Cav-1消融胰腺星状细胞通过Nrf2诱导的shh信号促进胰腺癌生长

抽象

更全面地了解胰腺癌病理生物学的复杂性，尤其是了解肿瘤微环境（TME）在疾病进展中的作用，应该为提高患者反应率的治疗铺平道路。以往的研究报道caveolin-1（Cav-1）具有促肿瘤和抑肿瘤的双重作用。然而，Cav-1在胰腺癌微环境中的作用仍有待进一步研究。在这里，我们证明了Cav-1沉默的胰腺星状细胞（PSCs）与胰腺癌细胞的联合注射增加了肿瘤的生长。为全面了解胰腺癌细胞与胰腺癌旁分泌细胞之间的联系，用含细胞因子的胰腺癌细胞条件培养基（CM）培养胰腺癌旁分泌细胞。我们发现Cav-1沉默的PSCs通过增强旁分泌shh/MMP2/bFGF/IL-6信号促进胰腺癌细胞的生长。特别地，Cav-1沉默的PSCs表现出shh表达的增加，这在胰腺癌细胞中异质性地激活了shh信号通路。此外，Cav-1缺陷的PSCs积累ROS以增强胰腺癌细胞的shh途径和血管生成。此外，Nrf2的过度表达逆转了Cav-1基因敲除对PSCs的影响，增加ROS的产生，增强旁分泌shh/MMP2/bFGF/IL-6信号传导。综上所述，我们的发现表明，基质Cav-1可能通过Nrf2诱导胰腺癌进展过程中shh信号的激活，介导癌细胞与其微环境之间复杂相互作用的不同机制。

1.简介

胰腺导管腺癌（PDAC）是一个顽固的恶性肿瘤的预后较差由于低效的诊断和强耐药性。最近，癌细胞发展和肿瘤微环境（TME）之间的关系受到了更多的关注[1个–三]. 特别是，在PDAC中大量存在的癌间质被报道有助于肿瘤的进展、侵袭、转移和化疗[4个,5个]。

PDAC的特征是存在大量的间充质基质，它占肿瘤体积的90% [6个,7个]。癌相关成纤维细胞(CAFs)对于间质增生的形成至关重要。在人类胰腺癌中，CAFs的主要祖细胞是胰腺星状细胞(PSCs) [八]. 在健康胰腺中，静止的psc具有胞质脂质储存能力，通常以低数量存在于结缔组织中，在结缔组织中它们只分泌低水平的ECM成分[9个]。然而，恶性肿瘤中，静态的PSC被激活，失去它们的细胞质脂质存储容量，并分泌大量的细胞外基质，其最终发展为肿瘤药物渗透的屏障的。此外，活化的PSC产生多种细胞因子和生长因子的，这触发肿瘤细胞和其它基质细胞，诱导肿瘤进展，转移和耐药性[10个,11个]. 因此，活化的PSCs为肿瘤基质的调节治疗提供了一个有吸引力和前景的细胞靶点。

细胞膜穴样内陷的小窝蛋白1-（CAV-1-）在质膜富集亚结构域放开在癌细胞和含有高胆固醇和鞘脂含量[德意志北方银行,13个]. Cav-1被认为与正常组织和癌症中许多生物学过程的调节有关[14个,15个]。一般来说，据报道，Cav-1既具有促肿瘤作用，又具有抑肿瘤作用，根据癌细胞类型的不同，它具有促生存或抗生存作用[16个–18岁]. 尽管以前的研究主要集中在阐明Cav-1在肿瘤细胞中的作用，但最近的研究已经开始强调Cav-1蛋白在肿瘤微环境中的作用[19个,20个]。在与癌症相关的成纤维细胞中，Cav-1是基质硬度的基础，有利于肿瘤的侵袭和转移[19个]，而其他人已经表明其在成纤维细胞相关因素损失与预后不良[21岁,22个]. Cav-1在成纤维细胞和内皮细胞中高表达，通常与胰腺癌发生过程中的基质重塑有关[23个]。在胰腺癌中，成纤维细胞中Cav-1的下调导致肿瘤生长和化疗抵抗增强[23个]. 间质Cav-1表达缺失预示胰腺癌临床预后不良[24个]。

