新生儿氧过多会使Claudin-4、Occludin ZO-1表达鼠肾脏伴随着近端肾小管受损发展

文摘

早产儿但氧过多是必不可少的管理导致肾脏损伤不成熟。先前的研究表明,氧过多导致氧化损伤新生儿肾脏损害肾发展。然而,新生儿氧过多影响的潜在机制不成熟的肾脏还有待阐明。紧密连接,其中代表蛋白质claudin-4 occludin, ZO-1,起着至关重要的作用在nephrogenesis和维持肾功能。炎性细胞因子参与的多效性的调节紧密连接蛋白。在这里,我们调查新生儿氧过多如何影响关键紧密连接蛋白的表达和炎症因子(il - 6和TNF -α)发展中鼠肾脏和阐明与肾损伤的相关性。我们发现claudin-4、occludin zonula occludens-1 (ZO-1)在近端小管表达显著下调后新生儿氧过多。这些紧密连接蛋白的表达呈正相关,il - 6和TNF -α,而claudin-4表达呈正相关,损伤肾脏近端小管的成熟。这些发现表明,紧密连接蛋白的表达在肾脏受损可能是一个潜在的机制hyperoxia-induced肾原性的疾病。它提供了新的见解,进一步研究肾脏氧化损伤和发展障碍,并将有助于在未来寻求hyperoxia-induced潜在治疗肾损伤。

1。介绍

补充氧气疗法(氧过多)一般管理管理的早产儿呼吸系统疾病(1,2]。尽管如此,越来越多的证据来自各种临床与实验观察表明,新生儿氧过多可能会导致氧化损伤和肾小球和管状成熟造成不利影响3,4]。这些负面影响是通过扩大肾小体、肾小管损伤,在围产期和间质炎症,这可能延续到成人期和肾功能的影响5,6]。然而,氧过多接触的具体效果和机制不成熟的肾损伤仍然未知。

我们认识到完整的结构和屏障紧密连接所需的肾功能(7]。紧密连接,作为肾小球滤过膜组件,起着重要的作用在肾过滤和维持肾小球通透性(8]。与nephrin紧密连接在一起,称为狭缝横隔膜,连接相邻在肾小球足细胞足突9]。此外,在近端小管紧密连接障碍使电解质和有机营养物质的选择性再吸收分离管腔从基底外侧细胞表面10]。收集管的paracellular渗透率,在电解质重吸收和分泌中起关键作用,也是主要由紧密连接(11]。

除了这些重要功能在成熟的肾脏,紧密连接在nephrogenesis也扮演着重要的角色。在人类,nephrogenesis一直持续到怀孕32到36周,在此期间早产儿通常暴露于氧过多,而在老鼠,nephrogenesis收益直到产后5到8天,成为敏感窗口研究大鼠肾脏的氧过多接触(5,12]。肾脏接受发展出生后几个月,直到成年形态和大小达到[13]。在此期间,紧密连接障碍阻止肾上皮细胞和其他结构的基底膜下他们直接接触滤液,从而保持了微环境适合nephrogenesis [14]。

越来越多的证据表明,新生儿氧过多会削弱nephrogenesis [15,16]。然而,新生儿氧过多是否会改变紧密连接蛋白的表达在发展中肾脏,并进一步影响nephrogenesis仍不清楚。因此,我们假设新生儿氧过多可能会改变紧密连接蛋白表达在不成熟的肾脏,并进一步影响肾发育。

Claudin-4、阻塞和ZO-1,紧密连接的关键组件,起着至关重要的作用在正常肾功能(17- - - - - -19]。Claudin-4属于claudin CLDN4家人和编码的基因,这是位于染色体7。也是一个完整的膜蛋白是一个组件的上皮细胞紧密连接,调节溶质的运动和离子通过paracellular空间(17]。OCLN Occludin编码的基因,这是位于5号染色体和细胞因子诱导的监管需要紧密连接paracellular渗透屏障(20.]。Occludin的一个关键组成部分参与肾小球内皮细胞的研究进展(18]。TJP1 ZO-1编码的基因,这是位于15号染色体和作为一个紧密连接适配器蛋白质,也调节附着连接。这种支架蛋白的多畴的结构包括一个突触后密度95 / disc-large /带occludens (PDZ)领域,一个Src同源性(SH3)领域,一个鸟苷激酶(鞠觉亮)域和独特的(U)图案,所有坐标绑定的跨膜蛋白,胞质蛋白,和f -肌动蛋白需要紧密连接功能(21]。

