文摘

细胞内活性细胞凋亡和活性氧(ROS)扮演着重要的角色在紫外线(UV)诱导炎症和老化反应在人类皮肤组织。本研究确定的机制Haematococcus pluvialis提取(HPE)和净化虾青素(HPA)受伤的组织,促进皮肤再生在体外和在活的有机体内。结果表明,HPE和HPA减少DNA损伤,促进胶原蛋白的分泌(Hs68)在人类正常成纤维细胞系剂量依赖性的方式。紫外线照射和HPA减少氧化应激损伤由于phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)。当皮肤细胞是由自由基,受伤的细胞进行程序性细胞死亡。细胞凋亡的死亡是决定使用膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / propidium碘(PI)双重染色法来验证没有细胞膜不对称,核膜破裂。实验性大鼠炎性症状和凋亡损伤与HPA治疗组治疗后剂量依赖性的方式减少UVB照射(300 mJ /厘米²为15分钟)在活的有机体内车辆相比,对照组。这些积极的结果表明,HPA维修UVB-triggered进行电子皮肤组织损伤和衰老的细胞维持一个低水平的氧化应激,胶原蛋白合成在体外和在活的有机体内。

1。介绍

三层的皮肤由表皮、真皮和hypodermis-and是人体最大的器官1]。保持内部平衡和保护身体免受机械、生物、物理和化学损伤(2,3]。晒伤、老化和皱纹导致损失的真皮组织,抑制了愈合过程(4,5]。皮肤是人体的外表面,很容易暴露于紫外线(UV)从阳光照射。光毒性的伤害是一种常见的损伤,导致许多表皮疾病和加速老化的过程。

UVB (290 - 320 nm)是最常见的原因皮肤photodamage,包括炎症反应,生产的皱纹,累积老化和皮肤癌6,7]。UVB提供DNA双螺旋结构的能量并使共价键断裂和复制错误。一天的阳光照射后,每个单元可以积累DNA损伤由于成百上千病变,即退化为180 - 200碱基对片段的核酸内切酶(8,9]。核DNA也受伤引起的氧化自由基(ROS),它可以驱散一个或两个分子与其他分子组件(直径在行动之前10- - - - - -12]。这些损伤引起真皮细胞发炎,红、肿,进一步引发一系列的炎症通路,最终导致严重的皮肤问题,包括胶原蛋白流失和老化。

作者之前的研究表明,提取的Haematococcus pluviali促进细胞增殖、胶原蛋白生产、和抗氧化性能13]。本研究使用纯化的虾青素H。pluviali再生受损皮肤。H。pluvialis是一个无处不在的绿藻,属于群藻类,红球菌属。这种海藻被广泛发现适合其生长的地方。这个物种是强有力的抗氧化剂的含量高而闻名,虾青素,这是很重要的在水产养殖中,食物,和化妆品1]。他们休息囊肿通常导致血红的颜色,在底部的干岩石池和水盆。藻细胞内大量的虾青素积累当环境呈现生存困难。

本研究使用一个明亮的灯光和高盐度促进生产虾青素的提取和净化(14,15]。它在几何的分子量为596.86反式- - -独联体同分异构体的化学分子式C₄₀H₅₂O₄。这项研究中提取和净化虾青素提取纯化(HPE)和虾青素(HPA)从红色微藻,H。pluvialis,反式形成热力学稳定多了独联体形式(16]。

在积极治疗潜在的成分,HPA和HPE据报道抑制性影响炎症相关蛋白的表达在动物模型。人们已经发现,HPA明显抑制核转录因子-κ光增强器(NF -多肽基因κB)信号和胶原蛋白降解蛋白质,基质金属蛋白酶(MMPs)。的抗氧化活动和自由基清除一些代理研究[1,7,9,10,13),这些研究的结果促使这项工作确定HPA减少photodamage受伤,表达下调apoptosis-related RNA和蛋白质。本研究发现,HPA是一个潜在的和积极的抗氧化剂是组织再生剂。

