心血管危险因素对AMPK的调控累积效应/ SIRT1-PGC-1α-SIRT3通路在人类勃起组织中

摘要

心血管疾病的危险因素（CVDRF），尤其是糖尿病（DM），破坏氧化应激反应。这种情况underlies内皮功能障碍，男性勃起功能障碍的早期表现。目前的研究的目的是在氧化反应AMPK / SIRT1-PGC-1阐明CVDRF的影响α-SIRT3途径在人阴茎海绵体相关的miRNA。人类阴茎组织碎片从提交到编程泌尿外科手术的个体（ ),年龄43-63岁，根据CVDRF的存在而聚集;对照组包括来自无CVDRF患者的样本，A组和B组包括来自DM患者和额外CVDRF患者的样本，总计≤2 CVDRF (A组)和≥3 CVDRF (B组)α-肌动蛋白在组织切片进行。NOX1、phospho-AMPK的表达水平评估α，总AMPKαSIRT1, PGC-1αwestern blotting检测SIRT3、SOD2和GPX1，实时PCR检测miR-200a、miR-34a、miR-421和miR-206。磷酸化AMPKα并且发现SIRT3表达在乙相对组显著增加至其它基团，这表明CVDRF的显着的影响，附加到DM，在这些酶的调节。NOX1也相对于对照组乙增加。在磷酸化AMPK只观察到上升趋势α/总AMPKα比值，SIRT1，和PGC-1α与对照组比较，A组和B组的表达。抗氧化酶方面，A组GPX1表达增加，而A、B组SOD2表达减少，与对照组比较。B组miR-421和miR-200a表达水平显著降低，但仅miR-34和miR-206表达呈下降趋势。综上所述，我们的研究结果表明，除了DM外，额外的CVDRF在细胞对氧化失衡的反应中呈现累积效应，有助于AMPK/SIRT1-PGC-1α-SIRT3通路的激活。SOD2，一个重要的线粒体抗氧化防御，并没有遵循相同的变化。

1.简介

活性氧(ROS)是由细胞内的多种反应产生的。虽然在生理浓度下，ROS可能具有保护作用或功能性，如在先天免疫应答中，但在不平衡浓度下，一种称为氧化应激的情况下，ROS可引起细胞毒性和损伤[1，2]。因此，ROS水平的增加不仅会导致衰老表型，还会导致心血管、神经系统和代谢性疾病和癌症[2-五]。

被大量形成在线粒体ROS，和家庭NADPH氧化酶（NOX）的酶被鉴定为它们的形成中是重要的贡献者[五，6]。这个家族包括5个NOX(1-5)和2个双重氧化酶蛋白(DUOX 1-2)亚型，它们具有功能性和组织特异性[3，7]。NOX1，在血管平滑肌组织和内皮细胞中表达，是显然的重要靶点动脉粥样硬化考虑到其抑制显著降低ROS产生和血管病变[糖尿病相关的8]。

相对的ROS形成，解毒酶，以及解偶联蛋白的必需途径进行干预，以减轻氧化应激9]。一种这样的酶，线粒体超氧化物歧化酶-2（SOD2），催化转化超氧成H₂Ø₂其随后被还原成无害的产品通过酶，如谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1），谷胱甘肽过氧化物酶家族的一个成员，位于胞质溶胶，线粒体，或甚至过氧化物酶体[10，11]。事实上，研究发现抗氧化酶的调节对ROS的保护至关重要。