炎性细胞因子参与的多效性的调节紧密连接蛋白。白介素6 (il - 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)诱导屏障功能障碍紧密连接的22,23]。另一方面,il - 6和TNF -α也有一个保护作用紧密连接障碍(24- - - - - -27]。il - 6和TNF -的监管效果α在发展中肾脏氧过多暴露后仍不清楚。我们研究的目的是阐明新生儿的影响氧过多暴露在关键紧密连接蛋白的表达(claudin-4、occludin ZO-1)和炎症因子(il - 6和TNF -α)发展中肾脏和肾损伤和nephrogenesis阐明他们的相关性。

2。材料和方法

2.1。动物模型

怀孕Sprague-Dawley老鼠购买实验动物中心的中国医科大学盛京医院。所有动物的程序下进行盛京医院的伦理委员会批准,中国医科大学(ps362k项目识别代码:2016)。本研究的动物保健和实验过程进行了符合美国动物福利法案和执行按照标准实验动物研究所的资源(ILAR)指南(1996)。孕龄的幼崽出生21到23天。出生后24小时内,所有的幼崽被随机分为normoxia集团( , )或氧过多组( , )(补充图1)。母亲是旋转normoxia和氧过多暴露窝之间每24 h大坝防止氧中毒。动物的体重每天都被记录。动物安乐死的批准的安乐死方法如下:动物安乐死的二氧化碳气体接触大约5分钟先接触3 L / min的二氧化碳到老鼠是无意识的;然后,流动是升级到最高设置产生更多的快窒息。后立即安乐死,肾组织收获1日,3日,5日,7日,10日,14日,30日(暴露于normoxia或氧过多前14天),和60(暴露于normoxia或氧过多前14天)产后天( /时间点/接触)。左肾被固定在4%多聚甲醛(PFA)苏木精和伊红染色和免疫组织化学染色(圆)),和右肾为西方墨点法保持在-80°C。

2.2。肾脏组织学

固定在4% pfa 24 h后,肾脏样本梯度乙醇脱水,然后嵌入在石蜡和纵向切割(4μ米))染色。十字段的视图被随机选择和观察到的原始放大×400。由两个病理组织学评估进行盲目。评估肾小球直径修改的建议Toledo-Rodriguez et al。28]。数字图像的软件ImageJ 1.51)染色法进行了分析。网格点的数量被肾小球数。肾小球直径是根据数量来计算网格点的规模的酒吧。个人的大小肾小球位于中间皮层和juxtamedullary区域计算的平均最大的和最小的肾小球内直径的视野;涉及的计算每个肾脏十字段的视图。管损伤的意义是由评价管状扩张,肾小管萎缩,空泡形成,肾小管上皮细胞的变性和脱落,或肾小管基底膜增厚。如前所述,使用的评分系统只有近端小管对管状损伤评估,0 =没有管损伤,1 = < 10%的小管受伤,2 = 10 - 25%的小管受伤,3 = 26 - 50%的小管受伤,4 = 51 - 75%的小管受伤,5 = > 75%的小管(受伤29日]。演员计数的数量是由量化pink-stained结构的扩张腔外髓收集管道每毫米²(30.]。涉及的计算每样10字段的视图。

2.3。免疫组织化学染色

蛋白表达的评价通过免疫组织化学染色显示修改之前的研究(4]。大鼠肾脏幻灯片脱蜡、水化放置在柠檬酸钠和微波抗原检索。非特异性染色阻断剂添加到幻灯片和孵化在室温下30分钟。主要抗体claudin-4(猫。不。32 - 9400,1:100年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA), occludin(猫。不。33 - 1500,1:200年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA), ZO-1(猫。不。33 - 9100,1:100年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA), CD3(猫。 no. ab11089, 1 : 200, Abcam, Cambridge, USA), CD68 (cat. no. ab201340, 1 : 200, Abcam, Cambridge, USA), nephrin (at. no. ab216341, 1 : 200, Abcam, Cambridge, USA), or Ki-67 (cat. no. ab16667, 1 : 200, Abcam, Cambridge, USA) was added, and slides were incubated overnight at 4°C. After being washed in PBS, the slides were incubated with secondary antibody (Gene Tech, Shanghai, China; dilution 1 : 100) for 30 min at room temperature. Excess secondary antibody was washed off. Slides were incubated with streptavidin–avidin–biotin complex, developed with 3, 3 - - - - - -diaminobenzidine,用自来水冲洗,用苏木精复染色,与梯度酒精脱水,干燥,和安装中性香脂。结果被两个病理学家解释盲目。十大功率领域的视图(原始放大×400)被随机选择从每个幻灯片,用光学显微镜和图像得到,与200个细胞中观察到每个字段的视图。细胞的细胞质或细胞核染色黄色或深棕色被定义为阳性细胞。半定量的结果通过确定细胞染色强度图像分析软件ImageJ 1.51。量化的肾小球数量进行免疫组织化学染色的nephrin使用ImageJ 1.51软件(G.K. Rangan2007年,由于G.H.。量化的肾脏病理图像分析。肾脏学(Carlton) 12 (6): 553 - 558。10.1111 / j.1440-1797.2007.00855.x)。

