文摘
阿尔茨海默病(AD)的特点是异常蛋白质聚合沉积的细胞外β淀粉样蛋白(β),除了增加氧化应激。羊水干细胞(AFSCs)应该有一个治疗神经退行性疾病,主要通过旁分泌的影响由细胞外囊泡(EV)。在这里,我们审查的影响电动汽车源于人类AFSCs (AFSC-EV)在广告神经元疾病表型主要文化。我们观察到一个积极AFSC-EV对神经元形态学的影响,生存能力,β和phospho-Tau水平。这可能是由于凋亡和自噬通路调制来自减少氧化应激。事实上,活性氧(ROS)减少,而谷胱甘肽水平提高。这个灯可以归因于ROS调节酶的存在,如SOD1礼物AFSC-EV本身。本研究描述了ROS-modulating细胞外囊泡的影响,除了产生干细胞,在一个广告在体外模型,提出AFSC-EV作为一种治疗工具停止广告的发展。
1。介绍
神经退行性疾病的特点是渐进损伤神经细胞导致破坏电动机或认知功能。阿尔茨海默病(AD)是美国第六大死因,这是最常见的神经退行性疾病,严重影响人们的日常生活1]。广告主要是与细胞外的病理生理学(β淀粉样蛋白的沉积β神经原纤维缠结)斑块和细胞内的积累τ(非功能性测试)2]。背后的机制β神经毒性作用可能是几个;其中许多流入活性氧(ROS)生成。例如,一个β斑块可以减少在内质网钙离子存储,然后导致胞质Ca2 +过载。由于胞质Ca2 +增加,内源性谷胱甘肽(GSH)含量减少,ROS overaccumulated内细胞(3]。此外,一个β蛋白质可以直接导致自由基的形成通过NADPH氧化酶的活化4]。事实上,ROS是化学活性分子参与神经退行性疾病的发病机制。虽然尚不清楚是否ROS可能是神经退行性疾病的引发因素,他们可能要考虑疾病恶化加剧球员通过氧化损伤5,6]。值得注意的是,神经细胞特别容易受到氧化损伤,因为它们在膜不饱和脂肪酸含量高,高耗氧量和弱抗氧化防御(7]。
此外,ROS能调节物/压力激发了蛋白激酶通路。激活这些瀑布hyperphosphorylationτ蛋白和有关β全身的细胞死亡(8]。一些神经退行性疾病的发病机制,如广告和帕金森病,与错误折叠蛋白质的积累有关。炎症反应在大脑中可以激活来抵消这些改性蛋白的聚合,而诱导活性氧释放和随后的氧化应激(OS) (9,10]。因此,一个恶性循环,ROS水平增加,似乎被触发。考虑到操作系统的关键角色在神经退行性疾病,ROS水平可能是一个有前途的目标的规定减缓神经退化和缓解相关症状。然而,大多数的抗氧化剂研究,证明几乎成功的临床试验中,这可能是由于他们的稀缺的分布和固有困难穿过血脑屏障,到达目标地点。尽管有证据表明neuroprotectants不同类型的抗氧化剂在体外临床数据是不一致的11]。基于这些考虑,找到一个方法将神经、抗炎和内源性抗氧化剂处理属性可能蕴含着巨大的希望,以抵消广告症状。
间充质干细胞(msc),特别是MSC-derived细胞外囊泡(EV),可以提出一个战略方法对比这一病理。事实上,MSC-EV-carrying脂质/蛋白质/酶/小分子核糖核酸具有抗炎,β降解系统,神经营养活动(12——是治疗工具结合不同的属性能够恢复突触功能,防止神经元死亡,减缓记忆障碍在广告。
几次示威活动的影响MSC-EV降低广告标记出现在文学在体外广告细胞模型。接触MSC-EV首次调查了在细胞模型的广告通过使用电动车从脂肪组织分离msc。的孵化MSC-EVs N2A神经母细胞瘤细胞减少分泌和细胞内β肽水平(13]。同样,最近MSC transwell coculture的老鼠神经细胞暴露于可溶性低聚物β肽(βOs)诱导的内化和退化β操作系统,释放细胞外囊泡含有积极的过氧化氢酶,和选择性的分泌白细胞介素- 6、白细胞介素- 10”,血管内皮生长因子中(14]。