作为线粒体生物发生和功能，AMP活化的蛋白激酶（AMPK）/沉默调节蛋白（SIRT）1-过氧化物酶体增殖物激活受体的上游调节γ（PPARγ)coactivator-1α- （PGC-1α- ）SIRT3途径一直被认为是氧化应激的缓解的一个重要介入。其激活依赖于细胞的代谢状态。AMPK，一个催化组成的异源三聚α——和监管β- - -γ-亚单位，是一种响应AMP:ATP比率增加、代谢应激条件(运动、葡萄糖剥夺和缺氧)、暴露于某些激素和药物(如二甲双胍)的营养传感器[12，13]。这种胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的激活，通过增加转录因子PGC-1的表达和激活，导致下游元素的直接磷酸化和靶基因表达的调控α[14，15]。有趣的是，SIRT1是酵母Sir2的哺乳动物同源基因，属于7个NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶家族，通过PGC-1调节能量代谢α活化16]。PGC-1α通过特定的调控因子，如雌激素相关受体(ERRs)、PPARs或核呼吸因子(NRFs)，调节参与能量稳态和线粒体生物发生的基因表达[17]。此外，香港等。证明，PGC-1α-ERRs途径调节SIRT3表达和SIRT3本身刺激PGC-1α，完成正反馈循环[18]。SIRT3是参与能量稳态，线粒体生物发生，和氧化应激控制线粒体基质的酶。多SIRT3目标已经确定，如乙酰辅酶A合成酶2，谷氨酸脱氢酶，KU70，叉头转录因子的FOXO3a和抗氧化酶[19，20.]。以前的研究表明，ROS产生上调SIRT3穿过赖氨酸122 [脱乙酰进一步活化SOD221-23]。此外，SIRT3报道脱乙酰基化的FOXO3a和刺激靶基因的表达：SOD2和GPX1 [19，20.]。SIRT3确实在PGC-1的下游通路中发挥了重要作用α的，其功能受损导致细胞内的有毒环境，增效老化特征和多种疾病。事实上，在1型和2型糖尿病（DM）的小鼠模型的肌肉中观察到SIRT3低水平的[24，25]，这与在糖尿病前期大鼠睾丸中发现的PGC-1均下降的数据一致α和SIRT3水平[26]。此外，Freitas等人发现患有代谢综合征的老年人体内SIRT3水平降低，支持了代谢障碍导致ROS水平失衡与抗氧化防御功能失败相关的观点[27]。

糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、高血压和肥胖是心血管疾病的危险因素（CVDRF），聚集在代谢综合征中，长期以来被认为与线粒体失调、ROS失衡和内皮功能障碍有关[28]. 内皮功能障碍，尽管是一种无症状的情况，促进动脉粥样硬化斑块的形成和血管功能不全，进展到心血管疾病。男性内皮功能障碍的早期表现是勃起功能障碍（ED）[29]，表示CC作为一个适当的组织以研究心血管疾病相关的分子修饰。

因此，我们假设AMPK/SIRT1-PGC-1α在CVDRF个体中，-SIRT3通路可能受到破坏，其修饰可能在CC中被早期检测到。我们还认为，不仅该通路的元件，而且microRNAs (miRNAs)，即抑制靶mrna表达的小非编码rna，也会随着疾病改变其表达和活性。与AMPK/SIRT1-PGC-1调控相关的不同miRNAs的表达α-SIRT3通路已经在老年或糖尿病啮齿动物模型的CC和非糖尿病患者的CC和血清中发现[30.-33]。的SIRT1-PGC-1α途径被报告给受miR-34a和-200a [被负调节33-35]和miR-421介导的SIRT3-FOXO3通路[36]而miR-200a和miR-206在勃起功能障碍（ED）中的表达增加[31]。

在这里，我们的目的是在AMPK / SIRT1-PGC-1研究CVDRF的影响α-SIRT3途径和miRNAs的表达可能参与了其在人CC中的调节。为此，我们使用从具有不同水平CVDRF的个体和健康个体中采集的样本，来阐明是否存在累积效应。

2.材料和方法

2.1。人类阴茎组织收集与处理

从器官供体器官收获时或得到阴茎CC的样品用于移植程序，可选地，从提交给编程为手术矫正阴茎的阴茎假体的偏差或植入患者[37]知情同意后。患者的年龄由43到63岁之间。

根据在Framingham心脏研究中发现的CVDRF在患者中的存在情况，阴茎碎片被分为3组[38]如糖尿病、血脂异常、高胆固醇血症、高血压、肥胖等。对照组包括未患ED或CVDRF的老年人 年( )。A组和B组包括从糖尿病患者中收集的片段；A组患者可以在最多两个CVDRF上出现额外的CVDRF( 年)( ),而那些包含在B组呈现两个或更多个CVDRF除了DM（ 年)( )。