2.4。免疫荧光染色

通过免疫荧光染色蛋白表达的评价修改根据一项研究[31日]。大鼠肾脏幻灯片脱蜡、水化放置在柠檬酸钠和微波抗原检索。幻灯片被屏蔽10%山羊血清为30分钟37°C和孵化主要抗体如下:N-cadherin(猫。不。pa5 - 19486, 1: 200年,沃尔瑟姆,MA)或热费希尔科学ZONAB (ZO-1-associated核酸结合蛋白)主要抗体(猫。不。40 - 2800,1:100年,沃尔瑟姆,MA)和热费希尔科学ZO-1主要抗体(猫。不。33 - 9100,1:100年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)在一起一夜之间在4°C。消极的控制,一些幻灯片没有孵化的主要抗体。 Tissue slides were washed four times with PBS-Triton. The second antibody against mouse was conjugated with Alexa fluor-488 (green fluorescence) and the anti-rabbit antibody with Alexa fluor-594 (red fluorescence) for 60 min at room temperature. Slides were washed three times with PBS, and the nuclei were stained with DAPI (1 : 2000; Sigma Chemical) for 2 min. After sufficient washes, images were captured by confocal laser scanning microscopy (MTC-600, BIO-RAD, USA).

2.5。西方墨点法

通过免疫印迹蛋白质的定量表达式修改根据一项研究[4]。简单地说,一个适当的体积里帕缓冲了肾脏组织样本产生细胞溶解产物。在12000转离心20分钟后,每个样品的蛋白浓度上层的决心与bicinchoninic酸蛋白质浓度测定工具包(Beyotime、上海、中国)。5×加载缓冲区用于稀释蛋白质样品,这是在水浴煮5分钟。蛋白质被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,随后转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,伯灵顿,MA)。孵化后claudin-4(猫。不。32 - 9400,1:1000年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA), occludin(猫。不。33 - 1500,1:1000年,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA), ZO-1(猫。 no. 33-9100, 1 : 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), IL-6 (cat. no. DF6087, 1 : 1000, Affinity, OH, USA), TNF-α(猫。不。AF7014 1: 1000年,亲和力,哦,美国)或STAT3(猫。不。AF6294 1: 1000年,亲和力,哦,美国)主要抗体和二级抗体(1:5000),电化学发光的解决方案(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)添加底物发光。所有乐队都与化学成像仪扫描5500 V2.03软件(AIPha InnCh,迈阿密,佛罗里达州美国),和集成密度值计算与计算机图像分析系统(陈萤石2.0)和归一化的表达β肌动蛋白。

2.6。统计分析

GraphPad棱镜7软件(美国GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于统计分析和绘制条形图。每次试验的结果得到三独立重复实验后,表示为 。单向方差分析(方差分析)和事后比较(Bonferroni测试)被用来确定多个组之间的显著差异。简单的回归是用于关联的相对表达被西方墨点法作为一个独立变量,与管状损伤分数或相对表达式被西方墨点法作为因变量。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。新生儿氧过多会使表达Claudin-4在近端小管

调查的表达claudin-4肾小球,近端小管,和收集管氧过多之后,我们从新生大鼠肾组织进行免疫组织化学染色。温和的膜染色观察claudin-4在肾小球和强劲的胞质染色观察在近端小管和集尿管(图1(一))。Claudin-4新生儿肾小球表达表现为双峰模式与峰(图之间的槽1 (b))。显著降低claudin-4表达观察氧过多组相比normoxia集团7日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , )。然而,在新生儿肾小球暴露于氧过多claudin-4表达调节产后1天(normoxia组 与氧过多组 , ;图1 (b))。Claudin-4表达式在新生儿近端小管达到峰值出生后第七天显然拒绝后第十天(图1 (c))。Claudin-4在近端小管表达显著下调后氧过多一日(normoxia组 与氧过多组 , ),3日(normoxia组 与氧过多组 , ),5日(normoxia组 与氧过多组 , ),和7日产后天(normoxia组 与氧过多组 , ),从而表明表达的峰值抵消claudin-4氧过多在近端小管(图1 (c))。Claudin-4表达新生儿收集管道表现出双波峰与波谷之间的峰值,而新生儿氧过多先进这些波峰和波谷的时间点(图1 (d))。显著降低claudin-4表达式被发现在氧过多组比normoxia组7日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , ;图1 (d))。然而,在新生儿claudin-4表达收集管道暴露于氧过多调节5日和10日产后几天(图1 (d))。因此,我们的研究结果表明,claudin-4的表达在近端小管表达下调新生儿氧过多。