2。材料和方法

2.1。试剂

二甲亚砜(DMSO),乙二胺tetra-acetic酸(EDTA)和三氯乙酸购自Sigma-Aldrich化学公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。相关的流程H。pluvialis提取(HPE)和净化虾青素(HPA)之前的一项研究报告的作者(信风生物科技有限公司(台湾))(13]。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),胎牛血清(的边后卫),抗生素和其他文化媒介获得Gibco BRL(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。cox - 2抗体,进气阀打开,金属蛋白酶- 1、ERK1/2 cleavage-caspase-3, caspase-8, caspase-9从IMGNEX购买(美国圣地亚哥,CA)。免疫印迹检测装置和缓冲从细胞信号技术获得的解决方案公司(美国贝弗利,MA)。其他化学试剂和反应缓冲区获得最高质量和纯度。

2.2。细胞培养

从美国获得了人类正常成纤维细胞Hs68cell线类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国;Hs68号码:crl - 1635™)。这是一个系列的智人包皮成纤维细胞线发达的海军生物科学实验室(NBL)在奥克兰,加州,美国。人类角化细胞永生化细胞系(HaCaT)请提供博士Hamm-Ming张文雄系的皮肤病,国立成功大学医院,台南,台湾。HaCaT和Hs68孵化在单层条件有限公司为5%₂在37°C在DMEM补充与100 U /毫升的青霉素、0.25μ两性霉素B g / ml, 100毫克/毫升的链霉素,and10%的边后卫。所有细胞培养在6厘米菜肴和观察到细胞密度达到70 ~ 80% (17]。

2.3。UVB照射

UVB辐射产生使用cl - 1000 M紫外线交联剂(UVP, Inc .,旱地、钙、美国),传输的大部分能量在290年和320年之间,高峰在302 nm。UVB剂量计算使用UVX辐射计(UVP, Inc .)。HaCaT HS68细胞被UVB光辐照的剂量30 mJ /厘米²,老鼠接受300 mJ /厘米²。暴露疗法是基于初步试验的结果。

2.4。细胞增殖试验(MTT试验)

HPE的能力和HPA修复光毒性的伤害决定使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析过程(18,19]。皮肤细胞培养在96孔板的密度 细胞/。2小时的潜伏期后,介质被另一个新鲜肝癌和中含有10%的解决方案是添加到每个。这些细胞被维持在37°C 4 h,上层清液是删除。DMSO溶液被注入每一个板。光密度测量在569 nm使用Bio-Rad 96孔酶标分光光度计(美国BioTek有限公司CA)。计算细胞生长

2.5。胶原蛋白测定

为了比较的胶原蛋白量从受伤Hs68细胞分泌,HPE和HPA孵化在6-well板(4]。胶原蛋白是沾Picric-Sirius红色染料(Abcam有限公司,剑桥,英国)。coculturing与样本24 h后,媒介被拆除,这些细胞被洗两次以磷酸盐(PBS)缓冲区(67毫米,pH值6.8)。100年μl 0.1%的染料(0.05克每50毫升苦味酸天狼星红粉末)添加到每个好,反应在室温下为一个小时。无污点的天狼星红溶液被和0.1 N盐酸洗五次。染色的方法提取和与100年完全混合μl (0.1 N氢氧化钠在室温下15分钟。量化的胶原蛋白量,吸光度在540 nm监控使用分光光度计(BioTek有限公司)。

2.6。细胞彗星试验

熔点是正常游戏的1%琼脂糖涂在幻灯片和空气干燥。24小时后,琼脂糖浓度为1% 70μl添加作为一个支持层。这是轻轻混合30μl细胞悬液和70μl 1%的低熔点琼脂糖在37°C。幻灯片在裂解缓冲举行在4°C 2 h (20.]。电泳的变性进行碱性缓冲(pH值13.0;1毫米EDTA和300毫米氢氧化钠)在一个寒冷的温度为20分钟。20μl(每张幻灯片用吖啶橙染色(2μg / ml)进行分析使用荧光显微镜相机(TE2000-U;尼康有限公司、日本东京)。的图像量化使用OpenComet插件ImageJ软件和重新安排为便于阅读。一位代表,量化的图像。生成的图是分析3独立计算使用相同的软件插件一式三份。

