文摘
线粒体功能障碍的发病机制中起着重要作用不仅许多氧化应激或与年龄相关的疾病,如神经退行性以及精神疾病也在正常老化。有证据表明,氧化应激和线粒体功能障碍是最上游和常见的神经退化pathomechanisms事件。独眼畸形南非地方特有的植物物种和一些有着悠久的传统使用草药茶,被称为honeybush茶。提取的茶获得更科学的关注是由于他们的酚类成分。在目前的研究中,我们不仅进行测试在体外mitochondria-enhancing honeybush提取物在生理条件下的属性也是氧化应激的情况下改善性能。热水和ethanolic提取的c . subternata,c . genistoides,c .叶被调查。人类神经母细胞瘤与honeybush SH-SY5Y细胞提取物预处理,在0.1 - 1的浓度范围ng / ml,有益的影响生物能学ATP生产增加,呼吸,线粒体膜电位(MMP)在生理条件下24小时后。的水提取物c . subternata和c . genistoides,特别是显示保护作用通过拯救生物能量学和线粒体氧化应激条件下(400赤字μM H2O23小时)。这些发现表明honeybush提取物可以成为候选人的预防氧化应激影响衰老过程和与年龄相关的神经退行性疾病的发展可能导致condition-specific营养食品。
1。介绍
活性氧(ROS)是含氧的化学实体的反应已成为人们关注的焦点,在许多疾病的一个共同特征。它们参与神经退行性和心血管疾病、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病,以及在正常老化(1- - - - - -4]。ROS主要包括超氧化物阴离子自由基(O2⋅-)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(OH- - - - - -)的超氧化物阴离子和过氧化氢在最丰富的细胞(5]。线粒体是细胞器负责大部分的三磷酸腺苷(ATP)生产通过氧化磷酸化(OXPHOS)在他们的电子传递链(等)。神经元是高能要求细胞,因此高度依赖于线粒体为了生存和功能。然而,线粒体ROS的中心也生产和代谢2,6]。尽管估计31现有ROS(主要是超氧化物阴离子和H2O2)生产基地在整个计算单元对12线粒体ROS发射地点,大部分细胞内源性活性氧是由线粒体的副产品OXPHOS [5,7]。
暴露在氧气不仅不可避免,而且是重要的和必要的生物体和细胞生存和能源生产(5]。线粒体ROS主要是生成的复合物我三世的等当泄漏NADH或FADH提供的电子2与氧气反应。有趣的是,这两个高产网站发布O2⋅-和H2O2直接进入膜间隙是酶sn-glycerol-3-phosphate脱氢酶和复杂的第三等5]。因此,ROS的膜间隙的存在可能会导致膜的去极化和通过复合物I-IV阻碍自由运动的电子,从而直接影响质子梯度和线粒体膜电位(MMP)和最终防止生产ATP (8]。
线粒体是主要的超氧化物阴离子和过氧化氢生产商,他们很大程度上影响氧化还原内稳态9]。细胞保护,配有抗氧化防御系统(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽氧化酵素,硫氧还蛋白、过氧化氢酶、谷胱甘肽,谷胱甘肽)为了抵御活性氧(10- - - - - -12]。细胞的氧化还原状态是动态的,取决于生产活性氧和抗氧化防御系统的功能。在正常nonelevated浓度,ROS作为信号分子,参与调节衰老,细胞死亡和扩散。当有生产过剩的活性氧,抗氧化防御系统不堪重负,他们不能扩散。因此,氧化应激是ROS的overaccumulation(主要是超氧化物阴离子和H2O2)由于其生产过剩或负担过重的抗氧化防御系统(1,5]。活性氧反应和破坏许多细胞和线粒体生物分子。值得注意的是,它们会引起脂质过氧化反应和膜破坏,蛋白质错误折叠,以及DNA损伤(3]。线粒体DNA (mtDNA)位于矩阵的线粒体和编码13蛋白质的结构组件等。mtDNA在非常靠近ROS生产基地,因此直接影响和突变,导致组件故障等导致回OXPHOS受损和更多的活性氧的生产(10,13]。当ROS水平超过某个阈值,然后他们成为mitochondria-damaging和致病因素14]。老化的特征是活性氧的增加和减少抗氧化防御线粒体损伤,最终导致细胞功能障碍,衰老和细胞凋亡。正常衰老和神经退行性疾病有这些共同的特征虽然在不同程度上。在神经退化,破坏性影响更为深远的(3,5,9,15]。
过氧化氢,这是内生线粒体中产生时,被认为是最多的活性氧对细胞的命运的影响。它可以很容易地通过膜扩散和最大寿命9]。因此,使用过氧化氢作为氧化应激在这项研究中。