3.2。Occludin表达式在近端小管由新生儿氧过多表达下调

调查occludin表达式新生儿氧过多,我们进行免疫组织化学染色occludin的从新生大鼠肾组织。适度强劲膜染色观察occludin的肾小球,和强大的胞质染色观察在近端小管和集尿管(图2(一个))。一个峰值occludin表达式在新生儿在出生后第七天,肾小球而occludin的表达高峰推迟直到产后第十天的新生儿氧过多(图2 (b))。Occludin在肾小球表达显著下调后氧过多7日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , )并显著调节氧过多后10日(normoxia组 与氧过多组 , )和14产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;图2 (b))。occludin的表达高峰在7日产后新生儿近端小管出现,显然是减毒后(图10产后的一天2 (c))。Occludin在近端小管表达显著下调氧过多后第三(normoxia组 与氧过多组 , ),5日(normoxia组 与氧过多组 , ),和7日产后天(normoxia组 与氧过多组 , ),显示91倍occludin的低表达在近端小管暴露于氧过多(图2 (c))。Occludin表达式在新生儿收集管道表现出双峰模式槽之间的峰值,而新生儿氧过多推迟Occludin的表达峰(图2或3天2 (d))。Occludin表达收集管道明显下调氧过多后第三(normoxia组 与氧过多组 , ),7日(normoxia组 与氧过多组 , ),和14产后天(normoxia组 与氧过多组 , )和显著调节氧过多后10日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , ;图2 (d))。因此,occludin的表达明显下调,新生儿氧过多在近端小管和occludin的表达高峰在肾小球和收集管道被新生儿氧过多推迟。

3.3。新生儿氧过多减弱表达ZO-1在近端小管的峰值

ZO-1的表达在肾小球,新生大鼠近端小管和集尿管是通过免疫组织化学染色法来衡量的。温和ZO-1在肾小球膜染色,并有强烈的ZO-1细胞质染色,观察在近端小管和收集管(图3(一个))。单峰值ZO-1表情出生后第七天在新生儿肾小球,而新生儿氧过多先进ZO-1表达式的高峰,(图5产后出现的一天3 (b))。ZO-1表达式在肾小球显著调节氧过多一日(normoxia组 与氧过多组 , )和第三产后天(normoxia组 与氧过多组 , )7号和显著下调后氧过多(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , ;图3 (b))。ZO-1表达式在新生儿近端小管达到顶峰出生后第七天和明显拒绝后第十天(图3 (c)),这是符合claudin-4和occludin的表达模式在近端小管。ZO-1在近端小管表达显著下调氧过多后第三(normoxia组 与氧过多组 , ),5日(normoxia组 与氧过多组 , ),和7日产后天(normoxia组 与氧过多组 , ),因此表明表达ZO-1峰值抵消氧过多在近端小管(图3 (c))。一个峰值ZO-1表达式在新生儿产后第十天收集管道,和峰值的表达ZO-1被新生儿氧过多先进(图5产后的一天3 (d))。ZO-1表达收集管道明显下调后7日(normoxia组氧过多 与氧过多组 , ),10日(normoxia组 与氧过多组 , ),和14产后天(normoxia组 与氧过多组 , )和显著调节氧过多一日(normoxia组 与氧过多组 , )和第五(normoxia组产后天 与氧过多组 , ;图3 (d))。因此,表达式的峰值ZO-1在近端小管,削弱了新生儿氧过多,和表达高峰ZO-1肾小球和收集管道被新生儿氧过多先进。相似度很高的变化表达claudin-4, occludin, ZO-1观察新生大鼠近端小管的暴露于氧过多。弱coexpression ZO-1和N-cadherin(近端小管标记)免疫荧光观察到costaining在肾小球细胞膜P5D normoxia和氧过多组,和细胞质coexpression ZO-1 N-cadherin在观察近端小管P5D normoxia和氧过多组(补充图2(一个))。本地化的细胞膜ZO-1表达式在近端小管是由氧过多暴露在减毒P14D(补充图2(一个))。弱coexpression ZO-1和ZONAB (ZO-1-associated核酸结合蛋白)肾小球中可观察到细胞膜上P5D normoxia和氧过多组,和细胞质coexpression ZO-1 ZONAB在观察近端小管P5D normoxia和氧过多组(补充图2 (b))。强烈的表达ZONAB肾小球中可观察到细胞膜上P14D normoxia和氧过多组(补充图2 (b))。Nephrin(足细胞标记)在肾小球表达显著下调后氧过多14日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , )。的细胞质表达ki - 67(细胞增殖标记)在近端小管明显下调后氧过多14日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , )。