为了研究这个问题，我们使用了Cav-1 shRNA来抑制PSC Cav-1的表达。在PSC条件培养基(CM)培养或共注射PSCs培养Aspc-1细胞的实验中，我们发现cav -1缺失的PSCs加速了胰腺癌细胞的生长在体外和体内通过旁分泌shh信号。此外，Nrf2被发现对PSCs中Cav-1的下调的观察效应负责。因此，我们的数据表明，间质中Cav-1的缺失在胰腺癌进展中起着肿瘤促进剂的作用。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和试剂

以下抗体：抗体抗CAV-1（＃3267），Nrf2的（＃12721），细胞周期蛋白A（＃91500），的Gli-1（＃2643），抗 - 小鼠IgG HRP-连接的第二抗体（＃7076）和抗兔IgG HRP-连接的第二抗体（＃7074）来自Cell Signaling Technology（Danvers的，MA，USA）获得。针对SHH抗体（SC-373779），细胞周期蛋白D1（SC-8396），微管蛋白（SC-166729），和β-肌动蛋白（sc-47778）购自圣克鲁斯生物技术公司（达拉斯，德克萨斯州，美国）。环胺，一种SMO的拮抗剂，购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）和DCF-DA购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。

2.2。动物研究

胰共注射实验通过皮下共注射进行 Aspc-1细胞 大约7周大的BALB/c裸小鼠侧翼的PSCs。每只动物肿瘤体积连续监测1次/周，持续5周，计算公式如下: 。然后，所有的动物处死。有6只小鼠每组英寸所有体内研究由西安交通大学，中国第一附属医院的机构动物伦理委员会批准。

2.3条。细胞系

Aspc-1细胞购自中国科学院细胞库(中国上海)，HUVECs购自ALLCELLS(美国加州Emeryville)。在我们的实验中，只使用了早期传代细胞。从西安交通大学附属第一医院肝胆外科接受肝移植的供体患者分离的正常胰腺组织中提取人PSCs。分离和PSC培养方法如既往研究所述[八,25个,26个]。采用细胞内脂肪滴的形态学检查和油红O染色评价PSCs的纯度α平滑肌肌动蛋白中的PSC表达通过免疫荧光评估（参见补充图。第一节). 本研究中使用的PSCs是从几个病人身上获得的。获得患者家属的书面同意，研究方案和同意书由中国西安交通大学第一附属医院相关伦理委员会批准。

2.4条。慢病毒基因载体

CAV-1和Gli-1的稳定敲低通过慢病毒感染引起的，和靶向的Cav-1 mRNA表达（SC-270391-含有阴性对照shRNA（SC-108080）（SH-CTRL），shRNA的（shCav-1）的慢病毒颗粒V），或shRNA针对的Gli-1（SC-37912-V）购自Santa Cruz Biotechnology公司（美国德克萨斯州达拉斯，USA）获得。在靶细胞中的Cav-1-和Gli-1干扰效率通过Western印迹分析来估计。此外，Nrf2的过表达载体慢病毒激活颗粒（SC-400017）和阴性对照粒子（SC-437282）获自Santa Cruz Biotechnology公司购买。脂质体使用根据制造商的说明来进行转染实验。转染后，用嘌呤霉素选择用于进一步使用稳定转染的细胞。

2.5。条件培养基实验

在含有DMEM的10%FBS中维持PSCs 细胞在6孔板中每孔培养12小时，然后在含1% fbs的DMEM中培养24小时。总共 将这些PSCs的Aspc-1细胞在CM中培养48小时。环巴胺从Sigma中提取，用于抑制shh通路。环巴胺或二甲基亚砜(DMSO) (Sigma)加入CM 48 h。从PeproTech中获得重组shh蛋白，用于PSCs和Aspc-1细胞的hedgehog信号激活。

2.6条。酶联免疫吸附试验（ELISA）

细胞( )在无血清培养基中培养72h，收集培养基，1500rpm离心5min，除去颗粒。收集上清，-80℃冷冻至使用。使用市售的ELISA试剂盒(R&D Systems, MN, USA)根据制造商的建议，测定了PSCs上清液中sonic hedgehog (shh)、基质金属蛋白酶(MMP)2、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白细胞介素6 (IL-6)的分泌。

