HSF1变弱LPS-Induced急性肺损伤小鼠通过抑制巨噬细胞浸润

文摘

热休克因子1 (HSF1)是一个转录因子参与了热休克反应和其他生物过程。我们这里有了一个重要的角色HSF1的急性肺损伤(ALI)。HSF1基因敲除小鼠作为模型的脂多糖(LPS)诱导阿里。肺损伤加重,巨噬细胞浸润显著增加在支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织HSF^{- / -}老鼠相比,在HSF1的损害^{+ / +}老鼠。LPS刺激后,HSF^{- / -}老鼠表现出更高水平的单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)血清、BALF、肺组织和增加MCP-1和趋化因子的表达(碳碳主题)受体2 (CCR2)巨噬细胞相比,那些在HSF1的表面^{+ / +}。电泳迁移率改变分析(EMSA)和双荧光素酶报告分析显示,HSF1可以直接绑定到热休克元素(HSE)的启动子区域里MCP-1及其受体CCR2,从而抑制两个基因的表达。我们的结论是,HSF1减毒老鼠LPS-induced阿里通过直接抑制转录MCP-1 / CCR2,进而减少巨噬细胞浸润。

1。介绍

急性肺损伤是一个类型的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭,在非心脏肺内外致病因素导致损害肺泡和毛细血管endothelia,增加alveolar-capillary膜的渗透性。如果条件不是控制,它将发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS) (1)最终导致死亡。阿里的发病机制很复杂,尚未完全阐明。目前的研究表明,炎症是阿里的一个重要机制(2)。

HSF1是热休克转录因子参与反应;的转录调节热休克蛋白质如Hsp27、Hsp60, Hsp70,发挥重要cytoprotective肺部炎症和损伤作用3- - - - - -6)。我们以前的研究表明,HSF1有保护作用LPS-induced multiorgan障碍综合症(7,8)。此外,HSF1减少白细胞渗透到肺部和减少生产的一些炎症介质,从而衰减炎症反应,表现出对内毒素LPS所致的保护作用。然而,HSF1减轻ALI的潜在机制需要进一步探索。

巨噬细胞在阿里的发病机制是重要的效应细胞。据报道,巨噬细胞活化和迁移是阿里的严重程度密切相关(9)。然而,在阿里HSF1对巨噬细胞的影响尚不清楚。本研究旨在探索HSF1的影响在阿里的巨噬细胞,通过评估HSF1的作用在调节趋化因子表达。我们所知,这是第一个报告显示,HSF1减轻LPS-induced巨噬细胞浸润和阿里在老鼠中,通过下调macrophage-related趋化因子。

2。材料和方法

2.1。动物

HSF1基因敲除(HSF1^{- / -})和野生型(HSF1^{+ / +})老鼠礼物从艾弗博士j·本杰明(威斯康辛医学院,密尔沃基市威斯康辛州,美国),描述了其他地方(10)。HSF1老鼠使用同源重组创建在胚胎干细胞和基因打靶载体所描述的麦克米兰et al。(11)。交配后HSF1杂合的雌性老鼠(♀HSF1^{+ / -}),HSF1杂合的雄性老鼠(♂HSF1^{+ / -}),后代获得了三个基因型:野生型、杂合的类型,和纯合类型。出生后3周,年轻小鼠断奶,关在单独的笼子里。在第四周,鼠标使用DNA的基因识别合格HSF1基因敲除纯合子(HSF1的尾巴^{- / -})和野生型(HSF1^{+ / +})小鼠的实验。动物饲养和实验协议以前批准的中南大学动物保健和使用委员会制度(湖南、中国)许可证2018号sydw0378(批准日期:11月25日,2018)。