羊水干细胞(AFSCs)是一个可行的各种MSC为实验目的,由于他们的pluri /多能——丰富,和最小的伦理方面的考虑。我们最近报道,AFSC分泌因素凋亡和抗炎作用15,16]。据报道,尽管干细胞的旁分泌功能在许多神经系统疾病有治疗潜力,AFSC-derived细胞外囊泡的影响(AFSC-EV)细胞表型的广告尚未研究。神经元的主要文化,源自5 xfad老鼠(17,18),动物模型的广告,在这里用来调查一个浓缩的作用在细胞外囊泡从人类AFSCs形态学特征,细胞凋亡/可行性参数,和广告标记。我们集中我们的注意力在EV-modulation ROS水平的关键抵消神经退行性疾病的关键。
2。材料和方法
2.1。羊水集合
AFSCs是获得从羊膜液体收集4例健康孕妇孕16周时接受羊膜穿刺术的母亲请求(不是胎儿异常)的单位产科和妇科,IRCCS-ASMN Reggio Emilia亲自到医院的摩德纳(意大利)。羊膜穿刺术是连续超声指导下进行,无菌字段,23-Gauge针。相关的手术风险和这项研究的目的是解释所有患者手术前和妇产科医师专家收集签名同意在开始考试之前(协议02.24.2015和协议日期为360/2017的2015/0004362 12.15.2017面积Vasta伊米莉亚Nord)批准。在这项研究中,多余的(未使用的)瓶AF细胞,在实验室培养的遗传学测试实验室(意大利摩德纳)2周,是使用。
2.2。成年人体组织隔离和细胞培养
AFSCs分离(如前所述)(19]。人类羊膜穿刺术文化被胰蛋白酶化和收获进行c - kit免疫选择mac技术(Miltenyi研究,德国)。AFSCs亚文化通常在1:3稀释和不允许超出70%的融合。AFSCs生长在培养基(αMEM)补充20%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(从EuroClone Spa、米兰、意大利)。
2.3。细胞外泡隔离条件培养基
AFSCs生长在75厘米2瓶直到subconfluence ( )。在细胞外囊提取之前,细胞维持4天在10毫升培养基剥夺的边后卫为了排除污染的细胞外囊泡组成的边后卫的解决方案。的分泌部分条件培养液(CM)然后集中2毫升用离心过滤单元与3 K截止(15]。然后,集中CM处理总外来体隔离解决方案从细胞培养介质(表达载体,生活技术,CA。美国),根据制造商的指示。颗粒,浓缩液虽然可以不是一个纯粹的提取,由布拉德福德收集和量化方法。获得一个样本进行免疫印迹分析,颗粒在裂解resuspended缓冲区。我们之前显示细胞外囊泡的形态表征电子显微镜(15]。
隔离的surnatants推导协议(ev)收集。神经母细胞瘤细胞系SH-SY 5 y,培养1:1 DMEM (EuroClone Spa、米兰、意大利)/ F12 (EuroClone Spa、米兰、意大利),1%胎牛血清(的边后卫)(Microgem,那不勒斯,意大利),2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素,1毫米不是必不可少的氨基酸(从EuroClone Spa、米兰、意大利),被暴露在10μ米一个β1-42(美国加州Anaspec Inc .) 24 h为了测试电动汽车和电动汽车在一个简单的广告在体外模型。+电动汽车和电动汽车的相同的蛋白质浓度添加到神经细胞前3天β治疗。
2.4。动物
5 xfad老鼠cooverexpress三倍体突变的人类淀粉样前体蛋白(APP)(瑞典突变:K670N M671L;佛罗里达突变:I716V;伦敦突变:V717I)和人类presenilin double-mutant 1 (PS1) (M146L和L286V突变)转基因的转录控制下神经元的特定Thy-1催化剂。祖细胞从杰克逊实验室购买,巴尔港,5 xfad线是由交叉半合5 xfad B6SJL / J小鼠增殖。老鼠和稳定的保持条件的房间温度( )和湿度(60%)、光/暗周期12小时,提供食物和水随意。所有动物程序委员会批准的动物卫生和护理的摩德纳大学Reggio Emilia(协议编号:974/2016-PR德尔13-10-2016),按照美国国立卫生研究院的指导方针。