独眼畸形物种,属于豆科的家庭,也是南非的通病。旧记录描述传统的几个物种包括使用c . subternata,c . genistoides,c .叶草药茶(16]。目前,这些独眼畸形物种形成的主要栽培植物材料补充植物收获在野外和满足国际市场的需求不断增长的关键。主要产品是“发酵”(氧化)honeybush茶,而绿色的花草茶(unoxidised)是首选的营养提取生产由于较高的酚含量和抗氧化能力。的酚醛honeybush不同定性和定量依据独眼畸形物种。主要酚类成分属于氧杂蒽酮、苯甲酮、黄烷酮、黄酮、dihydrochalcone子类(17]。增加消费和流行honeybush出现的越来越多的研究兴趣为了揭示新的生物活性和检查其潜力作为营养食品和功能食品16,18]。如约而至由于酚类成分,honeybush提取物已被证明具有抗氧化活动的重视和兴趣在氧化应激相关疾病的研究19- - - - - -22]。考虑一方面抗氧化能力的证据,另一方面需要鼓励了线粒体靶向抗氧化物质用于氧化损伤的预防或改善氧化应激水平增加,我们假设honeybush可能拥有一些有益mitochondria-enhancing属性。出于这个原因,本研究旨在考察honeybush提取物对H的保护作用2O2全身SH-SY5Y神经细胞氧化应激和线粒体。据我们所知,这是第一个研究评估honeybush提取物对线粒体功能的影响在神经细胞模型。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)磷酸盐(PBS)、胎牛血清(FCS),汉克斯平衡盐溶液(hbs)、青霉素、链霉素,丙酮酸,dihydrorhodamine 123 (DHR), 2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (DCF), dihydroethidium(她)tetramethylrhodamine甲酯(TMRM),明胶,H2O2来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。MitoSOX和GlutaMAX来自Gibco英杰公司(美国沃尔瑟姆,MA),从PerkinElmer ATPlite1step工具(沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),和XF细胞Mitostress装备从海马生物科学(美国北Billerica的)。Folin-Ciocalteau试剂购买从默克公司(达姆施塔特,德国)。真实的参考标准(纯度> 95%)得到了酚类化合物的识别和量化Sigma-Aldrich(橘皮苷),Extrasynthese (Genay、法国;芒果苷,eriocitrin),基抹(Regenstauf、德国;isomangiferin)和Phytolab (Vestenbergsreuth、德国;vicenin-2, 3 -β-D-glucopyranosyliriflophenone)。化合物的植物Bioactives组库包括3 -β-D-glucopyranosyl-4 -O- - - - - -β-D-glucopyranosyliriflophenone, 3 -β-D-glucopyranosylmaclurin和5 - (2 s)O- - - - - - (α-L-rhamnopyranosyl - (1→2)β-D-glucopyranosyl柚苷配基隔绝c . genistoides,scolymoside和3 ,5 - - - - - -di -β-D-glucopyranosylphloretin隔绝c . subternata。高效液相色谱梯度年级“紫外线”乙腈是由默克公司提供。
2.2。植物材料和提取准备
收获的天线部分(芽和叶)发生在2017年3月。独眼畸形subternata是收获Elsenburg研究农产品(-34.30267,19.13809),c .叶和c . genistoides收获在Nietvoorbij研究农产品(-33.90619,18.87031),都位于南非的西开普省。新鲜的植物材料机械切成小块(< 3毫米)和干40°C错流,温控干燥箱为绿色honeybush含水率< 7%,茶叶生产。干植物材料使用旋转粗磨机配备了1毫米筛(Retsch, GmbH,汗,德国)。
热水提取物是从每一批准备研磨植物原料的提取植物70克和700毫升去离子水在93°C的30分钟紧随其后的是过滤和冷冻干燥的滤液如前所述23]。同样,EtOH-water 40% (v / v)提取物是由植物提取磨30分钟的70°C。乙醇被真空使用旋转蒸发,剩下的水层冻干。EtOH-water之前提取使用70% (v / v)植物材料与二氯甲烷进行详尽的索氏提取,去除叶绿素。脱脂植物脱水,进一步视为EtOH-water 40% (v / v)提取物。冻干提取物(> 15 g /提取)编码,整除为玻璃小瓶(用于测试和保留样本),在黑暗中密封,储存在干燥。