2.7。肿瘤血管生成

总共 ASPC-1细胞和 在BALB/c裸小鼠侧翼皮下植入PSCs。采用三微米厚的石蜡包埋肿瘤切片，CD31法评价微血管密度(MVD) (1:50 0;sc-1506)免疫组化染色[27个]。将切片用Axioplan蔡司光显微镜（Carl Zeiss公司，剑桥，英国）装配有AxioCam数码相机成像。CD31阳性血管被在每组5至6个样品（5个视野/样品）进行计算。全肿瘤裂解物收集通过免疫印迹以确定CD31蛋白表达[28个,29个]。

2.8。HUVEC小管形成分析

体外血管生成实验按照之前描述的方法进行[30个–32个]。在一个24孔板上的井被涂上了200层μ每个基质L。总共 每孔将HUVEC接种到涂覆的板用200 μ所指示的CM的L的图注中描述，并在37℃下在5％CO培养_2个for 24 h. Calcein-AM (0.2 μM) was used to stain viable HUVECs at 37°C for 10 min. Capillary tube numbers were assessed by calculating the total tube length of each image at 100x magnification using a fluorescence microscope. Three different fields per well were randomly chosen and photographed. The total length of the capillary tubes within each field was calculated after calibration using a stage micrometer, and the analysis of the data was performed by GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, CA, USA).

2.9。[^三H]胸苷掺入法

细胞被放置在24孔板中，密度为 细胞每孔。DNA synthesis was determined by incubating asynchronously growing cells with 0.5 mCi/mL of [^三H]胸苷(Perkin-Elmer) 18小时[33个]。ASPC-1细胞的生长通过MTT测定在0，24，48，和72小时接种后测定[21岁]。

2.10条。蛋白印迹

肿瘤组织样本及细胞( )每组接受超声处理和裂解。收集总蛋白，100 μ将每种蛋白裂解液的g在10%的聚丙烯酰胺- sds凝胶上进行还原凝胶电泳，转移到PVDF膜上，然后按照前面描述的方法进行免疫印迹分析[29个]。Primary antibodies diluted at 1 : 1000 in 1× TBS-T were used overnight at 4°C under agitation. HRP-conjugated secondary antibodies diluted at 1 : 2000 in 1× TBS-T and supplemented with 5% nonfat milk (LabScientific, Highlands, NJ) were used at room temperature for 2 h prior to development using a Clarity Western ECL substrate (Bio-Rad). Then, the blots were developed using a Millipore ECL substrate. An enhanced chemiluminescence detection system was applied to image the immunoreactive bands.

2.11条。谷胱甘肽（GSH）含量的测定

在PSC中测定谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫(GSSG)水平( )采用谷胱甘肽还原酶法提取[34个,35岁]. 这种分析是基于谷胱甘肽和硫醇的反应，它能转化5，5 -二硫代 - 双 - （2-硝基苯甲酸）（DTNB）至5-硫基-2-硝基苯甲酸（TNB），其可以在被检测 。该测试是特定于GSH由于GSH还原酶的特异性GSH：TNB积累的速率正比于GSH的样品中的浓度。Briefly, cell extract was diluted at 1 : 2 with KPE buffer (0.1 M potassium phosphate, 5 mM disodium EDTA, pH 7.5) prior to the addition of freshly prepared DTNB (2.5 mM) and GSH reductase (250 U/mL) solutions. Following the addition ofβ-NADPH，吸光度（ )每隔30秒立即测量一次，持续2分钟。将吸光度的变化率与GSH标准进行比较。除了2-VP预处理的样品与GSH反应外，用于测量每个样品中GSSG的协议与用于测量GSH的协议几乎相同。

2.12条。侵入试验

侵入测定法在24孔跨孔8进行 μm聚酯膜插件（Millipore，Billerica，MA，USA）。膜的上表面涂有基质凝胶（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）。所示组的Aspc-1细胞在 在24孔板和600 中，每个跨孔插入一个无FBS DMEM的电池μ完全培养基的L的添加至下室。After incubation for 24 h, noninvaded cells on the top side of the filter membrane were removed by scraping with a cotton swab. Next, 4% paraformaldehyde was applied to fix the membrane, and crystal violet was used to stain the invaded cells. The invaded cells were counted and photographed under a light microscope. The average number of cells invaded per group was statistically analyzed.