基因分型结果的过程,应用程序和PS1行正如前面分析报告(戈登et al . 2001年)。尾巴WT样本和5 xfad老鼠用引物由杰克逊实验室进行检查来确定突变或野生型等位基因的聚合酶链反应(PCR):向前,5 - - - - - -AGGACTGACCACTCGACCAG-3和反向,5 - - - - - -CGGGGGTCT AGTTCTGCAT-3应用转基因;向前,5 - - - - - -CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3和反向5 - - - - - -GTAGGTGGAAATTCTAGCATCA-TCC-3积极的控制;向前,5 - - - - - -AAT AGA棉酚CGG CAG GAG CA-3和反向5 - - - - - -GCC ATG gg GCA CTA ATC 3对于hPRES转基因。在94°C DNA聚合3分钟;35周期为15秒94°C;1分钟54°C;1分钟72°C;为2分钟和72°C;储存在4°C。PCR产品运行在1%琼脂糖凝胶,用溴化乙锭紫外线(UV)检测的乐队在377个基点(APP转基因)或324个基点(积极控制)和608个基点(hPRES)。
2.5。的制备主要培养皮层神经元
皮质和海马神经元从野生型(WT) ( )和5 xfad(时尚)( )老鼠在出生24小时内收集(20.]。大脑被移除,脑膜轻轻剥离,大脑皮层和海马组织解剖。组织培养在缓冲溶液包含哈佛商学院(汉克斯平衡盐溶液,GIBCO、米兰、意大利)与BSA 0.3% (Microgem Srl,那不勒斯,意大利)和0.025%胰蛋白酶(EuroClone、米兰、意大利)37°C,持续15分钟。然后,组织与1000年塑料磨碎μl吸管提示我在哈佛商学院缓冲区包含0.004%脱氧核糖核酸酶(DNAseI,西格玛奥德里奇)和10%胎牛血清(的边后卫,Microgem Srl)。在500 g离心5分钟后,细胞悬浮在Neurobasal中补充2% B27 (GIBCO热费希尔科学,蒙扎,意大利),2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和100μg / ml链霉素(EuroClone)和镀poly-L-lysine(默克密理博、米兰、意大利)涂塑料或盖玻片0.5 x106细胞/厘米2。细胞被维持在37°C和5%的公司2。48小时后,细胞治疗5μM胞嘧啶β-D-arabinofuranoside(西格玛奥德里奇)24 h。
为在体外实验中,10μg细胞外囊泡,从两个人获得的样本AFSCs, resuspended在PBS,被添加到 细胞在DIV(天在体外3)7到14天。
渥曼青霉素(西格玛奥德里奇)治疗前进行2 h EV曝光。
2.6。细胞形态
细胞图像获得使用evo XL核心细胞成像系统(热费希尔科学,万塔,芬兰)。参数和面积测量ImageJ利用图像像素规模。细胞伸长是使用以下公式计算: 在哪里是细胞周长,相当于3.14,代表了细胞区域。
2.7。MTT试验
主要神经元被播种在96 - 200年孔板μl培养基,为每个条件4复制。在每个实验,0.5毫克/毫升MTT添加和孵化3 h在37°C。孵化后,中摘除和酸化异丙醇加入溶解甲瓒盐(21]。吸光度测量在570 nm使用微型板块分光光度计(Appliskan热费希尔科学,万塔,芬兰)。