2.3。量化和酚类化合物的识别
主要酚类化合物的提取是量化使用各自的特有HPLC-DAD方法进行验证c . subternata(23),c .叶(24),而c . genistoides(25]。样品溶解在水中使用0.45或10% DMSO和过滤μ米孔隙大小PVDF注射器过滤器(默克公司)c . subternata,0.22μ被用于m孔隙大小过滤器c . genistoides和c .叶。添加抗坏血酸是为了防止在分析复合降解(最终浓度ca 9毫克/毫升)。在适当的波长峰值区域与外部校准曲线用于量化(苯甲酮、黄烷酮类和dihydrochalcones 288海里;氧杂蒽酮和黄酮320海里)。在这种情况下,真实的参考标准并不可用,量化的等价物类似的化合物。
使用Folin-Ciocalteau提取物的总多酚含量测定试验用于微型板块的亚瑟et al。26]。值表示为g没食子酸当量/ 100 g提取。
提取初始测试后选择深造也分析了质使用水域Acquity超高效液相色谱仪器(UPLC)耦合到一个Synapt G2四极飞行时间探测器女士(Q-TOF)配备一个电喷雾电离(ESI)来源(美国水域,米尔福德)。执行质量校准使用甲酸钠溶液,和亮氨酸脑啡肽作为lockspray解决方案。分析第一次在女士中执行E负离子化方式:扫描范围150 - 1500点;毛管电压,-2.5 kV;采样锥电压15.0 V;源温度、120°C;反溶剂温度、275°C;锥气体流(N2),650 l / h;反溶剂气体流(N2),50 l / h。MS / MS实验,30.0 V的碰撞能量使用。峰是比较紫外吸收光谱等手段进行了识别,相对保留时间,女士特点(分子式准确预测的质量),和MS / MS碎片光谱或文献数据与真实的标准。
2.4。细胞培养
人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系被选为我们的细胞模型在这项研究中,因为它是一个完善的和广泛使用的神经元模型在生化研究。细胞系表现为人工神经网络在培养皿中,主要用于研究神经受体表达。SH-SY5Y细胞保持和发展在37°C湿润孵化室的氛围下7.5%的股份有限公司2在DMEM补充10% (v / v) heat-inactivated FCS, 2毫米GlutaMAX, 1% (v / v)青霉素和链霉素。细胞通过每周1 - 2次,细胞用于实验没有超过20。这些细胞被镀时达到了80 - 90%的融合。
2.5。细胞治疗
评价ATP生产进行SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞,以确定潜在的有毒九honeybush提取物的浓度范围。两个进行了检查。最初,水,ethanolic ethanolic 70%和40%提取的物种c . subternata,c . genistoides,c .叶筛选在一个非常广泛的浓度范围0.1 ng / ml到1毫克/毫升(数据没有显示)。值得注意的是,所有干提取物溶解在DMSO对我们实验(最终DMSO浓度< 0.005%,没有影响车辆的解决方案仅比未经处理的条件)。第一个筛选表明,神经母细胞瘤细胞的提取没有毒性的浓度10μ克/毫升。根据第一次筛选的结果,浓度范围减少到0.1 ng / ml的1μg / ml和提取的数量减少了从9到四个(根据提取的容量增加ATP水平的细胞)和第二个筛选周期。筛选是由使用一个ATP检测试验(ATPlite 1步骤工具包是来自PerkinElmer)。实验,细胞被镀和治疗后1天镀24 h与DMEM(未经处理的cells-control条件)或0.1 ng / ml的最终浓度为1μ提取的g / ml。
因为车辆治疗没有任何影响在我们的分析中,我们评估honeybush提取物浓度的影响相比,未经处理的控制在以下的实验条件。证实了细胞的敏感性SH-SY5Y细胞使用积极的控制雌二醇如前所述在格林et al . 2014 (27]。
过氧化氢(H2O2),属于线粒体产生的活性氧被用作压力在400集中μM能够减少线粒体和细胞功能。H2O2浓度选择基于筛选SH-SY5Y细胞进行了实验。压力实验,细胞首先进行预处理的24小时honeybush提取然后治疗3 h和400μM H2O2。每个进行了试验和重复至少一式三份。
2.6。ATP水平