2.7。分析细胞间使用2氧化应激 ,7 - - - - - -二乙酸Dichlorofluorescin (DCFDA)染色

细胞Hs68和HaCaT细胞每被播种在96孔板。培养24小时后,细胞暴露在UVB辐射和治疗使用HPA在不同浓度。Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)作为消极的控制。这些细胞被停职,沾DCFDA解决方案5μ米30分钟。分析了单个细胞用流式细胞分析仪和兴奋使用波长488纳米的激光和检测在535纳米21]。

2.8。膜联蛋白V-FITC / PI-Stained荧光显微镜

细胞被培养成一个6-well板的密度 细胞/。孵化介质不平衡和HaCaT Hs68细胞混合HPA (5 - 125μ克/毫升)或仅在体积相同的最终解决方案(车辆控制集团)与10%的边后卫。样品的染色过程与膜联蛋白是V-FITC (10μg / ml) /π(10μg / ml)使用荧光显微镜检查的产品22]。双染色法是用于识别细胞膜磷脂酰丝氨酸外化和π吸收。量化任何细胞凋亡,ImageJ软件被用来测量膜联蛋白的强度V-FITC。三个独立实验的结果( )确认可重复性。

2.9。西方墨点法

HaCaT Hs68细胞培养和HPA 24 h,使用溶解和细胞蛋白提取缓冲(热科学皮尔斯•瑞帕缓冲区)(22]。上层清液中的蛋白质是化验使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(美国Sigma-Aldrich Corp .)溶菌产物离心后30分钟的12000 rpm。蛋白质在同等数量,分开使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶,凝胶电泳(sds - page) 12%, electrotransferred聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。转移膜是轻轻地从湿平衡水舱和半干的转移位置,并使用TBS缓冲区和0.1%的膜被渐变(TBST) 20 1 h。产品清洗使用1 x TBST消除任何痕迹的脱脂牛奶。在每种情况下,孕育了PVDF膜与相应的初级抗体和洗两次TBST缓冲区。然后把手伸进辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体相应的主要抗体。样本然后处理增强化学发光(ECL)检测试剂和暴露在x射线胶片指定次检测乐队(PerkinElmer, )。彩色墨迹可视化使用一种商用成像系统(热费希尔科学有限公司)。

2.10。体内动物实验

动物的使用符合美国生理学会使用动物的指导原则,并通过高雄医学大学,国立中兴大学和使用委员会(KMU104002、KMU105036 NCHU-IACUC 105 - 141)。雄性Wistar鼠(255 - 290克)是用于动物实验,和照片拍摄和异氟烷麻醉下手术3]。树脂玻璃的笼子里的老鼠被安置一个温控孤立的房间( °C)在光明/黑暗(12 h / 12 h)时间表,有免费的水和食物。24老鼠被随机分为4组( ,每组):一个车辆控制集团唯一紫外线照射组和两个HPA-treatment组。麻醉后,背使用电动剃须刀和剃毛被照亮在UVB 300 mJ /厘米²每天(覆盖眼睛,0.3 W /厘米²15分钟)在8周的结束。24小时后,背部皮肤损伤模型完成后,和HPA在腹腔内注射不同剂量。

2.11。统计分析

车辆控制和HPA-treated细胞之间的差异决定使用一个学生 - - - - - -测试在体外考试。单向方差分析被用于制造车辆之间的统计比较实验组和对照组在活的有机体内化验。的值 表示统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞再生的可行性治疗使用HPE和HPA Photodamage皮肤模型