2.8。ROS和谷胱甘肽检测
评价细胞内ROS水平,dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)测定了类似如前所述[22]。细胞被播种在黑色的96孔板,4为每个条件复制。细胞培养基被删除,5μM DCFH-DA孵化在PBS为30分钟,在37°C和5%的公司2。细胞培养板是用PBS,荧光的细胞是在485 nm(激励)和535海里(排放)使用多层读者Appliskan(热费希尔科学,万塔,芬兰)。细胞自体荧光作为背景使用的值减去井不孵化与调查。
同样,评估谷胱甘肽水平降低,monochlorobimane (MCB)测定了如前所报道(23]。细胞培养基被移除,50μM MCB在PBS孵化30分钟,在37°C和5%的公司2。在PBS的细胞被洗,荧光的细胞为355 nm(激励)和460 nm(排放)。
2.9。量化的β通过ELISA
β淀粉样蛋白分泌peptide1-42 (Aβ42)从主要分析了培养神经元介质接触BETA-APP42神经元的酶联免疫试剂盒(人类)(英杰华系统生物学、圣地亚哥、钙、美国)。
媒介从5 xfad细胞治疗AFSC-EV 7天收集和控制然后离心机在20°C 1200 rpm 10分钟为了消除细胞碎片。
上层清液集中大约10倍通过冻干LIO5P(5帕斯卡、MI、意大利)(太阳et al . 2014年)。冷冻干燥粉获得6毫升的媒介接触神经元与600患者μl的纯净水和存储+ 4°C到测试。集中媒体被用于ELISA测定。
一个βELISA根据制造商的协议执行的酶联免疫试剂盒(英杰华系统生物学、圣地亚哥、钙、美国)。
2.10。细胞提取物制备
细胞提取得到如前所述[24]。除了短暂,subconfluent细胞提取的裂解缓冲(20毫米Tris-Cl, pH值7.0;1%诺乃清洁剂p 40;150毫米氯化钠;10%甘油;10毫米EDTA;20毫米氟化钠;5毫米焦磷酸钠;Na和1毫米3签证官4)和新添加的西格玛奥德里奇蛋白酶抑制剂鸡尾酒和para-Nitrophenylphosphate在4°C (pNPP)等了20分钟。溶菌产物用,通过离心,立即煮在SDS减少样本缓冲区。
2.11。SDS PAGE和免疫印迹
完整的细胞溶解产物从初级神经元和AFSC-EV处理如前所述[25]。主要提出了抗体对下列分子:肌动蛋白,Nox4 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),一种蛋白激酶,SOD1, SIRT1, gp91phox, TrxR1, TrxR2, Gpx1 LC3β、PARP TIA-1(圣克鲁斯生物技术、钙、美国),pAktser473(美国)细胞信号技术,马β淀粉样蛋白克隆6 e10(美国生物传说,CA), pTauser422(美国马里兰州OriGene技术),Rab5(美国SC Lonza), CD9(美国生命科技,CA)的研究(美国马热费希尔科学)、bcl - 2(生物来源、钙、美国)。
二次抗体,用于1:3000稀释,都从热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)。
2.12。免疫荧光和共焦显微镜
免疫荧光分析,主要神经元播种在涂盖玻片处理和共焦成像进行了使用尼康A1共焦激光扫描显微镜,如前所述[26]。
主要的抗体检测β微管蛋白3(微孔、钙、美国),pTauser422(美国马里兰州OriGene技术),6 e10(美国生物传说,CA)数据表建议稀释后使用。Alexa二级抗体(美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)被使用在1:200稀释。