2.2。急性肺损伤模型

年龄和sex-matched HSF1^{- / -}和HSF1^{+ / +}老鼠(男性,4 - 5个月大的时候,20 - 25克)随机分为HSF1^{+ / +}+生理盐水(NS)组,HSF1^{+ / +}+有限合伙人(美国0111年大肠杆菌:B4,σ)组,HSF1^{- / -}+ NS组,HSF1^{- / -}+ LPS组。老鼠用5%水合氯醛麻醉(0.01 ml / g,腹腔内)和2%异氟烷(吸入)。然后,有限合伙人(1毫克/毫升)被灌输到气管的剂量3毫克/公斤(12)HSF1^{+ / +}+ LPS和HSF1^{- / -}+ LPS组。HSF1^{+ / +}+ NS和HSF1^{- / -}+ NS组与生理盐水使用相同的剂量和灌输过程有限合伙人。治疗进行评估后12 h, 24小时,36小时。在这个实验中,痛苦和不幸的评估从术后小鼠进行安乐死。方法如下:老鼠被放置在一个小透明观察室( )监控,每个鼠标观察3 - 4分钟。根据差距分数(13),疼痛指标等活动,姿势,呼吸模式,外套条件,分别记录和其他有关老鼠。盲人观察员评估每个鼠标1、6、12、24、36小时手术后根据样本集合的时间。老鼠分配得分为0(正常)或1(异常)为每一个参数。分数记录根据疼痛的变化指标,然后聚合得到一个综合得分为每个鼠标。LPS-treated组的老鼠显示深层呼吸等症状,减少运动,头发竖立,拱门,减少消耗的饲料和水,以及使用后体温上升,有限合伙人。因此,为了排除干扰引起的有限合伙人,我们严格遵守LPS-treated组和生理盐水组之间的差异,然后得分LPS-treated组的老鼠。

2.3。肺湿/干重比(W / D)

肺水肿治疗组评估使用肺湿/干重比。老鼠被杀,和肺被重(湿重)。肺在80°C加热24 h得到干重和计算W / D比率。

2.4。提取的支气管肺泡灌洗液

BALF收集如前所述(14)。老鼠被颈椎脱位牺牲。脖子上的皮肤被切断了公开的气管,和一个小斜切口是在使用眼科剪的远心端气管。然后,气管套管针被插入到洗小鼠肺三次冲洗1毫升的冷无菌磷酸盐(PBS)洗。收集到的液体灌洗在250×离心机15分钟在4°C。细胞颗粒在PBS resuspended流式细胞仪检测。上层清液储存在−80°C到进一步使用。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

上层清液从肺组织匀浆、BALF和血清收集测量水平的MCP-1使用酶联免疫试剂盒(美国RD MJE00B)根据制造商的指示。

2.6。免疫荧光

免疫荧光分析以前公布的(15)。简而言之,ALI模型小鼠在不同时间点牺牲。左肺切除后立即死亡和4%多聚甲醛中固定24 h。在石蜡包埋后,肺组织被切割成4μ米厚的部分。为抗原检索,部分被放置在柠檬酸钠缓冲和微波加热在100°C,持续15分钟,然后用10%牛血清白蛋白(BSA)孵化在PBS 2 h在室温下阻止非特异性结合位点。随后,部分被孵化与小鼠macrophage-monocyte特定单克隆抗体(anti-F4/80)(1: 200年,圣克鲁斯,美国)和碳碳趋化因子受体2型单克隆抗体(anti-CCR2) (Abcam 1: 100年,美国)一夜之间在4°C,其次是孵化与辣根过氧化物酶二次抗体(1:50、ABclonal、武汉)1 h在37°C下黑暗。与PBS洗4次后,样本处理密封液体。使用全景图像获得250 / MIDI(匈牙利)。

2.7。流式细胞术

从BALF细胞收集和准备流仪分析之前报道(16)。细胞悬浮在1毫升1×红细胞裂解缓冲(美国BD生物科学)5分钟,然后在250×离心机为5分钟。上层清液包含100年resuspended BALF细胞μl PBS,然后用0.5了μl纯化鼠anti-mouse CD16 / CD32抗体(美国BD生物科学)10分钟在4°C。BALF细胞沾fluorescent-conjugated抗体:PerCP-Cy™5.5鼠anti-mouse CD45抗体(0.5μl, BD生物科学,美国)、PE anti-mouse F4/80抗体(0.5μl, BD生物科学,美国),Alexa萤石647 anti-mouse CCR2 (0.5μ美国Biolegend l) 20分钟在4°C下黑暗,然后在250×离心机为5分钟。浮在表面的固定与100μl 2%的多聚甲醛在4°C下10分钟的黑暗。与PBS洗两次后,样本resuspended在200年μl PBS,然后分析了流式细胞术(BD生物科学)使用FlowJo分析软件(FlowJo, LLC,亚什兰,矿石)。

2.8。实时定量逆转录PCR(存在)