3.4。紧密连接蛋白的表达呈正相关的炎性细胞因子在大鼠肾脏

评估炎性细胞因子生产氧过多和量化后的总表达紧密连接蛋白在大鼠肾脏接触新生儿氧过多,我们检查claudin-4的表达,occludin ZO-1, il - 6和TNF -α在新生大鼠的肾脏免疫印迹(图4(一))。Claudin-4表达式在出生后第五天,达到顶峰,这一效应,削弱了氧过多(数字4(一)和4 (b))。总claudin-4表达显著下调后氧过多5日(normoxia组 与氧过多组 , )和7日产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;数据4(一)和4 (b))。总occludin表达显著下调后氧过多一日(normoxia组 与氧过多组 , )和第五(normoxia组产后天 与氧过多组 , ;数据4(一)和4 (c))。总ZO-1表达式在新生儿肾脏没有明显改变氧过多除了第三(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , ;数据4(一)和4 (d))。炎性细胞因子的表达后氧过多呈现双相模式,从而表明他们调节之前出生后第三天表达下调后第五天。il - 6的表达显著调节氧过多后第三(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , )并显著下调后氧过多5日(normoxia组 与氧过多组 , ),7日(normoxia组 与氧过多组 , ),和14产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;数据4(一)和4 (e))。肿瘤坏死因子-α表达显著调节氧过多后一日(normoxia组 与氧过多组 , )和第三产后天(normoxia组 与氧过多组 , )和显著下调后氧过多5日(normoxia组 与氧过多组 , )和7日产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;数据4(一)和4 (f))。因此,前炎症细胞因子的生产增加出生后第三天和减少后第五天。

进一步调查之间的关系紧密连接蛋白的表达和炎性细胞因子,我们使用相对简单的回归表达式的值执行紧密连接蛋白和炎症细胞因子,被西方墨点法。紧密连接蛋白,积极ZO-1之间的相关性被发现和claudin-4 ( , ),occludin和ZO-1 ( , ),分别和occludin claudin-4 ( , ;图4 (g))。il - 6和claudin-4之间有正相关性( , ),和occludin ( , )和ZO-1表达式( , ;图4 (h))。TNF的表达之间的正相关性被发现α和claudin-4 ( , ),和occludin ( , )和ZO-1 ( , ;图4(我))。因此,这些结果显示之间的正相关性紧密连接蛋白和炎性细胞因子的表达。尽管il - 6和TNF的表达α在这两种normoxia或氧过多组,T细胞(CD3阳性)或巨噬细胞(CD68阳性)没有在肾小球或近端小管测量免疫组织化学染色(补充数据4(一)和4 (b))。STAT3(信号传感器和转录激活3)新生大鼠肾脏的表达,在响应的差别,对这些炎症因子,显著下调后氧过多一日(normoxia组 与氧过多组 , ),3日(normoxia组 与氧过多组 , ),5日(normoxia组 与氧过多组 , ),和14产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;补充图4 (c))。

3.5。新生儿氧过多会使Claudin-4 Occludin的收集管道以及ZO-1成年老鼠的近端小管

调查的长期影响新生儿氧过多紧密连接蛋白的表达在大鼠肾脏,我们决定claudin-4的表达,occludin, ZO-1在成年大鼠的肾脏在30和60产后天免疫组织化学染色。claudin-4,轻微的膜或胞质染色观察肾小球和近端小管,而强大的胞质染色观察收集管(图5(一个))。occludin,轻微的胞质染色观察肾小球,温和的胞质染色观察在近端小管,和强大的胞质染色观察从成年老鼠收集管(图5(一个))。ZO-1,轻度细胞质染色在肾小球和中度细胞质染色在近端小管和收集管道是成熟的肾脏(图中发现的5(一个))。Claudin-4表达式在成年大鼠明显下调的收集管道在30 (normoxia组新生儿氧过多 与氧过多组 , )和60产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;图5 (b))。Occludin表达式在成年大鼠明显下调的收集管道在30 (normoxia组新生儿氧过多 与氧过多组 , )和60产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;图5 (c))。ZO-1在成年大鼠肾小球表达明显下调,新生儿氧过多30日(normoxia组产后的一天 与氧过多组 , ),而在近端小管的成年大鼠显著下调了新生儿在出生后60天(normoxia组氧过多 与氧过多组 , ;图5 (d))。因此,新生儿氧过多表达下调claudin-4 occludin的收集管道以及ZO-1近端小管的成年老鼠,因此显示新生儿氧过多长期抑制作用对紧密连接蛋白在大鼠肾脏。

