压缩模量之间存在预期的正相关性，其范围为 为5GelMA-DOPA水凝胶 对于20gelma-dopa水凝胶。

考虑植入物的工作条件，从而提高密合性在潮湿环境中的骨头和Ti的表面是多官能水凝胶的成功至关重要。因此，搭接剪切测试执行湿环境下表征各种GelMA-DOPA的的体外粘合性能。如图所示1 (j)和1 (k)，GELMA和凝胶COOH显示出有限的粘合性能，但GELMA-DOPA和GELMA-DOPA @ MT表现出显着的粘合性能。腿部剪切强度，范围从 为5GelMA-DOPA水凝胶 对于20GelMA-DOPA水凝胶，随着GelMA-DOPA浓度的增加而增加。这表明，随着DOPA含量的增加，预聚物浓度的增加会提高附着力。

为了量化细胞增殖，CCK-8分析每隔1天进行一次，如图所示1（l）和表格S1．各组间的光密度（OD）为不显著不同和后1天至2.5后7天，从0.3范围内。此外，通过活/死染色后7天的潜伏期观察到的细胞活力。如图所示2（a） 各组细胞均表现出较高的活力和良好的分散性，表明GelMA-DOPA@MT具有合适的细胞相容性。此外，将MC3T3-E1细胞接种在不同水凝胶表面，并监测其细胞形态和粘附情况。SEM图像如图所示2（b）揭示在GELMA-DOPA @ MT的表面上生长的细胞具有类似于在同一时间点在凝胶表面上生长的细胞的形态，表明MT和药物释放的存在不影响细胞粘附。

所有上述结果表明，GELMA-DOPA @ MT以促进MC3T3-E1细胞粘附和增殖的能力与在凝胶，凝胶 - 多巴和对照组中观察到的，建立进一步研究的基础没有显着差异。

3.2。Gelma-dopa @ MT促进成骨细胞的分化并抑制它们的细胞凋亡

如图所示3（a），各组MC3T3-E1细胞经处理后，ALP染色显示H后阳性细胞数量明显减少₂O.₂治疗与对照组相比。然而，药物干预逆转了这种现象。定量分析表明GelMA-DOPA @ MT组中更多的阳性细胞比MT组中使用。类似的结果也由ARS染色观察。钙的数量结节在H₂O.₂但药物干预显著增加，特别是GelMA-DOPA@MT组。定量分析也表明GelMA-DOPA@MT组的成骨率增加(是MT组的1.2倍)。

为了进一步观察Gelma-DOPA @ MT诱导成骨分化的能力，RT-PCR显示出在H诱导后₂O.₂Osterix的mRNA水平（0.7倍，图3 (h)），ALP（0.69倍，图3(我))， OCN(0.6倍，图3（j）的与对照组中的那些相比，减少。然而，药物干预逆转了这种现象。正如预期的那样，GELMA-DOPA @ MT明显增加了基因表达与MT组（ALP，1.1倍; OCN，1.4倍;和Osterix，1.2倍）。蛋白质印迹表明，即使在H的情况下，凝胶-DOPA @ MT组中的ALP，OCN和Osterix也增加了蛋白质水平₂O.₂（数字3 (d)-3（g）)．此外，在大鼠BMSCs中观察到类似的结果，并且Gelma-Dopa @ MT显着减弱H.₂O.₂-诱导抑制成骨细胞分化（图S1)．

引起由H氧化应激₂O.₂常伴有细胞凋亡。TUNEL染色观察H₂O.₂MC3T3-E1细胞凋亡显著增加（图4(一))MT和GelMA中MC3T3-E1细胞凋亡-DOPA@MT各组均被抑制。定量分析（图4 (b))显示GelMA-DOPA@MT组MC3T3-E1细胞凋亡较MT组减少0.8倍。此外，Western blotting(图4（c）-4（f）)也表明H₂O.₂显著增加Bax蛋白的蛋白质水平和降低/ Bax蛋白与对照组相比的Bcl-2的比率。相反，药物干预降低Bax蛋白水平和增加的Bcl-2 / Bax比值，和GelMA-DOPA @ MT组中的药物干预的效果比在MT组中更为明显。RT-PCR也显示了相似的结果（图4（g）-4(我))．