共焦串行部分加工与ImageJ软件均获得三维预测。渲染的图像是由Adobe Photoshop软件。
细胞凋亡检测,3洗后50μl绑定缓冲(10毫米玫瑰,pH值7.5,包含140毫米氯化钠,CaCl和2.5毫米2),标本与50孵化15分钟μl双染色法解决方案(包含0.25绑定缓冲μl的膜联蛋白V-FITC和0.25μl (propidium碘(π);BD Pharmingen™, Erembodegem,比利时)。最后,标本与50洗了5次μl具有约束力的缓冲区,安装有15μl具有约束力的缓冲区,和可视化荧光显微镜下24]。
2.13。统计分析
在体外实验进行了一式三份。定量比较,价值观被报道 根据每个样本一式三份分析。测试观察到的差异的重要性在学习小组中,单向方差分析与Bonferroni事后测试或学生测试(只有两个样本进行比较)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。时尚和时尚+ EV相比WT样本和样本方差分析分析显示星号在列;同样的分析显示,比较时尚和时尚+ EV和significativity与额外的星号就行。统计分析和情节布局是通过使用获得GraphPad棱镜®6.0版本软件。
3所示。结果
3.1。培养的神经元的形态学特征暴露于AFSC-EV
时尚神经元出现不健康,如果相比WT神经元,神经退化以来流行的神经元是突出的,如核膜萎缩(图所示1(一)较低的图像(图)和神经突恶化1(一)上图片),如图表所示显示数字,长度和厚度(图1 (b))。14天EV治疗的效果是为了抵消核膜修改,避免神经突的损失,因为神经突的措施参数带回WT的相似。在所有的实验中也获得了类似的调查结果所示,尽管个人变化由于AFSC样本来自不同的女人。
(一)
(b)
3.2。ROS AFSC-EV调制的时尚神经元
ROS的分析内容如图2(一个)透露,时尚神经元表现出更高的ROS水平与WT细胞相比,如预期。相反,谷胱甘肽是低流行神经元,即使不显著。然而,暴露在AFSC-EV ROS含量降低,同时允许增加谷胱甘肽的水平。
(一)
(b)
(c)
然后,我们研究蛋白质的表达与ROS调制,和白平衡分析(图2 (b))表明,抗氧化剂酶,如SOD1、硫氧还蛋白还原酶TrxR1 TrxR2,谷胱甘肽过氧化物酶1 (Gpx1),都比时尚更出现在时尚+ EV神经元细胞。时尚和WT没有显示差异的比较,为TrxR1除外。TrxR1表达时尚的增加可能与神经元的胞内防御活性氧增加,我们以前观察到的。
同时,时尚神经元表现出更高层次的Nox4, ROS产生酶持续活跃。事实上,它不需要激活胞质子单元,尽管它们能够调节Nox4活动。这种效应是减少,至少部分的电动汽车。同时,没有观察到的差异的表达gp91phox, Nox2的典型单元,另一个NADPH氧化酶表达进入大脑。除了吞噬细胞,包括小胶质细胞,Nox2也发现内皮细胞和神经元27]。
有趣的是,AFSC-EV透露,所有的样品的表征,尽管具有不同程度的外来体标记(CD9、研究和Rab5),进行类似的SOD1蛋白质水平。
3.3。AFSC-EV对凋亡和自噬通路的影响
神经元生存在时尚神经元显著下降了25%在DIV(天在体外14)文化,相比WT神经元(图3(一个))。并行,分析细胞凋亡的膜联蛋白V和propidium碘(PI)表明,凋亡通路,如预期(图3 (b))。然而,电动汽车的存在极大地恢复细胞活力,降低膜联蛋白V和PI染色(数字3(一个)和3 (b))。根据这个结果,我们的免疫印迹数据进一步证明了一种蛋白激酶的激活增加,神经元生存的关键信号分子,由磷酸化越高,表示伴随bcl - 2激活,抗凋亡标记,在时尚+ EV神经元(图3 (c))。此外,PARP的乳沟,明显高于在时尚神经元,EV-treatment WT相比,降低了。这些结果表明,降低细胞生存能力与凋亡通路的激活相关时尚神经元可以通过AFSC-EV包含。