简言之，将来自每个患者组织片段切除并在分成两个部分;在-80℃下用于分子分析之一是立即冷冻，另一个固定在10％缓冲的甲醛溶液和包埋在石蜡中进行免疫荧光分析。

2.2。免疫荧光

五μ所选样品的米厚的切片在切片机切割（RM 2145，莱卡微系统有限公司，韦茨拉尔，德国）在二甲苯中脱石蜡，并在一系列乙醇水溶液随浓度（100％，90％，和70％水合 ）followed by water and then submitted to the epitope retrieval in 1 M HCl solution, followed by neutralization with 0.1 M borax solution. Afterwards, sections were incubated with blocking solution (1% 牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育1小时，在4°C的湿度室中孵育一晚，用在阻断液中稀释的初级抗体混合物:小鼠抗-α肌动蛋白（Millipore公司，Billerica的，MA，USA，1/400稀释），用兔抗SIRT3（Cell Signaling Technology公司生产，Danvers，MA，USA，1/200稀释），抗SOD2（圣克鲁斯生物技术公司合并，帕索罗布，CA，USA，1/250稀释），或抗GPX1（Abcam公司，英国剑桥，1/600稀释）。一个fter washing, the tissue sections were incubated for 1 h in a humidity chamber with the secondary antibodies anti-mouse conjugated with Alexa Fluor A568 (red) and anti-rabbit conjugated with Alexa Fluor A488 (green) (Molecular Probes, Leiden, Netherlands) both diluted 1/1000 in PBS-0.1% Triton X-100. Sections were mounted in glycerol 50% 在PBS后与核染色4 -6'-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（分子探针）。最后，在一个ApoTome荧光显微镜（成像器Z1，卡尔蔡司显微成像有限公司，德国哥廷根）观察截面，并与AxionVision®软件（卡尔蔡司显微成像GmbH）中分别获取的图像。选择各组的代表图像。排除非特异性抗体的反应性或自体荧光，进行无一次或二次抗体分别制备阴性对照。

2.3。西方墨点法

Each penile sample was homogenized in lysis buffer (50 mM Tris pH 7.2, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% ( ）Triton X-100和1毫米β甘油磷酸盐），补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（西格玛奥德里奇公司，多塞特，英国，稀释为0.5％ 和0.2％ ，分别)。通过Bradford [方法总蛋白定量后39]，20平方米μ在Laemmli不连续缓冲系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，EUA）中，在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，以30毫安的恒定电流，在大约90 分钟内，通过电泳分离每个样品中的g蛋白质[40]。

然后，将蛋白转移到孔隙为0.45的硝化纤维素膜上μm (Bio-Rad实验室)在30v恒压下工作90min。在ChemiDoc TM XRS (Bio-Rad Laboratories, Inc.)中捕捉到膜上Ponceau s标记蛋白条带的图像。然后清洗膜，用0.1%的封闭溶液(Tris-buffer saline, TBS)孵育 吐温-20和5% BSA) for 30 min, and then incubated for 48 h with primary rabbit antibodies diluted as indicated: anti-NOX1 1/500 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-phospho-AMPKα1/1000 (Cell Signaling Technology)，抗ampkα1/1000（Cell Signaling Technology公司），抗SIRT1 1/700（ProteinTech，芝加哥，IL，USA），抗PGC-1α1/500 (Abcam)、anti-SIRT3 1/500 (Cell Signaling technology)、anti-SOD2 1/1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)和anti-GPX1 1/1250 (Abcam)。

Lastly, several washes and incubation with appropriated secondary antibody coupled to horseradish peroxidase for 1 h were carried out. Labelled bands were detected using chemiluminescent peroxidase substrate (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA), and intensity was quantified with The Image Lab® software (Bio-Rad Laboratories); normalization of protein expression levels was accomplished using Ponceau S staining in the respective lane. The membranes incubated with the anti-phospho-AMPKα进一步用兔抗ampk抗体孵育α后，膜用10％剥离 SDS 30分钟。在每个阴茎样品中，磷酸化蛋白条带的强度用相应的总蛋白条带归一化。一个 每组实验至少重复三次。