3.3。GELMA-DOPA @ MT对SIRT3 / SOD2信号通路的影响

以前的研究表明，MT通过SIRT3 / SOD2信号传导途径抑制线粒体氧化应激。因为线粒体氧化应激是凋亡的一个重要因素，所以我们专注于机械研究中SIRT3的变化。我们首先通过免疫组织化学（IHC）展示了SIRT3在MC3T3-E1细胞中的表达。如图所示5（a）和5 (b)H₂O.₂显著降低了SIRT3的表达，而药物干预增加了其表达，GelMA-DOPA@MT组的SIRT3活性明显高于MT组。我们进一步评估了SIRT3和SOD2的蛋白和基因表达水平(图)5 (c)-5（e）)．正如预期的那样，H₂O.₂与对照组相比，SIRT3蛋白水平明显降低，Ac-SOD2/SOD2比值明显升高。相反，药物干预扭转了这一现象。同时，MT对GelMA-DOPA@MT组的影响比MT组更显著。

接下来的实验使用了sirt3选择性抑制剂(3-TYP)。TUNEL染色显示MT对细胞凋亡的抑制作用被3-TYP抑制，定量分析显示GelMA-DOPA@MT+3-TYP处理并不能有效地阻止GelMA-DOPA@MT+3-TYP组MC3T3-E1细胞的凋亡(是MT组的2.5倍)(图)6（a）和6（b）)．同时，RT-PCR和Western blot(图6 (c)-6（f）)证实3-TYP逆转了GelMA-DOPA@MT治疗组GelMA-DOPA@MT的有效抗凋亡作用(RT: Bax, 2.1倍;bcl - 2, 0.6倍)(数据图6（G）和6（i）)．最后，ALP和ARS染色显示，3-TYP显著抑制ALP表达(GelMA-DOPA@MT组为ALP表达的0.5倍)和钙结节形成(GelMA-DOPA@MT组为0.4倍)(图)7(一)-7（c））。RT-PCR和Western Blotting进一步证明了3典型的增加了ALP和Osterix的表达（RT：ALP，0.6倍; Osterix，0.6倍）（图图7（d）-7（H）)．

3.4。Gelma-dopa @ MT促进Ti植入物周围的骨质

植入的钛螺钉周围的小梁微结构也通过3D评估μCT分析（图8.（一种））。与对照组中的相比，OVX组中的骨量显着降低，如下所示μCT数据：骨密度( vs. 那分别，g / cm^3.), BV /电视( vs. 那分别，％），BS / BV（ vs. 那分别为1 / mm），BS / TV（ vs. 那分别，1 / mm），并且TBN（ vs. 那分别1 /毫米)。而在Ti螺钉周围注射MT或GelMA-DOPA@MT后，骨量增加，GelMA-DOPA@MT组骨量明显大于MT组，如下图所示μCT数据：骨密度( vs. 那分别，g / cm^3.), BV /电视( vs. 那分别，％），BS / BV（ vs. 那分别为1 / mm），BS / TV（ vs. 那分别，1 / mm），并且TBN（ vs. 那分别1 /毫米)(数据8.（d） -8.(h))。这些结果表明GelMA-DOPA@MT-treated组比mt组有更多的骨小梁。两组的骨小梁比OVX组多。综上所述，GelMA-DOPA@MT注射可有效促进体内Ti螺钉周围的成骨程度。符合μCT结果，组织学分析进一步证实了MT在骨质疏松症大鼠中的骨保护作用。周围组织的H＆E染色在OVX-和凝胶处理组中，在骨基质和Ti棒之间清楚地显示纤维状胶囊，表明通过氧化应激诱导的显着炎症反应。相反，在MT-和GELMA-DOPA @ MT处理的组中观察到比对照组的组更完整的骨结构（图8.（b））。单，双的荧光染料标记，骨形成的直接组织学标志物，是更加明显，和双标记物之间的距离为OVX组中比对照组更短，而GelMA-DOPA @ MT治疗显著增加单和双标签标记间宽度与所述MT组相比（图8.（C））。