2.13。统计分析

数据表示为 从至少三个独立的实验。使用GraphPad软件进行统计分析。具体的分析方法在图注中详述。统计显着性设为 。

3.结果

3.1。胰腺癌星状细胞的Cav-1消融促进了胰腺癌细胞的生长在活的有机体内

为了确定在省电类别不存在的Cav-1是否会影响ASPC-1细胞生长，ASPC-1 +的PSC（有或没有的Cav-1敲低）皮下注射到BALB的侧腹/ c裸鼠。对CAV-1的干扰效率，α检测-SMA蛋白的表达情况，如图所示1（甲）。5周后，与Aspc-1+正常PSC (sh-Ctrl)组相比，Aspc-1+Cav-1敲除PSC (sh-Cav-1)组生长速度提高(约1.8倍)(见图)1（b）和1（c）)。此外，在MVD相比SH-CTRL-组肿瘤SH-CAV-1组的肿瘤增加，如使用CD31免疫组织化学染色分析（图确定图1（f）和1 (g)). 同时，western blot分析显示，sh-Cav-1组肿瘤中CD31蛋白的表达明显高于sh-Ctrl组肿瘤（图1（d）和1（e）中)。综上所述，这些发现表明cav -1敲除PSCs促进Aspc-1细胞的生长与其MVD相关。

3.2。cav -1缺陷的胰腺癌星状细胞显示出原细胞源性细胞因子的增加

为了评估Cav-1表达是否介导了PSCs中可溶性因子的分泌，我们测定了正常PSCs (sh-Ctrl)和Cav-1敲除PSCs (sh-Cav-1)中CM中某些细胞因子的水平。来自sh-Cav-1 PSCs的CM表现为shh、MMP2、bFGF和IL-6水平的上调，在胰腺癌进展过程中发挥增殖、侵袭、血管生成和炎症功能(图)图2（a）)。如图所示图2（b）和图2（c），CAV-1敲低的PSC的裂解物（SH-CAV-1）显示比SH-CTRL的PSC的更高Shh蛋白质表达。更多over, Aspc-1 cells cultured with CM from Cav-1-knockdown PSCs (sh-Cav-1) for 48 h exhibited enhanced cell invasion, growth/proliferation, and activation of shh signaling, as indicated by enhanced cyclin A/D1 and Gli-1 protein expression (a transcription gene in shh signaling) and by increased MTT and [^三H]胸腺嘧啶核苷掺入(数字2 (d)–2 (g)). 因此，我们的数据表明，Cav-1缺陷的PSCs分泌细胞因子，促进胰腺癌的增殖、侵袭和血管生成。

3.3。在胰腺癌细胞中Shh信号的抑制反转的Cav-1缺失的PSC的Proproliferative / Protumorigenic影响

shh信号的异常激活在几种癌症类型中都有表现，包括胰腺癌[36个]。为了评估药物抑制胰腺癌细胞shh信号是否能逆转cav -1敲低PSCs中CM对Aspc-1增殖的影响，[^三H] 用Cav-1基因敲除后的PSCs细胞培养48小时，在含有或不含shh信号特异性抑制剂环胺的情况下，对胰腺癌细胞进行胸腺嘧啶核苷掺入试验。我们的数据显示，5-10 mM环胺能有效抑制Cav-1基因敲除的PSCs的CM对Aspc-1细胞增殖的影响。有趣的是，用环胺转染sh-Ctrl的PSCs在CM中培养的Aspc-1细胞的增殖保持不变（图3(一个))。确定在Aspc-1胰腺癌细胞中shh信号的抑制是否会破坏cav -1敲低PSCs的致瘤作用体内中，的Gli-1基因稳定地通过慢病毒shRNA转沉默。GLI-1的表达被完全击倒没有外源刺激SHH，和降低的Gli-1的表达水平在外源Shh的存在来实现（图3 (b)和3 (c))。表明，在ASPC-1细胞的Gli-1干扰足以逆转的Cav-1敲低的PSC的protumorigenic性质的PSC和ASPC-1细胞的共注射（图3 (d))。这些数据表明，Shh信号是用于枢转的Cav-1缺失的PSC诱导ASPC-1胰腺癌细胞增殖和肿瘤生长。