2.4。实时聚合酶链反应(PCR)定量检测MicroRNA

三15 μ每张石蜡包埋组织m厚片， 使用Leica Microsystems GmbH公司生产的microtome切片机，按照Liu和Xu描述的方法，使用美国得克萨斯州Ambion市的商用RecoverALL总核酸分离试剂盒提取总RNA。41]。简单来说，切片用二甲苯脱蜡，然后用100%乙醇清洗。然后，用蛋白酶溶液在50℃孵育2小时，在75℃孵育15分钟。提取总RNA，酶解DNA，纯化RNA提取物。

该微RNA MystiCqTM cDNA合成混合物（Sigma-Aldrich公司公司）用于RNA转变成cDNA。该方法包括两个步骤;在第一个，7:3的混合 μRNA样本的L, 2μ大号的poly（A）加尾缓冲液（5X），和1个 μ多聚（A）聚合酶的L的用于腺苷的脱氧核苷酸的转移催化的3 -结束所有的RNA，包括miRNA的。在第二个，10 μL poly(A) tail buffer (5X)和1μl向后酶（RT）加入到用于RNA的转化微RNA的cDNA反应混合物成cDNA与在5通过通用引物识别的独特序列的掺入 -每条DNA链的末端。通过real-time PCR反应扩增cDNAs需要1μ从每个样品，0.25升的cDNA的 μ大号通用引物，1.2 μ特异性引物L, 6μ的上电™SYBRTM绿色主混合物（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，EUA）和3.55 L的 μ升无核酸酶水。特异性引物（RNX）为的miR-200a中，的miR-34a的，的miR-421和miR-206（Qiagen公司，德国希尔登）中使用。两个对照反应进行，一个排除的聚（A）聚合酶和其它排除RT。Reactions were prepared in duplicate in 96-well thin-wall PCR plates and took place in a StepOnePlus™ Real-Time PCR system (Life Technologies, CA, USA), with amplification conditions starting with 95°C for 10 min, followed by 45 cycles of 95°C for 15 s, 55°C for 30 s, and 60°C for 30 s. Finally, the data from each amplification reaction was normalized with the internal control RNU1A, using the RNU1A primer assay (Qiagen) and the formula 2^{(CT RNU1A-CT RNx)}。

2.5。统计分析

结果表示为 (SEM)。采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，采用GraphPad Prism 7 (version 7.05)进行Tukey’s多重比较检验。一个值< 0.05为差异有统计学意义。使用路由器测试(GraphPad Software, Inc.)，将Q值设置为1.0%，识别并去除异常值。

三。结果

3.1。对SIRT3、SOD2和GPX1进行双免疫标记α肌动蛋白

双免疫标记进行检测SIRT3，SOD2，或GPX1（绿色）的表达并结合α肌动蛋白(红色)，梭状平滑肌细胞的特殊标记(图)1)。而SIRT3和SOD2呈现兼容的虚线标记与他们的线粒体定位（图1（一个）-1(f))，在点中检测到GPX1，并在细胞质中扩散(图)1（G）-1(我))。细胞核用DAPI(蓝色)染色。

SIRT3和α-肌动蛋白共表达（黄色）很少在所有组的组织中检测到（图1（一个）-1（C）），但SIRT3的增加的标记B组中观察到（图1(c))。有趣的是，我们的数据证明，对照组平滑肌中SOD2的标记更高(黄色)(图)1(d))。在DM患者组(A组和B组)中，SOD2和之间很少有共域化α-肌动蛋白被观察到（图1(e)和1(f)，放大区域ii)，但在非肌肉细胞(如成纤维细胞或内皮细胞)中发现了与SOD2表达相对应的绿色标记(图2)1(e)和1（f）所示，放大的区域i）。关于GPX1和α-在所有组中检测到肌动蛋白，共表达（黄色）（图1（G）-1(我))。