总RNA提取和存在进行如前所述(17)。肺组织的总RNA提取使用试剂盒®试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示,然后使用PrimeScript retrotranscribed成cDNA逆转录酶(豆类,京都,日本)和随机引物。执行中存在使用结核病绿色™预混料ExTaq™(豆类,京都,日本)7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)。使用的引物序列中存在MCP-1前进:5−TTA AAA ACC TGG ATC GGA ACC AA−3和反向:5−GCA TTA GCT柠檬酸手枪TTA CGG GT−3 ;CCR-2转发:5−ATC CAC GGC ATA CTA柠檬酸ACA TC−3和反向:5−−CAA GGC柠檬酸CCA柠檬酸TCG标签3 ;β肌动蛋白转发:5−TGC TGG亚美大陆煤层气有限公司GTG广汽AGT GAG G−3和反向:5−猫TGC TGA CAG手枪GCA棉酚GG−3 。2^{——∆∆CT}方法应用于确定相对mRNA表达水平。

2.9。电泳迁移率改变分析(EMSA)

EMSA执行使用原始264.7老鼠巨噬细胞细胞系。细胞治疗在43°C 60分钟10厘米细胞培养皿(11)。加热后,核提取准备使用核和胞质蛋白提取试剂(20126 es50 Yeasen,中国)。寡核苷酸探针被Sangon生物合成与生物素标记,它基于序列覆盖HSE序列(18,19)的启动子区域MCP-1和CCR2(表1)。下面的寡核苷酸探针使用(为了清晰,显示单链,但使用了双链):mcp - 1.1: 5 - - - - - -aggtgagttttatata棉酚一个TTTCttctgcaccatgagct-3(613−−606个基点HSE1);mcp - 1.2: 5 - - - - - -atctcaggtccagggaagc一TTCTG棉酚gcaccagcccca-3(1475−−1468个基点HSE2);CCR2.1: 5 - - - - - -agcatttaccta棉酚TTTTCcataacag-3(754−−747个基点HSE1);CCR2.2: 5 - - - - - -gtttacatTTC助教棉酚cc ttatactgtg-3(HSE2: 1095−−1088个基点)。EMSA都使用了LightShift®化学发光EMSA工具包(美国20148年,热科学),根据制造商的指示。如前所述(执行绑定的反应20.)。简而言之,biotin-labeled包含HSE的寡核苷酸序列与5孵化μg在室温下20分钟的核提取绑定缓冲(10×绑定缓冲,1μg保利(dI-dC)、50%甘油、1% NP-40, 100毫米MgCl₂100毫米EDTA)。这个反应是进行凝胶电泳5%的聚丙烯酰胺凝胶和转移到尼龙膜。Biotin-labeled DNA被化学发光检测。supershift化验,2μl (anti-HSF1抗体(美国Abcam ab2923)添加到绑定的反应。200倍摩尔过剩的无标号竞争者寡核苷酸(竞争调查)和标记突变寡核苷酸(突变体探测器)是用于竞争分析。

2.10。Dual-Luciferase记者分析

的持续激活HSF1质粒pcDNA3.1 (+) / HSF1 (+) (mHSF1)和空载体质粒pcDNA3.1 (+) / HSF1-wt请提供的理查德博士Voellmy HSF制药有限公司,瑞士。一代的MCP-1启动子荧光素酶记者构造(长篇pGL3-MCP-1-wt (1600−−1 bp)), pGL3-MCP-1-Mut1 (HSE1突变,613−−606个基点),pGL3-MCP-1-Mut2 (HSE2突变,1475−−1468个基点),和pGL3-MCP-1-Mut3(突变HSE1 HSE2)),以及CCR2启动子荧光素酶记者构造(长篇pGL3-CCR2-wt (1162−−1 bp), pGL3-CCR2-Mut1 (HSE1突变,754−−747个基点),pGL3-MCP-1-Mut2 (HSE2突变,1095−−1088个基点),和pGL3-MCP-1-Mut3 (HSE1突变和HSE2),是由PCR和克隆到一个向量pGL3-Basic荧光素酶。合成序列的真实性被测序验证。质粒提取(美国D6950-01ω)和存储在-20°C为后续实验。264.7原始细胞孵化24-well板和增长到70 - 90%融合,然后用500 ng MCP-1转染或CCR2启动子荧光素酶报告质粒,20 ng pRL-TK,和500 ng mHSF1质粒或空载体质粒使用Lipofectamine™3000转染试剂(L3000015,英杰公司™,美国)。转染48 h后,细胞溶解产物提取和测试使用dual-luciferase记者分析工具包(美国Promega E1910)。使用协同发光测量^嗨标仪(美国BioTek)。