3.4。活性氧是观察到的cav -1缺陷PSCs对胰腺癌shh信号和血管生成的影响

由于ROS参与了胰腺癌细胞和PSCs之间的相互作用[32个]，我们检查是否ROS在胰腺癌Shh信号的Cav-1敲低的PSC中所观察到的影响发挥了重要作用。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是适用于降低ROS在两者的PSC和ASPC-1细胞。CAV-1敲低的PSC显著表现出与增加相比ROS产生在控制（SH-CTRL-转染）的PSC（图4(一))。此外，NAC废除CM的从CAV-1敲除的PSC（以增加的Gli-1的表达在ASPC-1细胞图的能力4 (b))。此外，NAC还降低了cav -1敲除PSCs后CM对Aspc-1细胞的促血管生成作用(图)4 (c)和4 (d)). 然而，当Gli-1在Aspc-1细胞中被敲除时，NAC-和Cav-1缺陷的PSCs不能抑制HUVEC管的形成（图4 (c)和4 (d))。这些数据表明，ROS在观察到的cav -1缺陷PSCs对胰腺癌shh信号和血管生成的影响中发挥了关键作用。胰腺癌细胞shh信号介导cav -1缺陷psc诱导的血管生成。

3.5。Nrf2调节PSCs中Cav-1缺失诱导的ROS生成和shh/MMP2/bFGF/IL-6分泌

Nrf2在细胞对氧化应激反应中起关键作用[37个,38个]。我们研究Nrf2的表达和GSH和GSSG产品分成合同中的表达。我们的数据表明，CAV-1干扰诱导Nrf2的中和GSH表达的显着降低，而不会影响GSSG表达（图5(一个)和图5（b）). Nrf2过表达抑制了由Cav-1干扰引起的shh蛋白表达的增加（图图5（c）–5（e）)。此外，Nrf2的过表达逆转对PSC ROS产生的Cav-1敲低（效果图5（华氏度）)。有趣的是，在cav -1缺陷的PSCs中，shh/MMP2/bFGF/IL-6的诱导分泌可以通过Nrf2过表达逆转(图)6个)。这些数据表明，Nrf2的是CAV-1敲低诱导的ROS产生和Shh / MMP2 / bFGF的/ IL-6分泌的PSC中的关键调节剂。

4。讨论

在我们的研究中，我们展示的Cav-1基因的破坏加速ASPC-1胰腺癌细胞在小鼠体内的生长和促进ASPC-1细胞的侵袭。我们的数据表明的Cav-1缺乏症的PSC是通过上调旁分泌细胞因子信号利于主胰腺癌的生长（包括SHH / MMP2 / bFGF的/ IL-6）和ROS发挥的PSC和胰腺癌细胞之间的相互作用至关重要的作用。此外，Nrf2的是CAV-1敲低诱导的ROS产生和Shh / MMP2 / bFGF的/ IL-6分泌的PSC中的关键调节剂。

尽管近来许多肿瘤细胞中Cav-1的功能已被阐明[39个–41]，基质的Cav-1在胰腺癌症进展遗体的作用少很好的研究。在这里，我们揭示了共注射ASPC-1细胞和CAV-1沉默的PSC看出，肿瘤的生长，似乎在他们的微血管密度差异得到很好的关联。我们的结果与以往的研究证实没有CAV-1之间的直接的正相关协议，并增加体内微血管密度[21岁,42,43]。省电类别的CAF的主要祖细胞。激活的PSC产生多种细胞因子和生长因子，发挥重要的生物学功能的，以保持胰腺癌进展[44]。