总ATP含量测定用生物发光分析(ATPlite 1步)根据制造商的指示,如前所述28- - - - - -30.]。细胞被镀在6复制成白色96孔细胞培养板的密度 细胞/。ATP提取从细胞裂解转化为光。方法措施形成的光从ATP和荧光素酶荧光素酶的催化。反射光是线性相关的ATP浓度和测量使用多模板读者Cytation 3 (BioTek仪器,Winooski,佛蒙特州,美国)。
2.7。测定线粒体膜电位(MMP)
使用荧光染料TMRM MMP的测量,因为其跨膜分布取决于MMP。如前所述(31日,32),这些细胞被镀在6复制成黑色96孔细胞培养板的密度1×104细胞/好,孵化与染料浓度为0.4μ米20分钟。与哈佛商学院三次洗涤后,荧光测量在548 nm(激发)/ 574海里(排放),使用Cytation 3多模板读者(BioTek仪器)。
2.8。线粒体呼吸
线粒体的呼吸作用和细胞糖酵解测量使用之前描述的海马生物XF24分析仪(28,29日,33]。简单地说,XF24细胞培养微型板块被涂上一层镀0.1%明胶和细胞密度为2.5×104细胞,在治疗中(100μ包含1 g / l l)葡萄糖、丙酮酸4毫米,10% FCS。honeybush提取物治疗24 h后,PBS然后500细胞被洗一次μl分析介质(DMEM包含1 g / l的葡萄糖和丙酮酸的4毫米)被添加到每个。耗氧速率(OCR)和细胞外的酸化速率(ECAR)同时测定基底下呼吸。从海马XF24软件,提取的数据和生物能量学参数(基底呼吸、ATP生产,最大呼吸,多余的呼吸能力,和糖酵解储备)计算根据制造商的指导方针。
2.9。ROS水平测定
线粒体和胞质ROS水平和线粒体的具体水平O2⋅-超氧化物阴离子自由基和O的总水平2⋅-超氧化物阴离子自由基水平评估使用荧光染料dihydrorhodamine 123 (DHR), 2 ,7 - - - - - -dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCF),红色的线粒体超氧化物指标(MitoSOX)和dihydroethidium(她),分别描述之前(30.,34]。SH-SY5Y细胞被镀在6复制成黑色96孔细胞培养板的密度1×104细胞/。治疗后与honeybush提取单独或与honeybush提取物预处理后,紧随其后的是治疗H2O2,细胞治疗10所示μM的染料:DCF, DHR,她20分钟或5μ的MitoSOX 90分钟在室温下在黑暗中轨道振动器。与哈佛商学院洗细胞三次后,形成绿色荧光产品引发的DCF和DHR,分别检测在485 nm(激发)/ 535海里(排放)。MitoSOX触发形成的红色荧光产品检测到531海里(激发)/ 595海里(排放)。她,是细胞渗透,作为总O2⋅-超氧化物阴离子探测器,因为它是不透水的红色荧光产品ethidium氧化,发现在531 nm(激发)/ 595海里(排放)。荧光的强度是成正比的线粒体ROS,胞质ROS, O2⋅-(总和线粒体)的水平。使用Cytation 3的荧光测量多模板读者。
2.10。统计分析
数据给出均值±SEM。统计分析使用GraphPad棱镜软件(版本5.02对于Windows,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。两组以上的统计比较,采用单向方差分析,其次是Dunnett多重比较的测试与控制生理条件和与H2O2对于压力条件。< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
进行了两个周期的放映关于每个提取的能力提高的ATP生产SH-SY5Y细胞。九个独眼畸形提取提取产生的c . subternata,c . genistoides,c .叶用热水和两个包裹混合筛选(数据未显示),和四个最有前途的提取物的增加ATP生产选择所有后续实验:水提取的所有三个独眼畸形物种和ethanolic提取70%c . genistoides。表1给的内容主要酚类化合物存在于所选的提取。定性和定量酚醛概要文件的差异是明显的,特别是没有或只有微量的dihydrochalcones的存在c .叶和c . genistoides但大量的氧杂蒽酮水平相比c . subternata。芒果苷isomangiferin主要化合物在紧随其后c .叶和c . genistoides提取物。Scolymoside,黄酮rutinoside,紧随其后的是3 -β-D-glucopyranosyl-4 -O- - - - - -β-D-glucopyranosyliriflophenone、苯甲酮是主要的酚类化合物c . subternata水提取物。Scolymoside中没有检测到两个c . genistoides提取,但这些提取黄酮的水平更高di-glucoside, vicenin-2相比c . subternata和c .叶提取物。总的来说,总酚含量,根据个人的酚类化合物含量的总和,EtOH-water最高的70%提取c . genistoides和水提取物的最低c . subternata。总多酚含量决定使用Folin-Ciocalteau化验EtOH-water最高的70%提取c . genistoides和水提取物的最低c .叶水提取物具有相似的价值观c . subternata和c . genistoides(表1)。