皮肤暴露在外部环境的器官最长的时间。经常受到化学和物理事件如细菌感染、环境污染(可吸入颗粒物,PM_2。5),紫外线,因为自由基产生,这年龄的皮肤。清除自由基增加皮肤健康和治疗炎症。本研究从HPE净化HPA(图S1),并使用它去修理损坏的地方是由自由基引起的。UVB对皮肤细胞氧化应激增加,用于诱导细胞损伤。确定损伤程度对人类表皮和真皮细胞由于UVB照射,两个细胞暴露在UVB辐射的时间(5 - 30 mJ /厘米²)。下5 mJ /厘米²UVB刺激,超过70%的HaCaT Hs68细胞生存。30岁以下的mJ /厘米²UVB,超过50%的细胞死亡和细胞生存能力仅为40%(图1(一))。

手机安全、敏感性测试,和一个在活的有机体内过敏检查是必要的(23,24]。确认HPE HPA并不是有毒的正常皮肤细胞,两个细胞的细胞毒性是由孵化0,1,5,25岁和50μg / ml样品24小时时间。测试样品25不诱导细胞毒性效应μ50 g / ml,高剂量μg / ml给存活率超过90%的te(数字1 (b)和1 (c))。HPE治疗和HPA之后,有30%的存活率为1μ25 g / ml,增加了65%μ克/毫升。HPE和HPA成功逆转损伤由于HaCaT和Hs68细胞(UVB辐射数据1 (d)和1 (e))。

3.2。通过下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制细胞内ROS生产

图1表明HPE减少UVB造成的损害,和HPA更有效。许多研究表明,活性氧攻击细胞通过不同的机制,包括细胞膜的过氧化反应,变性的蛋白质结构,DNA降解[25- - - - - -27]。降低ROS的生成增加身体健康。验证下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制ROS, PMA 20 ng / ml被用作第二个负控制和DCFDA检测绿色荧光的内容。在图2流式细胞仪显示UVB照射和PMA刺激治疗ROS增加生产。HPA治疗显著降低活性氧的生产,特别是对UVB + HPA实验组。结果表明,HPA ROS合成减少使用不同的资源。

3.3。HPA在皮肤细胞修复DNA损伤

如果UVB诱导活性氧的生成,ROS降低DNA双螺旋链断裂。一颗彗星试验用于检测DNA损伤。Hs68 HaCaT细胞和UVB辐射在30 mJ /厘米²和治疗与HPA 24小时。数据3(一个)和3 (b)表明,DNA的尾巴是显著降低剂量依赖性的方式使用PI染色。结果表明,HPA治愈DNA损伤后UVB照射通过减少DNA双链断裂。HPA的机制影响DNA repair-related蛋白质。ATM丝氨酸/苏氨酸激酶(ATM)是一种蛋白激酶,通过检测DNA修复机制,使磷酸化激活下游蛋白质,因此,DNA细胞周期逮捕/维修炎症和凋亡反应(28]。在分子生物学,细胞外signal-regulated激酶(erk)表达细胞内蛋白激酶信号分子,调节有丝分裂、减数分裂和postmitotic激活分化细胞(29日]。ERK的磷酸化是进一步引发了ATM诱导下游炎症信号通路。这项研究的结果表明,该ATM和ERK蛋白表达水平下降在两个细胞系对HPA剂量依赖性的方式,如图3 (c)和3 (d)。减少样本的DNA损伤和抑制蛋白表达。

3.4。胶原蛋白生产措辞天狼星红试验

细胞外基质(ECM)是一种cell-external三维大分子糖蛋白组成的网络,酶和胶原蛋白,使生化和结构维护附近的细胞。ECM是一个关键的细胞粘附,细胞和细胞分化之间的通信(4]。细胞受损时,发炎和分泌相关的蛋白质分解ECM和减少胶原蛋白总额。胶原蛋白是最丰富的蛋白质在ECM也是最丰富的蛋白质在人体和周围形成骨基质蛋白的百分之九十。胶原蛋白通常发生在纤维蛋白基质,为居民提供一个骨架形状邻居细胞。确定胶原蛋白分泌的变化受伤皮肤细胞后,小天狼星红染色(C₄₅H₂₆N₁₀Na₆O₂₁年代₆Abcam有限公司)是用来标记胶原蛋白在红13]。图4比较治疗后胶原蛋白含量UVB-injured细胞。是看到HPA恢复胶原蛋白的生产。胶原蛋白生产增加与HPA治疗24小时后,所以HPA再生受损的皮肤细胞。