在此基础上，我们认为，在物业服务公司缺乏的Cav-1将加快胰腺癌细胞通过旁分泌信号生长。为了检验这一假设，胰腺癌细胞与CM从产品分成合同培养。有趣的是，CM培养测定表明，缺乏的Cav-1可能归因于增加的旁分泌信号的PSC的生长促进性能。所确定ELISA，SHH，MMP2，bFGF和IL-6分泌的Cav-1缺失的PSC，这进一步证实了他们的protumorigenic表型显著增加。此外，这些数据与其它研究，证明了类似的因素的相关性与微环境重塑肿瘤[一致21岁,45]。这项研究的一个关键发现是，Shh蛋白质的可溶形式在CAV-1缺失的PSC的CM被上调。除了打在胚胎发育中的重要作用，Shh信号密切参与调解胰腺癌生长，侵袭和转移[26个,46,47]。此外，越来越多的证据表明shh可能以旁分泌的方式诱导肿瘤生长[47,48]。我们的数据显示，来自cav -1敲除PSCs的CM增加了胰腺癌细胞的DNA合成并上调了gli1的表达。这些结果表明，缺乏Cav-1会放大shh异型信号。因此，通过使用环巴胺抑制shh信号和干扰Aspc-1细胞中的gli1, cav -1缺陷PSCs的促肿瘤生长特征被逆转。

ROS参与胰腺癌EMT和侵袭[26个]。在这里，我们发现与正常的PSCs相比，cav -1缺失的PSCs明显增加了ROS的产生。抑制cav -1敲除PSCs中ROS的产生抑制了Aspc-1细胞中胶质细胞-1表达的增加。此外，在胰腺癌血管生成方面也观察到类似的效果。当gli1在Aspc-1细胞中被沉默时，NAC和cav -1缺失的PSCs不能抑制HUVEC管的形成。这些数据表明，缺乏cav -1的PSCs可诱导更多ROS以旁分泌方式激活胰腺癌细胞shh信号，从而促进肿瘤生长、侵袭和血管生成。

以前的研究表明，Nrf2的是一个关键的氧化还原传感器和抗氧化反应的主调节器中的一个[37个,49]. Nrf2结合调节性抗氧化反应元件并激活许多对抗ROS的抗氧化基因的转录[50]. 在本研究中，我们证明在PSCs中Cav-1缺乏显著地诱导Nrf2和GSH表达显著减少，而不影响GSSG表达。这些结果表明，沉默Cav-1通过下调Nrf2的表达增强PSC的氧化应激。Nrf2的过度表达逆转了Cav-1基因敲除对PSC活性氧产生和shh/MMP2/bFGF/IL-6分泌的影响。这些发现表明Nrf2在Cav-1基因敲除的PSCs对胰腺癌进展的影响中起着重要作用。

总之，我们揭示的Cav-1的消融在产品分成合同促进生长，侵袭和胰腺癌的血管生成。机械地，该特征可以归因于提高的ROS产生和旁分泌细胞因子信号传导（SHH / MMP2 / bFGF的/ IL-6）在CAV-1缺失的PSC。Nrf2的是在CAV-1敲低诱导的ROS产生和Shh / MMP2 / bFGF的/ IL-6分泌的PSC中的关键介导物。因此，我们的研究结果添加新的证据，必须重视对癌症细胞及其有效的抗肿瘤治疗发展的微环境之间复杂的相互作用。

数据可用性

本研究中产生的所有数据均包含在本文中。

利益冲突

作者宣称，他们没有竞争的利益。

作者的贡献

SS、LJ、LX、WE、WZ、MQ构思设计实验；SS、QT、QW、HL、LW、ZD进行实验；SS、LJ、QT、QW、MQ分析数据；WZ、LJ、QW、MQ提供试剂/材料/分析工具/饲养动物；SS、LJ撰写手稿。所有作者都审阅并批准了手稿的最终版本。

致谢

国家自然科学基金（编号81502066、81702908）、陕西省自然科学基金（2019JM-115、2018JQ8030）、中央大学基础研究基金（xzy012019090、xjj2018117）资助。

补充材料

图S1从接受肝移植患者的正常胰腺中分离出PSCs。油红O染色鉴定PSCs。B、 C和Dα-免疫荧光显微镜检测PSCs中SMA的表达。(补充材料)

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