2.11。统计分析

所有的数据进行了分析使用GraphPad Prism 7.0(美国GraphPad软件)和SPSS 21.0 (SPSS、美国)。数据表示为 。学生的 - - - - - -比较两组进行了测试和单向方差分析(方差分析)比较多个组,紧随其后的是一个多重比较测试(Bonferroni事后测试)。kaplan meier分析是用来比较不同组之间的存活率。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。HSF1减轻肺组织损伤和改善血管渗透性LPS-Induced阿里

深红色拥塞表面观察LPS-instillated小鼠的肺,HSF1的更加明显^{- / -}比在HSF1 + LPS组^{+ / +}+ LPS组(图1(一))。肺的病理组织形态学显示增加肺水肿,炎症细胞的浸润,肺泡出血,和毁灭的HSF1的上皮和内皮细胞结构^{- / -}+ LPS组症状观察相比LPS-treated HSF1^{+ / +}组(图1 (b))。肺HSF1 W / D比率^{- / -}+ LPS组(33%)明显高于HSF1的^{+ / +}+ LPS组( )(图1 (c))。BALF总蛋白质含量在12、24和36 h后有限合伙人滴剂在LPS-stimulated显著增加小鼠,显示HSF1之间的显著差异^{- / -}+ LPS和HSF1^{+ / +}+ LPS组( )(图1 (d))。此外,我们发现HSF1的存活率^{- / -}+ LPS组明显低于HSF1的^{+ / +}+ LPS组( )(图1 (e))。这些结果表明,HSF1肺组织损伤更严重^{- / -}有限合伙人治疗后组,表明HSF1减轻肺组织损伤和改善血管通透性和LPS-induced阿里老鼠的生存。

3.2。HSF1的巨噬细胞浸润到BALF和从LPS-Induced阿里小鼠肺组织

巨噬细胞是重要的效应细胞在ALI发病机制和疾病严重程度密切相关。评价肺组织中的巨噬细胞浸润和渗出物从LPS-treated HSF1^{+ / +}和HSF1^{- / -}老鼠,我们测量了BALF中巨噬细胞的百分比的变化在不同的时间点使用流式细胞仪。结果表明,在12 h, 24 h, h和36 LPS滴剂后,HSF1的BALF中巨噬细胞含量^{- / -}老鼠明显高于HSF1^{+ / +}老鼠( )(数据2(一个)- (d))。此外,组织免疫荧光测定结果表明,HSF1^{- / -}+ LPS组巨噬细胞渗透到肺组织明显高于观察HSF1^{+ / +}+ LPS组(图2 (e))。这些结果表明,HSF1可以减弱巨噬细胞浸润到LPS-induced阿里小鼠的肺组织。

3.3。HSF1减少MCP-1表达式在血清、肺组织,和BALF LPS-Induced阿里老鼠

巨噬细胞浸润是由MCP-1∕CCR2趋化因子(21- - - - - -24)。MCP-1水平在不同时间点血清,测定肺组织和BALF。12小时,24小时,36小时后有限合伙人治疗,从HSF1的MCP-1水平血清^{- / -}+ LPS组达到36 h和HSF1明显高于观察^{+ / +}+ LPS组( ),( )(图3(一个))。类似的变化观察肺组织和BALF(数据3 (b)和3 (c))。此外,我们发现MCP-1 mRNA水平HSF1的肺组织明显更高^{- / -}+ LPS组比HSF1^{+ / +}+ LPS组( )(图3 (d))。结合相对HSF1的信使rna表达水平(图3 (e)),这些结果表明,HSF1起到了保护作用在LPS-induced阿里老鼠通过减少MCP-1表达,从而抑制巨噬细胞浸润。