3.1。Honeybush提取增加ATP产量在生理条件下,在H2O2全身的压力
ATP是主要的最终产品不仅糖酵解的氧化磷酸化也因此线粒体和细胞生存能力的指标和正常运转。因此,我们评估的影响honeybush提取神经母细胞瘤细胞ATP生产的。0.1 -1000 ng / ml的浓度范围为每个提取的第一次测试是在生理条件下。结果表明,低浓度(0.1 1 ng / ml),而不是更高的(50 ng / ml - 100毫克/毫升,数据未显示),水提取的三个独眼畸形的物种和70%的ethanolic提取的c . genistoides显著增加ATP生产4%治疗后24 h在生理条件下(数字1(一)- - - - - -1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
关于ATP水平氧化应激下,H2O2在400μ导致ATP产量减少了39.1%。根据实验设计在生理条件下,我们测试了相同的广泛的浓度范围为每个提取下氧化应激(数据没有显示)。同样,浓度0.1和1 ng / ml显著防止氧化应激。因此,这些浓度被用于以下氧化应激实验。H的有害影响2O2部分但显著改善提取13.5%(图2)。
3.2。Honeybush提取增加线粒体呼吸在生理条件下,在H2O2全身的压力
线粒体消耗氧气进行呼吸和氧化磷酸化。因此,对于评估线粒体呼吸、细胞的耗氧速率测量基底条件下生活。结果表明,水的提取c . subternata和c . genistoides和ethanolic提取70%c . genistoides在生理条件下增加了呼吸在基线。然而,在进一步分析数据,只有水的提取c . subternata和c . genistoides在呼吸1 ng / ml显著增加33.2%和40.7%,分别为(图3(一个))。提取,大大增加了其他途径导致的生产ATP,糖酵解,c . genistoides(1 ng / ml)c .叶(0.1和1 ng / ml)。这种增长是51.7%(图3 (b))。糖酵解的呼吸的相关性,获得了“能量图”(图3 (c)),允许可视化表示的每个提取的行动。因此,c . subternata和c . genistoides增加细胞的耗氧速率(呼吸)c .叶增加了糖酵解。
(一)
(b)
(c)
H2O2引起呼吸明显降低41.7%(图4(一)、红酒吧)。所有提取增加了耗氧率,使它更接近未经处理的细胞的水平。然而,只有水提取物c . subternata能够显著提高呼吸在基线(增长25.9%)(图4(一))。关于糖酵解,H2O2引起显著下降38.9%完全获救的水提取物c . genistoides(1 ng / ml)(图4 (b))。“能源地图”证实最有效的提取在抢救呼吸H2O2压力的水提物c . subternata(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。Honeybush提取增加线粒体膜电位(MMP)在生理条件下,在H2O2全身的压力
的水提取物c . genistoides(1 ng / ml)c .叶(0.1和1 ng / ml)显著增加24% MMP在生理条件下治疗后24 h(图5(一个))。
(一)
(b)
H2O2在400μM导致MMP显著减少55.1%增加67.9%的提取物。在这种情况下,所有提取完全拯救MMP(图5 (b))。
总的来说,所有提取物作用于线粒体膜电位增加它在生理条件下和在H2O2全身的氧化应激。
3.4。Honeybush提取不同类型的减少ROS在H2O2全身的压力
H2O2在400μM导致线粒体ROS增加29.5%是使用染料发现DHR (dihydrorhodamine 123)。增加显著改善23.1%c . subternata水提取物。c . genistoides也带来了ROS水平但不显著(图6(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