3.5。HPA的细胞凋亡的影响UVB-Exposed HaCaT和Hs68细胞

荧光染色法被用来评估由于UVB照射对细胞死亡的细胞毒性影响。膜联蛋白V-FITC / PI染色用于检测细胞凋亡,以及所有图像观察绿色荧光下细胞膜和红色的两个细胞核仁的照片。HaCaT Hs68细胞接触后与HPA UVB治疗了90秒。细胞凋亡的表现是决定利用细胞荧光显微镜下检查400 x和结果如图5(一个)和5 (b)。染色细胞的比率减少剂量依赖性的方式从0到50μg / ml后24小时孵化和凋亡反应降低。结果表明,UVB-induced致命的凋亡反应显著抑制HPA细胞恢复和生存。

据报道,紫外线辐射诱发晒伤细胞凋亡(30.]。细胞凋亡由于紫外线的影响不同的信号通路,依靠紫外线强度和细胞类型。还存在一个大家庭的蛋白酶酶显著影响细胞程序性死亡,包括炎症、自噬,pyroptosis,细胞凋亡,necroptosis [22,31日]。通常,还在不活跃的阶段是prodomain然后进行蛋白水解酶守恒的课程生成两个heterosubunits二聚天冬氨酸的残留活性蛋白酶的形式。活跃caspase-8至关重要的细胞凋亡的执行阶段,因为是由FasL的外在压力,FasR,多种凋亡刺激。Cleavage-caspase-9由内在压力和执行一个激活下游刽子手启动凋亡通路。积极caspase-3激活和劈开caspase-6 caspase-7和处理由caspase-8 caspase-9。确定的角色还在HaCaT和Hs68细胞的凋亡,进行免疫印迹分析,结果如图5 (c)和5 (d)。这些蛋白质分子与细胞凋亡相关显示显著的改变由于暴露在UVB,包括增加在caspase-8裂解酶,caspase-9, caspase-3。HPA治疗减少这些还和抑制细胞凋亡的机制。

3.6。缓解皮肤炎症和UVB照射诱导活性氧积累在体内

本研究使用HaCaT和UVB Hs68细胞实验,但两个细胞并不完全代表的皮肤因为无论是细胞展品色素回应UVB对氧化应激的吸收原位。因此,在体外评估人类的正常皮肤细胞是伴随着一个在活的有机体内鼠模型作为更生理相关的方法来确定保护机制HPA (32]。UVB照射在300 mJ /厘米²15分钟会引起一个明显的物理特性的一个红色表面水肿Wistar鼠,见图6(一)。

为了评估HPA photodamage修复模型的影响,样本收获从老鼠的皮肤被hematoxylin-eosin彩色染色(圆))染色后8周的暴露在UVB管理。我们观察到表皮的UVB照射组比对照组更厚,皮肤细胞处于混乱状态。毛囊的规模扩大,汗腺在图显示不正常现象6(一)的UVB照射组。上述负面影响HPA-treated组明显减少。

我们证实,UVB刺激引起的炎症发生和严重影响胶原蛋白生产体外。HPA通过多种途径缓解这些症状,如减少氧化应激和促进DNA修复。对动物实验观察影响,我们获得了大鼠背部皮肤组织的蛋白质。胶原蛋白的数据了,内容我和HPA在治疗后显著增加。除了我胶原蛋白的性能,我们还研究了各种相关的分子信号。我们发现基质金属蛋白酶表达下调了HPA治疗,这意味着最终UVB刺激引起的炎症诱导基质金属蛋白酶的增加导致胶原降解,最终摧毁了真皮组织的完整性。这个不满意结果改进后HPA治疗的剂量30μ克/毫升。HPA腹腔内注射时,红肿胀面积明显减少,只比UVB组。有一个明显的改善背部皮肤UVB损伤后1周后,见照片。