(一)
(b)
(c)
为了测试PI3K / Akt通路的作用,我们用渥曼青霉素,磷脂酰肌醇的选择性和不可逆抑制剂3-kinase (PI3K)。结果在ROS和细胞凋亡(补充图我)表明,抑制PI3K / Akt通路部分影响细胞外泡灯,表明其参与EV功效。
自噬通路也调制通过AFSC-EV内容证明了SIRT1的水平上升,第三NAD-dependent类组蛋白和非组蛋白的蛋白脱乙酰酶,和LC3β蛋白质。自噬蛋白标记,和他们的表达改变在广告(28]。
3.4。减少广告标记AFSC-EV的存在
最后我们研究了胞内广告标记的调制,利用抗体6 e10,具体为人类淀粉样前体蛋白(APP)β低聚物(29日),和分子产生解理分泌酶的应用(30.422年],anti-Tau磷酸化丝氨酸(31日),一个病态的表位和神经原纤维变性的标志之一:两者都是阿尔茨海默病神经病理学的特点。
我们的免疫印迹结果表明应用的水平,β低聚糖,p-Tauser422在EV-treated广告减少神经元(数据4(一)和4 (c))。这些结果证实了免疫荧光图像如图4 (b)和4 (d),6 e10 p-Tau的信号ser422在EV-samples下降。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
此外,分泌的定量检测β42展示AFSC-extracellular泡的积极影响时尚神经元,自生产的β在广告的神经元是治疗后下降。
4所示。讨论
在过去的几十年里,干细胞已成为人们关注的焦点作为再生医学的一个有前途的候选人。其中,从羊水间充质基质细胞(AFSCs)已被证明有利于组织修复和再生移植后inflammatory-based疾病的动物模型。羊膜移植细胞被观察到的好处尽管受伤组织细胞移植,因此这表明这些细胞产生生物活性因子能够通过旁分泌信号调节上述效应(32]。干细胞分泌各种分子如生长因子和细胞外囊泡(33),能够调节氧化应激。由于内生和微环境氧化应激可能是一个关键因素加剧通路开车去神经损失在广告34),在这里,我们探讨的影响悬液浓缩,源自AFSCs在文化、从广告获得小鼠神经元的生存能力,并证明了氧化还原状态是深深被这种接触。
我们意识到使用隔离技术可以给可能的差异相比,超速离心法和SEC协议:事实上,它已经表明,这包给了最高产量但准备显示广泛的大小分布可能由于微泡联合沉淀,至少分散稳定性(35]。因此,为了这些细胞外囊泡的疗效进行比较,获得商业工具,检查参与组成分泌腺的另一部分,即上层清液来自这样的孤立过程(ev),我们进行可行性和ROS分析认识到体外广告模式,SH-SY 5 y接触到β治疗+电动汽车或电动车。结果,补充图所示二世在其他类型的细胞,证实了我们以前的观测(人类淋巴细胞)15):事实上,电动汽车的存在显示增加的可行性β治疗细胞ROS含量减少,但电动车没有施加任何调制,支持细胞外囊泡的有效性影响神经元从广告获得老鼠。
这样的灯,上面所描述的那样,发生在与细胞外的积累减少淀粉样蛋白-β。因此,生化改变广告的关键是修改的活性氧β成有毒产品,逐步聚合成老年斑促进细胞凋亡(36]。事实上,现在相当多的证据表明,可溶性β寡聚物、单体和原纤丝,而不是存款,淀粉样蛋白是主要的毒性在广告代理37]。一直,我们观察到应用程序和减少β寡聚物细胞内的内容。
符合这一考虑,我们注意到救援的神经元生存能力暴露AFSC-EV伴随着下降凋亡标记。此外,形态方面,产生神经毒性,神经突和核膜等修改,是预防。组成的典型的核异常改变核被膜/板结构被观察到在一些与年龄相关的疾病(38和在广告39]。