胞质活性氧检测使用染料DCF (2 ,7 - - - - - -dichlorodihydrofluorescein二醋酸盐)。H2O2在400μ米海拔引起的31.2%。所有提取胞质ROS水平降低,但水提取物c . subternata在1 ng / ml胞质ROS的减少(28.9%)和70% ethanolic提取的c . genistoides0.5 ng / ml(胞质ROS的减少26.2%)是最有效的(图6 (b))。
H2O2在400μ线粒体超氧化物阴离子含量增加了43%。所有提取,除ethanolic提取的c . genistoides,大大降低了线粒体超氧化物阴离子的水平。然而,水提取物c . subternata,c . genistoides,c .叶1 ng / ml的浓度完全中和线粒体超氧化物阴离子水平(分别减少42%、42.6%和42.6%)(图6 (c))。
总超氧化物阴离子含量升高了67.9%2O2处理细胞。所有四个提取增加改善,但只有水提取物c . subternata和c .叶1 ng / ml和ethanolic提取的c . genistoides在0.5 ng / ml显著降低超氧化物阴离子含量48.8%,50.9%,和50.3%,分别为(图6 (d))。
4所示。讨论
在这项研究中,我们假设honeybush提取物可能施加有益的影响神经细胞的线粒体在生理条件下以及氧化应激下由于酚类化合物含量。神经元有很高的能源需求,因此特别依赖于线粒体功能。出于这个原因,我们评估的影响四个不同honeybush提取特征明显的神经元模型,神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞。四个提取的热水提取物c . subternata,c . genistoides,c .叶以及ethanolic提取70%c . genistoides。这些提取筛选后选择水,ethanolic ethanolic 40%和70%提取独眼畸形物种。过氧化氢(H2O2)是用作氧化压力,因为它是一种最丰富的内生活性氧和活性。
honeybush提取物对线粒体功能的有益作用在生理条件下,保护作用下氧化应激可以证明。四个提取显示不同的有益特性在不同的线粒体和细胞的网站。ATP是生存所需的能量和功能的细胞,尤其是神经元具有高能源需求。在最低浓度(0.1 1 ng / ml),所有提取改进的ATP在生理条件下的生产。这增加了4%(图1)。此外,所有提取物能够显著增加ATP水平下H2O2全身的氧化应激。这个改善不是一个完整的救援,但部分增加13.5%(图2)。
线粒体呼吸是线粒体的固有功能,对细胞的生存至关重要,因为它导致的生产大部分的ATP。呼吸作用是发生在等位于内线粒体膜(IMM)。糖酵解的次要途径导致生产ATP。的水提取物c . subternata和c . genistoides(在1 ng / ml)显著增加的基础呼吸作用线粒体高达40.7%,而那些的c . genistoides和c .叶生理条件下显著增加糖酵解高达51.7%(图3)。然而,只有c . subternata水提物(1 ng / ml)可以显著救援呼吸,只有受损c . genistoides水提物(1 ng / ml)可以挽救造成的受损的糖酵解H2O2(图4)。的水提取物c . subternata和c . genistoides具体表现在呼吸。此外,c . subternata水提物增强氧化应激下呼吸。这可以解释为这个提取是唯一一个中和所有四种测试ROS尤其是线粒体活性氧和线粒体超氧化物阴离子直接影响OXPHOS和呼吸(图6)。这可能也是唯一的原因提取呼吸压力下采取行动。
的水提取物c . genistoides和c .叶增加了MMP在生理条件下,所有四个提取完全拯救MMP在氧化应激(图5),除了在一定程度上改善ATP生产(图2)。在OXPHOS线粒体等,电子由NADH和FADH提供2通过小区I-IV转移。这个运动的电子驱动复合物,III, IV注入质子膜间隙,他们终于用ATP合酶(复杂V)产生ATP通过ADP磷酸化。MMP的是极化线粒体膜的指示器,因此表明质子泵送的膜间隙不是阻碍,这样他们就可以驱动ATP生产复杂的V (35,36]。改善氧化应激下的ATP生产的提取可能是由于他们的能力完全拯救MMP在氧化应激和支持这种相互依存的MMP和ATP生产。