3.4。HSF1减少CCR2表达式LPS-Induced阿里小鼠的巨噬细胞

我们的下一个问题是HSF1是否会影响表面CCR2巨噬细胞的表达。CCR2表达小鼠BALF使用流式细胞仪检测。我们发现CCR2表达增加后24 h和36 h有限合伙人治疗,36 h(后,不同的是更重要的 )(数据4(一)- (d))。此外,组织免疫荧光试验进行检测的表达CCR2在肺组织的巨噬细胞。没有发现显著差异表达水平之间的CCR2 HSF1的巨噬细胞^{+ / +}和HSF1^{- / -}老鼠在12 h (LPS)治疗后(图4 (e))。然而,在有限合伙人治疗后24 h和36 h(数字4 (f)和4 (g)),在HSF1 CCR2表达式^{- / -}老鼠和高于HSF1达到顶峰^{+ / +}老鼠。同样,CCR2 mRNA水平在LPS刺激后肺组织逐渐增加,其价值在HSF1更高^{- / -}老鼠比HSF1的^{+ / +}老鼠( )(图4 (h))。这些结果表明,在LPS-induced ALI模型中,HSF1抑制巨噬细胞浸润减少CCR2的表达。另一方面,我们证明了通过修改CCR2表达式,肺组织的巨噬细胞浸润显著增加LPS-treated HSF1^{- / -}老鼠。

3.5。HSF1抑制单核细胞/巨噬细胞趋化作用通过直接调节的转录MCP-1 / CCR2

在先前的研究中,我们准备了一个使用HSF1内毒素模型^{- / -}和HSF1^{+ / +}老鼠。我们准备了微阵列包含384个炎症因子基因筛查HSF1-regulated炎症反应的基因。发现HSF1抑制MCP-1的表达及其受体CCR2 (25)。进一步的生物信息学分析确定了两个HSE (HSE1和HSE2)的倡导者MCP-1和CCR2。EMSA行为,我们设计了探针识别标识的HSE网站。我们的研究结果表明,HSF1专门绑定体外HSE1 HSE2的推动者和启动子的MCP-1(数据5(一个)、(b)和(d))。调查是否HSF1调节MCP-1和CCR2在转录水平的表达,我们进行荧光素酶化验使用含有DNA片段的记者构造与HSE (wt)或变异的HSEMCP-1和CCR2启动子,分别和在一起(数字5 (c)和5 (e))。如图5 (c),HSF1过度导致显著抑制启动子活性MCP-1-wt观察价格相比空向量( )。启动子的活性MCP-1仍然是抑制由单一HSE1或HSE2突变记者结构( )。然而,HSF1没有改变启动子活动同时在两个网站都是突变。结合EMSA结果,这些研究结果表明,HSF1-binding网站613−−606个基点(HSE1)和1475−−1468个基点(HSE2)在调节发挥着重要作用MCP-1启动子HSF1的活动。另一方面,CCR2-wt记者被压抑的荧光素酶活性在细胞cotransfected mHSF1质粒与观察空向量(图5 (e))。然而,镇压可以移除HSE1突变时,但不是HSE2的突变。结合EMSA结果,这些发现表明,HSE1 (754−−747 bp)在调控发挥着重要的作用CCR2启动子HSF1的活动。总的来说,这些结果表明,HSF1的转录表达下调MCP-1和CCR2通过绑定HSE的启动子区域。

4所示。讨论

阿里,或者更严重的表型急性呼吸窘迫综合征(ARDS),可能是由于严重的外伤或感染等因素(26)。ARDS影响每年大约有200000患者,导致将近75000人死亡在美国(27)。阿里的发病机制很复杂,尚未完全阐明。因此,进一步了解其发病机制具有潜在的治疗意义。基于一个阿里模型引起的气管内的有限合伙人的滴剂HSF1基因敲除小鼠,这项研究表明,HSF1阿里小鼠的保护作用。我们所知,我们首次证明HSF1的防护效果的差别是由于对这些MCP-1和CCR2,由于绑定的HSE HSF1基因的启动子。因此,抑制巨噬细胞浸润。

我们以前的工作表明,HSF1缓解多器官损害通过抑制炎症因子的释放和白细胞浸润的组织内毒素老鼠(7,8)。确定HSF1的保护作用在LPS-induced阿里,我们使用HSF1基因敲除小鼠ALI模型做准备。我们发现在LPS刺激后,在HSF-1肺组织损伤^{- / -}老鼠比野生型小鼠,观察到的严重得多。此外,HSF1减轻肺水肿,巨噬细胞浸润,肺泡出血,降低蛋白质泄漏,和提高阿里老鼠的生存。这些观察是一致的与其他研究使用LPS-induced ALI模型(28,29日)。总之,这些结果表明,HSF1可以减轻肺损伤,提高了生存率,对LPS-induced阿里有保护作用。