其他广告特性也考虑在内,比如吞噬的障碍,τ磷酸化,由于他们两人,在某种程度上,与氧化还原不平衡有关。事实上,氧化应激也支持一个进步的过程失败在神经细胞自噬促进τ磷酸化,然后导致记忆受损赤字(1]。此外,越来越多的证据表明,程序处理和一个β释放是τ病理学的上游。τhyperphosphorylation与自噬功能障碍,提高水平的溶酶体蛋白酶发生在AD患者(40]。的确,我们注意到时尚样本显示更高级别的LC3B,蛋白质参与autophagosomal空泡的形成,一个事件可能由于早期细胞反应需要消除蛋白质总量,这仍不足以抵消病理学的进展。更有趣的是,我们观察到细胞外囊泡的存在治疗诱导自噬的进一步增加LC3B标志。EV政府积极监管SIRT1的表达式。这种影响支持拟议中的细胞外囊泡的作用在调节ROS水平和自噬,自sirtuins蛋白抗氧化和抗凋亡和溶酶体自噬调控至关重要的介质,而在广告中起着举足轻重的作用41]。
此外,ROS可以调节自噬通过多种信号通路,如PI3K / Akt, AMPK。这些途径似乎是至关重要的自相关τ蛋白hyperphosphorylation广告。此外,PI3K / Akt通路已被证明发挥重要作用在神经保护和抑制细胞凋亡通过增强表达的杆42]。同样,在这里,我们表明,细胞外囊泡的存在支持一种蛋白激酶的激活,这种蛋白质更EV-exposure后磷酸化。此外,在抑制PI3K / Akt通路的情况下,细胞外泡调制ROS和细胞凋亡的影响,表明其部分参与EV功效。所有这些数据符合广告的进行观测模型,生成的治疗在体外SH-SY 5 y细胞(人工神经母细胞瘤细胞系)β,作者表明,BM-MSCs刺激神经元自噬在患病的暴露于有毒蛋白质总量和总降解的增强,从而增加神经元生存(43]。
有趣的是,然后我们确认AFSC-extracellular囊泡的治疗预防Tau蛋白的磷酸化丝氨酸422,典型的磷酸化发生在网站广告(31日),这表明氧化还原调控的细胞外囊泡可能影响整个AD发病机制。这是符合这一假说,ROS增加生产可能发展的不可或缺的角色散广告之前,淀粉样的外观和τ病理学(44]。
德戈等人提出的机制。14)来解释,至少部分由MSC-EVs属于神经保护的内容在抗氧化酶和抗炎和/或营养分子。作者表明,电动汽车由msc分泌包含和携带内源性过氧化氢酶,赋予EVs ROS清除活动。同样的,我们清楚地观察到SOD1包含AFSC-extracellular囊泡。SOD1的存在可能的保护机制的细胞外囊泡在神经退化,避免过多的活性氧。减少减少谷胱甘肽(GSH)导致活性氧的生产过剩导致氧化应激,从而支持AD发病机制(45]。在这里,我们表明,暴露在AFSC-EV诱导显著增加谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)酶;因此,毫不奇怪,EV-treatment神经元增加了时尚的谷胱甘肽水平。这些样本显示略小的谷胱甘肽的含量,与WT相比,根据获得的数据在这里等人在3 xtg-ad老鼠,一个广告小鼠模型,观察的谷胱甘肽水平降低(46]。一个类似的趋势,即使没有统计学意义,还发生在WT细胞,当接受电动汽车。WT之间的细微差别和时尚神经元在谷胱甘肽水平7天后文化可能是由于细胞防御可以注意到在抗氧化酶的表达增加硫氧还蛋白还原酶1 (TrxR1)。此外,TrxR1和TrxR2 EV-exposure后出现飙升,贡献与SOD1 Gpx ROS减少观察到这些样品。这个复杂的氧化还原平衡也受到prooxidant酶的存在,即NADPH氧化酶类。在本实验条件下,Nox4,同种型持续活跃,显示时尚高含量样品,正在减少,至少部分,EV-treatment之后。关于gp91phox, Nox2的特定亚基,不可能观察到的差异,也许是因为这个同种型的激活大多是来自一个调节亚基相互作用[27]。