3.6。近端小管的损伤分数负相关与Claudin-4表达式在成熟的肾脏

验证的结果在成年大鼠的肾脏免疫组织化学染色,我们决定claudin-4的表达,occludin, ZO-1成年老鼠的肾脏免疫印迹(图6(一))。在出生后30天,occludin (normoxia组 与氧过多组 , )和ZO-1表达式(normoxia组 与氧过多组 , )大幅下调了新生儿氧过多(图6(一))。出生后60天,claudin-4 (normoxia组 与氧过多组 , )和ZO-1 (normoxia组 与氧过多组 , )大幅下调了新生儿氧过多(图6(一))。因此,紧密连接蛋白的表达在大鼠肾脏被新生儿抑制氧过多从长远来看,从免疫组织化学染色结果与观测一致。

调查hyperoxia-induced损伤肾脏的发展的影响,我们用)染色进行组织学检查,使用成熟的肾脏样本(30和60产后天)normoxia和氧过多组(图6 (b))。增加液泡,我们上皮不规则边界,在近端小管腔扩张观察成年大鼠氧过多组(图6 (b))。成年大鼠的肾小球直径的差异normoxia和氧过多组不显著(图6 (c)、表1),从而表明新生儿氧过多不损害肾小球的发展。新生儿氧过多显著降低成年大鼠的肾小球数量在30日(normoxia组 /毫米²与氧过多组 /毫米², )和60产后天(normoxia组 /毫米²与氧过多组 /毫米², ;图6 (c)、表1)。新生儿氧过多显著增加的近端小管损伤分数成年鼠30日(normoxia组 与氧过多组 , )和60产后天(normoxia组 与氧过多组 , ;图6 (c)、表1)。因为严重的损伤肾小管上皮细胞可能导致增加铸形成收集管道,我们决定在收集计数管的成年老鼠用他走时染色的部分。把数的差异在收集管道之间的成年老鼠normoxia和氧过多组不显著(图6 (c)、表1)。我们的研究结果表明,新生儿氧过多近端肾小管受损长期发展。

进一步调查之间的关系紧密连接蛋白的表达和近端肾小管损伤,我们使用相对简单的回归表达式的值执行紧密连接蛋白检测到免疫印迹和近端小管的损伤评分在30和60在成年大鼠产后天。之间的负相关发现claudin-4表达式和近端小管的损伤评分( , ;图6 (d)),而无显著相关性occludin或ZO-1表达式和近端小管损伤评分观察( ;图6 (d))。claudin-4相关性不显著,occludin或ZO-1表达和观察肾小球数量( ;图6 (d))。因此,近端小管的损伤分数负相关与claudin-4表达式在成熟的成年老鼠的肾脏。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,新生儿氧过多导致受伤不成熟的肾脏(4,16,32]。因为紧密连接在nephrogenesis和维持肾脏功能中扮演着关键角色(33,34]和hyperoxia-induced发育障碍是由分解的紧密连接31日,35,36),确定新生儿氧过多如何影响紧密连接在发展中肾脏是感兴趣的。,据我们所知,本研究首次显示关键claudin-4紧密连接蛋白的表达,occludin, ZO-1在近端小管明显下调后新生儿氧过多。这些紧密连接蛋白的表达呈正相关,il - 6和TNF -α。此外,我们的研究表明,新生儿氧过多降低肾小球数量和近端小管细胞的增殖,近端肾小管损伤的程度负相关的表达式claudin-4成年老鼠的肾脏。

Claudin-4是一个关键的组件在调节paracellular氯化物渗透性的收集管37,38]。Claudin-4也积累claudin-1 claudin-3紧密连接增强信息联系在肾小管上皮细胞(39]。我们发现claudin-4表达改变肾小球新生儿氧过多;然而,新生儿氧过多并不影响claudin-4表达式在成年大鼠肾小球。我们的研究提供了第一个证明新生儿氧过多会使近端管claudin-4表达式,这是负相关的损伤分数近端小管的成年老鼠,因此表明新生儿氧过多可能会损害近端管claudin-4的差别通过对这些发展。重要的是,我们观察到新生儿氧过多表达下调claudin-4成年老鼠的收集管道。由于claudin-4是一个关键组成部分参与收集管道(氯重吸收38),我们假设新生儿氯化氧过多可能会损害在收集管再吸收。