ROS(图6),预处理的水提物c . subternata(主要是在1 ng / ml)减少测试ROS的四种类型,它是唯一提取测试显著降低线粒体ROS(与染料DHR检测)。的结果c . subternata提取是在线粒体超氧化物阴离子水平(与染料MitoSOX检测)和所有其他线粒体活性氧,如H2O2(检测染料DHR),可能意味着它另外他们拾荒或增强的活动中和它们的抗氧化防御系统(如谷胱甘肽,过氧化氢酶)21]。的水提物c .叶降低胞质ROS、总超氧化物阴离子含量和线粒体超氧化物阴离子的水平。这两个c . genistoides提取不同,即。,its aqueous extract neutralized cytosolic ROS and mitochondrial superoxide anion, while its 70% ethanolic extract decreased cytosolic ROS and total superoxide anion levels but had no significant effect on the specific mitochondrial ROS. All extracts had thus a minimizing effect on ROS levels, though at different degrees and on different ROS types (Figure6)。这可能是由于不同的生物活性成分的具体提取根据独眼畸形物种和萃取溶剂。而所有的水提取物(c . subternata,c . genistoides,c .叶)作用于线粒体超氧化物阴离子的水平,ethanolic提取c . genistoides只影响到胞质ROS和总超氧化物阴离子的水平。假设后者提取具体作用于胞质超氧化物阴离子。
最有益的honeybush提取物的浓度在这项研究中被发现是低至0.1和1 ng / ml。植物提取物是复杂的多种化合物的混合物在不同浓度不同的化学和药理活性。不同成分的植物提取物可以对抗,协同或变构效应(37]。例如,更高的活性物质浓度可能削弱另一个生物活性成分的活性。可能有一个或几个成分是有效的在一个低浓度和浓度的逐渐增加可能逐渐减少疗效,可以解释观察到的效应在非常低的浓度。
考虑到酚醛概要文件的不同提取物,很明显,没有模式,可以解释微分活动。总多酚含量往往高度与抗氧化活性在体外但类似的水提取物c . subternata,c . genistoides,c .叶24 g(25 ~ 26日,和没食子酸当量每100 g提取,分别)。ethanolic提取的c . genistoides、酚醛含量略有增加(~ 28克没食子酸等价物每100克提取)。然而,酚醛含量之间没有本质上的区别的不同提取为我们的研究提供一个解释。事实上,芒果苷,表明有有益的作用在体外和在活的有机体内神经退化模型,以及氧化应激(38- - - - - -43),是最低的c . subternata水提取物和最高的70% ethanolic提取的c . genistoides。根据这些研究,我们预期的c . genistoides70% ethanolic提取将发挥最有效的神经保护属性,而水提物c . subternata将发挥。有趣的是,我们的实验结果证明我们的假设错了相反的效果是观察到的水提物c . subternata是最有益的提取。仔细观察提取物的组成(表1)表明,水提物c . subternata含有更高浓度的黄酮和dihydrochalcones。Scolymoside、现在的最高浓度c . subternata水提取和检测量的两个缺席c . genistoides毛地黄黄酮的提取,是一种糖苷黄酮糖苷配基证明抑制神经元线粒体超氧化物阴离子O的生产2⋅-(44]。糖基化的类黄酮结构的一个环的位置即为scolymoside将减少其自由基清除能力与毛地黄黄酮相比,它并没有废除的活动(45]。Dihydrochalcones相关的c . subternata不仅作为激进的食腐动物(46还展示了神经保护作用[47,48]。橘皮苷,黄烷酮存在于ethanolic提取70%的最高水平c . genistoides可以减轻氧化应激(49),作为神经保护代理,与提高内源性抗氧化防御功能(50]。
关于植物提取物的生物利用度,这取决于每个提取物中包含单一化合物的生物利用度。提取不同honeybush物种不同化学成分。然而,honeybush已经报道的主要有效成分芒果苷和橙皮素,有一些数据关于他们的生物利用度和穿过血脑屏障(BBB)的能力。值得注意的是,微量的芒果苷被发现后的老鼠大脑急性口服单剂量治疗的植物提取物含有芒果苷表明这种化合物可以交叉BBB [51),而在另一项研究中,芒果苷后,老鼠的大脑中没有检测到单剂量通过腹腔内管理(52]。然而,我们必须考虑到不同的化验中使用了两个不同的敏感性研究。研究从李et al。(2008),一个验证高度敏感的开发和应用高效液相色谱法(HPLC)检测芒果苷单剂量口服后中药知母扎亚茨研究中提取,而et al .(2012),一个更敏感的检测方法使用(一个简单的TLC方法)。同样,治疗有效成分的生物利用度银杏叶大脑中提取对(GBE)曾质疑,直到最近的研究表明在老鼠的大脑对的分布GBE对单一和重复口服GBE [53,54]。本例中的化合物也成功地用高效液相色谱法检测。橘皮苷或其糖苷配基hesperetin似乎能够遍历BBB和直接运用他们的大脑中的神经保护作用[55- - - - - -57]。