为了进一步确认的GelMA-DOPA @ MT上凋亡体内成骨细胞的抑制效果，通过免疫荧光染色进行的组织学切片的进一步研究。如图所示9.（一种）-9.（f）和下共聚焦显微镜观察到的，OVX组中的正区域比在对照组中显著较大，而MT-治疗组中，阳性面积比OVX组中更小，而在效果在GelMA-DOPA @ MT治疗组更显著。这些结果证实，GelMA-DOPA @ MT能有效地减少体内成骨细胞的凋亡。

4.讨论

大约有890万骨折骨质疏松，每年在全球造成的。O.n average, one osteoporotic fracture occurs every 3 sec [41］.骨质疏松症将成为卫生当局面临的一个严峻挑战，因为世界上许多国家都是老龄化社会[2那3.那5.]. 骨折后的外科治疗通常采用内固定来恢复骨完整性和机械支持。内固定稳定性是骨折术后恢复的重要因素[42]. 骨折后的外科治疗通常采用内固定来恢复骨完整性和机械支持。内固定稳定性是骨折术后恢复的重要因素[8.那43］.重要的是，我们证明了成骨细胞的凋亡可能会加剧骨质疏松导致的恶化，并最终导致假体松动。不幸的是，在骨质疏松症患者中，没有好的方法来保护种植体周围的骨。骨重建是一个动态过程，其中骨吸收和骨形成之间的内环境平衡至关重要[44］.重要的是，我们证明了成骨细胞的凋亡可能会加剧骨质疏松导致的恶化，并最终导致假体松动。不幸的是，在骨质疏松症患者中，没有好的方法来保护种植体周围的骨。骨重建是一个动态过程，其中骨吸收和骨形成之间的内环境平衡至关重要[45那46］.在骨质疏松症，ROS的产量增加，可以对骨的植入物周围的损失显著贡献[47］.近年来，越来越多的研究表明氧化应激诱导的成骨细胞凋亡在骨质疏松症中起重要作用。这些发现表明，抑制成骨细胞凋亡可以减少骨质疏松症的影响[48］.

MT，其由人对腺体中的血清素合成，参与了许多生理过程的调节，例如睡眠诱导和抗炎，抗肿瘤和抗氧化功能[20.］.近年来，MT对线粒体氧化应激的保护作用有报道[28那29那49］.我们研究的GelMA-DOPA @ MT提取物促进成骨细胞的能力，抑制成骨细胞凋亡的体外。MT通过SIRT3信号传导途径抑制线粒体氧化应激和衰减MC3T3-E1骨细胞的细胞凋亡。沉默调节蛋白（SIRTs），一个家庭的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的（NAD + - ）依赖性脱乙酰酶具有七个成员（SIRT1-SIRT7），其中SIRT1和SIRT3是最广泛研究[50[已被证明在凋亡中发挥着重要作用。SIRT3，一个高度保守的nad⁺- 位于线粒体中的依赖性脱乙酰酶被认为是最重要的乙酰赖氨酸脱乙酰化酶，其调节各种蛋白质以调节线粒体效应和ROS生产[51］.线粒体氧化应激的作用已被广泛证实。在我们的氧化应激模型中，我们观察到MC3T3-E1成骨前体细胞中SIRT3的表达显著降低。与H组相比，MT增加了SIRT3表达，抑制了细胞凋亡₂O.₂团体。MT的这种效果由SIRT3特异性抑制剂显著衰减。这些结果证实MT对线粒体氧化应激的保护作用通过SIRT3信号传导途径，从而减少细胞凋亡诱导的氧化应激。