3.2。对NOX1, AMPK进行Western Blotting分析αSIRT1, PGC-1α、SIRT3、SOD2和GPX1α

说明暴露于CVDRF是否解除了AMPKα/SIRT1-PGC-1型α-SIRT3途径中，介入蛋白质的表达水平通过Western印迹半定量。Bands with the expected molecular weight were identified for each studied protein: NOX1 65-68 kDa, AMPKα62kda, SIRT1 140 kDa, PGC-1α105 kDa, SIRT3 28 kDa, SOD2 25 kDa, GPX1 22 kDa。每组选择具有代表性的blots和相应的Ponceau S染色如图所示2（甲）。每种蛋白质的表达的定量在对应的图形（图中示出2（b）-2 (j))。

NOX1水平属于B组的个体的CC样品中相对增大，具有显著增量对照（ ）和基团A（ )。然而，没有发现差异A组和对照（间 )。

关于AMPKα表达，无论是磷酸化的和总的形式进行了半定量。在磷酸AMPK一个显著上升α，但不是总AMPKα在相对于对照群B被发现（ ）和基团A（ )。然而，磷酸化AMPKα/总AMPKα比仅呈现在B组比较与其他增加的趋势（B组与A组 ，或控制， )。而SIRT1的表达在对照组和A等同物（ ),与对照组相比，B组( ）和基团A（ )。

另外，在3倍增量PGC-1α与对照组相比，在CVDRF组中观察到，但由于组内个体间的差异，他们之间没有发现统计差异(对照组与A组( ）或B组（ ))。SIRT3代替表达时与对照组相比被显著B组，增加（ ）和基团A（ )。SIRT3的表达在A组和对照组之间没有差异( )。与对照组相比，CVDRF组GPX1表达增加，但仅在对照组和A组之间有显著差异( ）是达到了。有趣的是，SOD2在A组( ）和B组（ ）与对照组比较。

3.3。Real-Time PCR定量miR-421、miR-34a、miR-200a、miR-206

通过real-time PCR定量检测人类阴茎片段的miRNA水平(图)3)。而与对照组相比，miR-421在B组中显著下降( ),对照组与A组比较无显著性差异( ）或基团A和B（0.771）。此外，的miR-34a的水平显示在CVDRF患者组下降趋势有差异无统计学意义管制比较;概率 -测试的 miR-200a real-time PCR定量显示A组和B组明显低于对照组( 和 ，分别)。与此同时，在CVDRF患者组中，miR-206水平趋于下降，但没有统计学意义(对照组与A组相比)。 ）或B组（ ))。

4。讨论

DM诱导显着的氧化修饰在细胞中，其在延伸可以是等同于那些由其它两种CVDRF（吸烟，高血压，血脂异常和肥胖）的组合诱导的[42]。关联到DM的危险因素只有在心血管疾病的额外负担氧化25％的解释[42]。因此，在本研究中，首先根据DM在患者中的存在，然后根据额外的CVDRF的数量来选择样本，以确定DM的相对负担和氧化损伤反应中的额外危险因素。

高血糖状态的促氧化作用与NADPH氧化酶活性增加有关[43]，这与我们的数据一致时，考虑到在B组NOX1表达显著增量，比较对照（ ),被发现。B组个体呈现的额外DM危险因素显然对NOX1的上调有相关贡献，因为相对于a组，这些患者也呈现更高水平的NOX1 ( )。

与以往的研究相比[24-27，我们发现在CVDRF存在的情况下，SIRT3表达增加，考虑到暴露于相对于对照组更多的代谢危险因素的患者中观察到的3.6倍的增加( )。这是一个意外的发现，考虑到这种酶，但没有相应的mRNA的水平的衰减，在老年患者的CC与代谢综合征发现健康同行[对比27]。我们可以推测，中年人，那些包含在当前的研究中，目前的细胞机制能够缓解SIRT3退化，可能是由线粒体功能保存[44]。这部分可以拥有高水平的褪黑激素的可用性，松果体激素赋予线粒体和显着衰减沿老化强的抗氧化保护[45]。SIRT3蛋白的水平也依赖于各自mRNA的沉默/降解机制，miRNA-421对此有重要贡献。Cheng等报道miRNA-421通过抑制其翻译和FOXO3磷酸化来负调控SIRT3 [36]。B组观察到的较高水平的SIRT3与该组miRNA-421的低水平一致。总之，我们可以认为，在患有多种CVDRF的中年患者中，与对照组相比，SIRT3水平较高，这构成了一种对抗氧化损伤的代偿机制，在老年患者中可能会失效[27]。