炎症症状明显减少,而车辆控制,因此受损的皮肤组织修复由于HPA治疗。激怒了下面痒从外国对象或在大鼠皮肤导致老鼠试图删除它。瘙痒信号创建一个抓和咬反射,老鼠可以识别受影响的炎症。减少瘙痒感,河鼠划痕。在大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制瘙痒机制减少抓和咬打架的频率。Anti-itch机制将是未来研究的主题。

持续炎症不利于修复受伤的细胞,组织或器官。ROS在UVB-triggered炎症反应中起着至关重要的作用在皮肤上(33]。一氧化氮(NO)是一个关键分子信号作为逆行神经递质参与神经发育和血管生成。一氧化氮合成酶(NOS)形成生产没有催化精氨酸。没有被calcium-calmodulin-controlled介导在人类同工酶内皮NOS神经元NOS。(间接宾语)诱导一氧化氮合酶对碘氧基苯甲醚是一种自由基与一个未配对电子,作为免疫防御机制(34]。

HPA在炎症反应的影响大鼠的皮肤组织表皮皮肤测试。图6 (b)显示了处理的大鼠HPA结果与UVB照射后。皮肤组织的结果显示了减少ROS显著复苏,和UVB-induced伊诺蛋白质含量也减少。治疗后与HPA在25 - 50μg / ml, cox - 2表达水平下降,而对照组。的炎症和表皮厚度的增加表明,可以用来治疗photodamage HPA。

老鼠接受HPA在25 - 50浓度μg / ml UVB照射后24小时300 mJ /厘米²15分钟来确定凋亡反应。暴露在UVB的那组相比,有一个小的增加在HPA-treated apoptosis-related蛋白质组。Cleavage-caspase-8、caspase-9 caspase-3蛋白质发挥重要作用在细胞凋亡35]。UVB照射导致更大的这三种蛋白的表达,与HPA显著抑制和治疗这些紫外线辐射诱导apoptosis-related蛋白质的表达的变化,如图6(c)和6(d)。

4所示。结论

结果表明,纯化从下丘脑-垂体-肾上腺轴的H。pluvialis可以再生受伤皮肤受到UVB-induced photodamage吗在体外和在活的有机体内(图7)。本研究显示HPA Hs68 HaCaT和细胞的再生式效果的差别通过减少DNA损伤和对这些半胱天冬酶和ERK蛋白。HPA减少活性氧积累,随后引起炎症,抑制UVB-induced细胞凋亡在活的有机体内,减少皮肤老化。

数据可用性

作者确认所有可用数据完全没有限制。所有相关数据描述在纸上。

信息披露

Hsin-Yu周的主持下进行了他的论文研究在组织工程和再生医学博士项目,国立中兴大学和国家卫生研究院。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

作者的贡献

Hsin-Yu周,Chung-Hang Leung Dik-Lung Ma Chien-Chih赵,Tzyh-Chyuan小时,王Hui-Min大卫进行实验和分析数据。王Tzyh-Chyuan小时Hui-Min大卫贡献试剂/材料/分析工具。Hsin-Yu周,Chung-Hang Leung Dik-Lung Ma Chien-Chih赵,Tzyh-Chyuan小时,王Hui-Min大卫写的论文。

确认

这项工作是由科技部支持的(大多数108 - 2221 - e - 005 - 044)。我们感谢Jui-Jen Chang博士和妤如林博士的援助。

补充材料

图S1: HPE提取获得HPA。高效液相色谱法(HPLC)过程,HPA含有高纯度超过95%的虾青素。(补充材料)