此外,生物利用度在大脑中可能受影响的给药途径和纯化合物是否管理或植物提取物中包含但我们可以假设芒果苷和橙皮素对大脑起到神经保护作用和外围神经元。
综上所述,本研究的结果表明c . subternata水提物中最有效的增强线粒体功能尤其是在氧化应激的情况下。它是唯一一个在呼吸氧化应激和唯一一个低四个类型的ROS测量在这个研究。这些研究结果尤其有关建立honeybush茶作为营养食品的种类主要是培养茶目前的生产c . subternata。其他两个水提取物(c . genistoides和c .叶)也产生有益的影响。c . genistoides采取更多的呼吸在生理条件下,c .叶更有效地中和活性氧(积极的对三种类型的ROS)。有趣的是,在茶行业,honeybush茶通常是混合后准备不同的物种。因此,评估不同种类的混合提取物的活动将会非常有趣。
5。结论
在这项研究中,honeybush提取的影响增强线粒体和神经功能和防止氧化应激的不利影响。的水提物c . subternata优于其他提取增加线粒体功能和生物能疗法,尤其是在H2O2全身的氧化应激。的水提取物c . genistoides和c .叶接下来的功效在线粒体功能。低浓度提取1 (0.1 ng / ml)也更有效。总的来说,我们的数据与现有文献报道的抗氧化作用honeybush [19- - - - - -22]。然而,honeybush提取物对神经细胞的影响,特别是对线粒体功能已经在这里第一次调查。我们的团队正在进行进一步的研究以研究更深入的影响honeybush打击压力和提高神经功能。这些发现使honeybush预防氧化应激的潜在候选人,为进一步的研究打下了基础,旨在发展condition-specific营养食品。
缩写
| ADP: | 二磷酸腺苷 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| BBB: | 血脑屏障 |
| 贴现: | 2 ,7 - - - - - -Dichlorodihydrofluorescein二乙酸 |
| 她: | Dihydroethidium |
| DHR: | Dihydrorhodamine 123 |
| DMEM: | 杜尔贝科鹰介质的修改 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| ECAR: | 细胞外的酸化速率 |
| 应急服务国际公司: | 电喷雾电离 |
| 等: | 电子传递链 |
| FADH2: | 减少的黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚) |
| FCCP: | (羰基cyanide-4) - trifluoromethoxy苯腙 |
| FCS: | 胎牛血清 |
| GBE: | 银杏叶提取 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽(γ-glutamylcysteinylglycine) |
| 谷胱甘肽:GSSG: | 谷胱甘肽氧化谷胱甘肽的比例减少 |
| 哈佛商学院: | 汉克斯平衡盐溶液 |
| HPLC-DAD: | 高效液相色谱二极管阵列检测器 |
| IMM: | 内线粒体膜 |
| 质: | 液相色谱-光谱法 |
| MMP的: | 线粒体膜电位 |
| 女士/小姐: | 串联质谱 |
| MtDNA: | 线粒体DNA |
| NADH: | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的形式 |
| 光学字符识别: | 耗氧速率 |
| OXPHOS: | 氧化磷酸化 |
| PBS: | 磷酸盐 |
| Q-TOF: | Synapt G2四极飞行时间 |
| ROS: | 活性氧 |
| 扫描电镜: | 平均数标准误差 |
| SH-SY5Y: | 人类神经母细胞瘤细胞系 |
| TMRM: | Tetramethylrhodamine甲基酯 |
| UPLC: | 超高效液相色谱 |
| 紫外可见: | 紫外可见光。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究支持两国从瑞士国家科学基金会的资助(批准号IZLSZ3_170858 GIAE)和南非NRF(批准号107805年瑞士和南非之间EJ)。