Occludin是肾小球血管内皮细胞标记和扮演着一个重要的角色在肾小球内皮细胞的研究进展,这是由TNF -α(8,40]。在最近的研究中,新生儿氧过多假设在肾小球occludin的表达高峰,和occludin的表达呈正相关,肿瘤坏死因子-α,从而表明新生儿氧过多可能会妨碍发展中肾小球的滤过功能TNF -α端依赖的方式。Occludin是一个重要的组件在维护paracellular近端小管和集合管的渗透性41,42]。我们发现新生儿氧过多明显下调occludin的表达在成年大鼠近端小管和收集管,表明新生儿氧过多是一个长期的风险因素的paracellular渗透率近端小管和集合管。

ZO-1紧密连接的标志,是一个交叉连接和支架蛋白锚紧密连接链蛋白肌动蛋白细胞骨架(43]。我们观察到的近端小管胞质表达ZO-1新生儿老鼠,和ZO-1膜定位的表达式被新生儿氧过多减毒,表明新生儿氧过多可能会损害紧密连接蛋白的膜锚定膜ZO-1的差别,对这些基因的近端小管。ZO-1和ZONAB交互至关重要组成部分紧密junction-associated信号转导通路调控过渡的近端小管细胞增殖分化表型,和细胞质表达ZONAB对细胞生存很重要的44,45]。膜coexpression ZO-1 ZONAB在肾小球和细胞质coexpression的近端小管normoxia和氧过多组织观察在这项研究中,表明ZO-1 ZONAB可能主要涉及在管状增殖和细胞存活和新生大鼠肾小球的分化。我们目前的研究表明,新生儿氧过多表达下调ZO-1表达式在新生儿和成人近端小管,这可能会损害在nephrogenesis近端小管细胞的增殖。Podocyte-specific ZO-1基因的缺失损害缝隔膜形成,从而导致发展中肾小球过滤异常(19]。我们观察到,在肾小球表达高峰ZO-1先进,和nephrin(足细胞的标记)表达式被新生儿氧过多表达下调,这可能妨碍发展中肾小球的过滤。在最近的研究中,表达高峰ZO-1的收集管道被新生儿氧过多先进。因为抑制ZO-1导致增加的主要细胞G0 / G1保留收集管道(46],hyperoxia-induced变更ZO-1表达新生大鼠的收集管道可能会干扰细胞分裂发展中收集管。我们观察到claudin-4之间的正相关性,occludin ZO-1表达新生儿肾脏,因此建议协调这些紧密连接蛋白的表达在nephrogenesis是必需的。

我们发现,il - 6和TNF -α新生儿氧过多后大鼠肾脏中表达下调,表明il - 6和TNF -α的调控机制可能参与nephrogenesis受损。il - 6和TNF -α是多效性的细胞因子,参与各种形式的肾脏疾病(47,48]。肿瘤坏死因子-α通过STAT3信号调节il - 6表达,促进干细胞自我更新和分化成管状细胞(49,50]。il - 6也触发mesenchymal-epithelial过渡,这是肾发育的关键(51,52]。我们发现氧过多暴露显著下调STAT3表达il - 6和TNF -差别伴随着对这些α新生大鼠的肾脏,表明il - 6和TNF -差别协同对这些α通过氧过多暴露可能由STAT3信号。

il - 6和TNF -α通过MAPK增强肾脏的细胞结(增殖蛋白激酶)信号(53,54]。我们的研究观察TNF -差别一个对这些α在新生儿氧过多和TNF -之间的正相关关系αoccludin, claudin-4和ZO-1鼠肾脏,紧密连接蛋白的差别表明hyperoxia-induced对这些基因的差别可能是由对这些il - 6和TNF -α在nephrogenesis。上面的观察是一致的一项研究的结果,表明新生儿氧过多表达下调MAPK信号,这是至关重要的nephrogenesis通过调节细胞周期阻滞,祖维护,和分化4,55,56]。我们发现少足细胞,肾小球数量减少,减毒扩散)差别(ki - 67对这些基因的近端小管细胞,和近端小管损伤分数的增加伴随着il - 6和TNF -差别的对这些α新生儿氧过多后,指示一个受损的肾脏发展新生儿氧过多暴露可能是介导的il - 6和TNF -α。有趣的是,CD3和CD68老鼠肾脏的表达il - 6和TNF的差别,对这些的反应α新生儿后氧过多是评估在这项研究中,巨噬细胞和T细胞(CD3阳性)或(CD68阳性)没有在肾小球或近端小管被观察到。上面的观察表明,il - 6和TNF -α参与了受损nephrogenesis新生儿氧过多独立的促炎的效果。