已经在动物研究表明，MT的全身给药增强骨形成或集成[26那52］.口头和i.p.注射MT增加了小鼠中股骨皮质骨骼的体积。同样，Ostrowska等。[53]发现松果体切除后大鼠腹腔注射外源性MT抑制骨代谢的生化标记物，如ALP。Takechi等人[54报道MT促进Wistar大鼠胫骨钛种植体周围骨结合。Zhou et al. [55结果表明，MT可促进钛种植体周围骨形成。因此，系统管理MT是一种潜在的治疗疾病，如骨质疏松症涉及整个骨骼系统的低骨密度。类似地，Calvoguirado等人的研究[56]研究表明，局部应用MT可增加植入物周围的钙沉积。此外，局部注射MT的兔子在胫骨种植体宽度和长度周围的皮质骨再生速度快于未经治疗的兔子。因此，局部MT给药诱导骨愈合而不影响其他系统，这通常是治疗局部骨组织的有力工具。

然而，MT释放初期爆发性、给药时间短是骨修复局部应用的明显不足，在一定程度上限制了MT的临床应用。脂质体作为fda批准的药物载体来控制药物释放已有几十年的历史[57］.另外，由于它们的双层结构，脂质体可以有效地携带亲水和疏水药物[34那35］.然而，在液体给药过程中难以保持某种治疗药物浓度。Gelma-Dopa，明胶衍生物，显示出令人满意的粘合性，生物降解性和生物相容性[31-33］.在暴露在紫外线下之前，可以注射预交联GelMA溶液，用于填充种植体和松质骨之间的空隙[58］.交联后，种植体与骨之间形成完整的汞合金。在本研究中，我们制备了MT脂质体(MT@liposomes)，然后将其与GelMA-DOPA溶液混合，制备预交联溶液。然后，将溶液注射到骨缺损区域，然后将其暴露在紫外线下。最后，形成了一种具有良好黏附性能的持续MT释放系统，用于连接种植体和周围组织。

然而，这项研究也有一些局限性。一方面，众所周知，骨代谢包括骨形成和骨吸收两个方面。然而，我们的结果仅表明GelMA-DOPA@MT通过促进骨形成而增加Ti螺钉周围的骨量。尽管Ping等人[59]证实MT抑制钛颗粒刺激引起的溶骨部位骨吸收，GelMA-DOPA@MT是否影响钛螺钉周围骨吸收还需进一步研究。这个问题是我们实验室目前正在进行的研究的重点。另一方面，我们所采用的ovx诱导的骨质疏松模型与自然衰老的骨质疏松不同。无论是人类还是动物，年龄都会影响细胞的数量、增殖和分化[60.那61.］.因此，为了验证GelMA-DOPA@MT对种植体稳定性的影响，需要建立临床相关性更强的衰老骨质疏松模型。此外，我们需要使用人来源的成骨细胞、破骨细胞或人细胞系，进一步使其在接下来的实验中更具临床相关性。

结论

在这项研究中，我们开发了一种新型MT持续的释放系统Gelma-Dopa @ MT，它可以通过UV光线光谱连接到Ti螺钉的表面。此外，GELMA-DOPA @ MT可以抑制通过氧化应激引起的骨赘凋亡，从而通过激活SIRT3 / SOD2信号通路来促进骨质发生分化并改善假体周围的骨质。该系统局部持续的MT释放是一种合适的候选者，用于治疗骨质疏松症患者植入物松弛。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

稿件是通过所有作者的贡献编写的。所有作者都批准了稿件的最终版本。龙晓和嘉义林平等贡献。

致谢

我们非常感谢国家自然科学基金（81873990,81873991和81672238），江苏省自然科学基金（BK20180001和BK20191201），苏州科技发展计划项目（SYSD2017008，SYSD2018001和SYSD2018003）)，the Suzhou Science and Education Technology Project (KJXW2017061 and KJXW2018058), the Suzhou Health Personnel Training Project (GSWS2019074), the Zhangjiagang Health System Youth Science and Technology Project (ZJGQNKJ201804, ZJGQNKJ201807) and the 2019 National Teacher System Training Project for Young Health Talents of Suzhou.

补充材料

图S1：GELMA-DOPA @ MT促进体外骨细胞的分化（BMSC）。表S1：CCK8染色的定量结果。（补充材料）

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