炎症反应是一个至关重要的元素在阿里的发病机制;其病理生理特性是炎性渗出物和促炎和抗炎反应之间的不平衡,这可能最终导致呼吸衰竭(30.)。有证据表明,巨噬细胞是关键细胞ALI / ARDS的发病机制31日,32)。巨噬细胞,受损组织的招聘是一个重要的过程导致炎性损伤。一些研究表明,MCP-1及其受体CCR2在巨噬细胞迁移(扮演着重要角色21- - - - - -24)。MCP-1(也称为CCL2)是一个碳碳趋化因子家族的成员,结合CCR2 (33)。MCP-1通常是由巨噬细胞分泌,以应对病原体感染(34),是最有效的诱导单核细胞信号转导途径的轮回(35)。高亲和力的MCP-1 CCR2是一个重要因素在促进单核细胞/巨噬细胞激活,趋化性,和炎症反应,导致重要的生物后果(21,22)。确认HSF1的影响巨噬细胞浸润,我们分析血清、肺组织匀浆,并从阿里BALF老鼠量化MCP-1的浓度。进一步,我们分析了巨噬细胞表面表达CCR2在BALF和肺组织使用流式细胞仪和免疫荧光试验,分别。结果表明,血清中表达MCP-1,肺组织,BALF LPS-stimulated HSF1^{- / -}老鼠逐渐增加刺激和后明显高于观察野生型老鼠。CCR2在巨噬细胞表面的表达与MCP-1伴随的表达式。

结果表明,HSF1抑制巨噬细胞迁移通过下调MCP-1和CCR2。然而,表达下调机制尚不清楚。已经证明,HSF1扮演一个角色在一些疾病通过调节基因转录(36- - - - - -38)。绑定的HSF1基因激活基因转录启动子是一个关键的一步。在压力条件下,HSF1形式homotrimers磷酸化与热休克基因的启动子结合调节转录(39- - - - - -41)。HSF1可以调节其他基因的表达,包括炎性细胞因子(37,42,43)。探讨HSF1对炎症的影响,在先前的研究中,我们为炎症反应可能由HSF1基因筛选,使用一个包含炎性细胞因子基因微阵列。我们发现,HSF1监管等基因的表达MCP-1 / CCR2(25)。此外,生物信息学分析表明,有几个HSE的推动者MCP-1 / CCR2。结合JASPAR核心数据库的结果,我们提出了一个假设HSF1如何可能影响炎症的过程中通过直接调节的表达MCP-1 / CCR2。在这项研究中,我们测试了这种假设通过EMSA和双荧光素酶报告实验实验,发现HSF1可以直接表达下调MCP-1 / CCR2。因此,HSF1的保护效应解释了阿里小鼠巨噬细胞迁移的抑制和渗透的差别由于对这些MCP-1 / CCR2。

5。结论

总之,HSF1减毒老鼠LPS-induced阿里通过抑制巨噬细胞浸润的差别由于对这些MCP-1 / CCR2。

缩写

阿里:	急性肺损伤
ARDS:	急性呼吸窘迫综合征
BALF:	支气管肺泡灌洗的液体
BSA:	牛血清白蛋白
CCR2:	趋化因子受体2(碳碳主题)
ELISA:	酶联免疫吸附试验
EMSA:	电泳迁移率改变分析
HSE:	热休克元素
HSF1:	热休克因子1
有限合伙人:	脂多糖
插件:	Multiorgan功能紊乱综合症
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
NS:	生理盐水
PBS:	磷酸盐
存在:	实时定量逆转录PCR
W / D:	湿/干重。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突,这里描述的工作没有以前发表的,而不是考虑发表在其他地方,在全部或部分。

确认

这项研究是由中国的海南省自然科学基金,批准号819 qn229;海南医科大学的训练计划,批准号HY2018-33;中国的国家自然科学基金,批准号81671895,81871610,81471897,81870071;湖南省自然科学基金、中国jj40393批准号2019。

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