5。结论

我们目前的研究首次显示,新生儿氧过多广泛抑制紧密连接蛋白的表达在新生儿近端小管的发展,炎性细胞因子可能功能协调。从长远来看,新生儿氧过多肾小球数量减少和增加损伤分数成熟肾脏近端小管的,这可能是一个影响的差别由对这些claudin-4。这些发现表明,紧密连接蛋白的表达在肾脏受损可能是一个潜在的机制hyperoxia-induced肾原性的疾病。它提供了新的见解,进一步研究肾脏氧化损伤和发展障碍,并将有助于在未来寻求hyperoxia-induced潜在治疗肾损伤。

缩写

ZO-1:	Zonula occludens-1
伊尔- 61:	白介素- 6
肿瘤坏死因子-α1:	肿瘤坏死因子α
FiO21:	氧气的空气
PFA1:	多聚甲醛
MAPK1:	增殖蛋白激酶
STAT31:	信号传感器和转录激活3
ZONAB1:	ZO-1-associated核酸结合蛋白。

数据可用性

数据集在当前研究可从相应的作者。

伦理批准

所有动物的程序下进行盛京医院的伦理委员会批准,中国医科大学(ps362k项目识别代码:2016)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Xuewen徐进行了实验和写的手稿。Xinyue张进行实验和分析数据。灵灵高提供了技术支持和分析数据。春风Liu Kai你监督学习和编辑了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者要感谢莎拉博士湿草地评论这个手稿。这项研究得到了国家自然科学基金(81971810)春风刘博士从国家自然科学基金青年基金(81501292)凯博士,和中国博士后科学基金会(2017号m611285)凯博士。

补充材料

补充图1:研究设计和动物组织的流程图。刚出生的老鼠暴露在normoxia或氧过多,安乐死在产后1天(P1D),第三天(P3D)、5日(P5D)产后一天,7日(P7D)产后一天,10日产后一天(P10D)、14日(P14D)产后一天,出生后30天(P30D), 60产后天(P60D)。肾脏是收获后立即分析安乐死的组织学检查,免疫组织化学染色(包含IHC),免疫荧光染色和免疫印迹。体重(BW)被记录 g。补充图2:氧过多接触减毒膜定位ZO-1在近端小管。(a)的分布N-cadherin和ZO-1表达在新生大鼠的肾小球和近端小管,暴露在normoxia或氧过多从出生到出生后第5天(P5D)和14天(P14D),测量,分别通过免疫荧光costaining(原始放大×800。规模的酒吧,40μm。箭头ZO-1膜定位的)。(b)的分布ZO-1-associated核酸结合蛋白(ZONAB)和ZO-1表达新生大鼠的肾小球和近端小管,暴露在normoxia或氧过多从出生到出生后第5天(P5D)和14天(P14D),测量,分别由immunofluorescent染色(原始放大×800。规模的酒吧,40μ膜定位的ZONAB m。箭头)。补充图3:新生儿氧过多会使表达nephrin在肾小球和ki - 67在近端小管。Nephrin (a)和ki - 67 (b)新生大鼠的肾小球和近端小管表达,暴露在normoxia或氧过多从出生到出生后第5天(P5D)和14天(P14D),测量,分别通过免疫组织化学染色(原始放大×400。规模的酒吧,20μ米)。这个盒子,须情节代表的免疫染色强度表达式在肾小球和近端小管。相对表达式是标准化P5D normoxia小组的价值。胡须代表最小或最大强度,和盒子的四分位范围跨度测量平均值的十大鼠3复制( )。 ,单向方差分析,Bonferroni事后测试。补充图4有一个缺乏CD3和CD68阳性细胞在肾小球和近端小管的normoxia或氧过多组。CD3 (a)和CD68 (b)新生大鼠的肾小球和近端小管表达,暴露在normoxia或氧过多从出生到出生后第5天(P5D)和14天(P14D),测量,分别通过免疫组织化学染色(原始放大×400。规模的酒吧,20μ米)。这个盒子,须情节代表的免疫染色强度表达式在肾小球和近端小管。相对表达式是标准化P5D normoxia小组的价值。胡须代表最小或最大强度,和盒子的四分位范围跨度测量平均值的十大鼠3复制( )。 ,单向方差分析,Bonferroni事后测试。(c) STAT3的表达乐队刚出生的老鼠暴露在normoxia或氧过多的肾脏从出生到产后1天(P1D),第三天(P3D),第5天产后(P5D), 7日产后天(P7D), 14日产后一天(P14D)被免疫印迹检测。相对调整参考基因表达β肌动蛋白的值然后标准化normoxia小组P1D框所示,晶须的情节。胡须代表最小或最大灰度值,和盒子的四分位范围跨度测量平均值的十大鼠3复制( )。 ,单向方差分析,Bonferroni事后测试。(补充材料)

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版权

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