我们的数据分析表明,细胞外囊泡来源于干细胞对神经元受到广告的影响,直接影响调制ROS的内容。与此同时,大部分的文献显示了一个间接的治疗潜力,减少小胶质激活(强调监管的神经炎症47][48][49]。
我们之前已经证明AFSC-extracellular囊泡含有抗炎分子,即HFG TGFβ,和pentraxin 3 (15]显示对骨关节炎疗效[16]。即使在这种情况下,pentraxin 3,即蛋白质调节器的血管生成和神经发生与直接参与神经炎症急性阶段(50),有治疗作用。积极的去检查参与组成分泌腺MSC对这两方面的影响,即神经元和小胶质细胞,可以获胜的关键,证明令人鼓舞的结果利用MSC广告功能在活的有机体内。例如,人类脐带血液和脂肪细胞的移植MSC,老鼠的海马广告模型,减少一个β斑块,增加内源性成年神经发生和突触活动,和增强认知功能(51][52]。
5。结论
总之,在这项研究中,我们集中我们的注意力在细胞外囊泡在预防疾病表型只有神经元的文化。我们采用细胞源于5 xfad老鼠(53),一个更完整的动物模型的广告,如果Tg2576相比的主要神经元得到李等人的研究。54]。事实上,Tg2576小鼠模型只能携带一个人类淀粉样前体蛋白突变(APPswe) [55]。然而,在我们的模型中,暴露MSC细胞外囊泡改善的进展β全身的神经元死亡和广告,支持细胞外囊泡的李等人提出的想法,在这种情况下来自脂肪组织,可以起到疾病作用[54]。此外,在这里,我们清楚地演示了一个ROS监管参与细胞外囊泡在神经退行性疾病治疗效果,比如广告。
缩写
| AFSCs: | 羊水干细胞 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| DCFH-DA: | Dichlorodihydrofluorescein二乙酸 |
| DAPI: | 4 ,6-diamidino-2-phenylindole |
| EDTA: | 乙二胺四乙酸 |
| 电动汽车: | 细胞外囊泡 |
| PBS: | 磷酸缓冲盐 |
| 玫瑰: | (4)- 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸 |
| MCB: | Monochlorobimane |
| SDS: | 十二烷基硫酸钠 |
| 白平衡: | 免疫印迹。 |
数据可用性
之前报道电镜数据被用来支持这项研究和可用doi:10.1002 / biof.1407。这些先前的研究(和数据)是在相关地方引用文本中引用(15]。
伦理批准
一个知情同意允许使用指定的临床数据和生物样品的研究目的(协议日期为12.15.2017 360/2017)被所有的不育夫妇签署之前收集的治疗和产科和妇科的单位,亲自到摩德纳(意大利)。
的利益冲突
作者报告没有利益冲突,因为没有人商业协会,可以创建一个利益冲突与提交的手稿。
作者的贡献
毫克,博士生,细胞外囊泡进行拔牙;MZ,实验室技术员,孤立的神经元;FB、实验室技术员进行ELISA分析;电动汽车、博士和DG博士负责5 xfad老鼠的殖民地;AO博士进行免疫印迹分析;EB, MD,羊膜液和知情同意收集;TM,π的集团,负责的设计工作,收购,和解释数据和起草的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
这项工作是支持的拨款(每la Ricerca洋底di Ateneo)和基金会Cassa di Risparmio迪卡普里。我们感谢博士Antonietta Vilella老鼠型服务。
补充材料
补充图我:抑制效果P13K / Akt神经元细胞凋亡和ROS的时尚。补充图二:检查参与组成分泌腺hAFSC对AB-induced神经元毒性的影响,ROS水平。(补充材料)