SIRT3的过表达已被证明可以增加SOD2的水平和活性，通过FOXO3的激活和随后的基因表达或SOD2的直接去乙酰化来战胜ros介导的损伤[19，21-23]。有趣的是，SOD2被发现在两组患者与CVDRF减少相对管制。考虑到在B组的个体SIRT3的增量和在的miR-421中观察到一个相应递减，我们可以预期，SIRT3 / FOXO3信号通路将被激活，这将导致FOXO3磷酸化和增加的表达SOD2 [36]。考虑到本研究只测定了SIRT3的表达，而没有测定其活性，我们不能排除SOD2的下调可能与SIRT3的活性有严格的关系。为了支持这一假设，还需要进行更多的研究来评估SIRT3的活性。

患者CVDRF的SOD2下调一部分与陈等人的研究结果一致。该报道SOD2的糖尿病小鼠的主动脉显著下跌[46]。在相同的研究，但是，SOD2的保存表达的转基因小鼠过表达SIRT1发现。SIRT1和SOD2之间的串扰尚未确定，尽管有一些研究报告通过FOXO家族（FOXO1和3a）它们之间的关系。其实，张某等人。考虑到SIRT1 / FOXO / SOD2途径的打击ROS生产过剩的主要防御机制[47]。我们的数据没有显示各组间SIRT1表达的差异。与对照组相比，B组仅出现了几乎达到统计学显著性的增长趋势( )。这一发现与之前的研究相反，之前的研究证明，在肥胖和糖尿病等代谢性疾病以及老年动物中，SIRT1的表达会被构成性地抑制，而在饥饿状态下会上调[48-50]。然而，与老年未表现出几个年龄的健康个体差异的CC先前的研究线和年龄与代谢综合征27]。

的意图阐明参与SIRT1的表达的调节机制，两种miRNA进行了研究：的miR-34a和的miR-200a中。事实上，的miR-34A-5P被发现直接针对SIRT1基因破坏其途径[34，35]。此外，的miR-34a的被认定为最上调的miRNA肥胖状况[34]。在我们的研究中，我们观察到对照组和B组之间的miR-34a水平下降趋势为下降54%，几乎达到统计学显著水平( )。这与SIRT1的增加趋势发现相关因素在B组的另外支持发现这个结果的miR-200A的显著下调也针对SIRT1基因，在患者CVDRF发现，B组潘和他的同事报道，相反，在与一个递减的SIRT1 [相关的年龄相关的勃起功能障碍大鼠的CC一个的miR-200A上调33]。但是，随着老龄化差异可能为SIRT3观察所预期的，因为衰老是多因素的过程，导致了扰乱组织，器官和生物体的功能缺陷逐步积累。对于CC，老化被证明是一个最显著的危险因素ED [51]。

此外，我们研究了与ED高度相关的miRNA miR-206，在B组患者中发现其下降趋势;但仍未建立统计学差异。尽管如此,尽管等效变化观察mir - 200 - a和mir - 206,我们的发现从白等人不同意数据和GamalEl等人报道的upregulation mir - 200 a和mir - 206 CC的老鼠和与肥胖相关的ED患者nonmetabolic venoocclusive ED,分别为(30.，31]。

此外SOD2，GPX1是一种重要的细胞内的抗氧化酶，其中表达和活性取决于多种信号途径，包括SIRT3，PGC-1α和AMPK [52，53]。另外，在小鼠的骨骼肌GPX1的调制建议由核因子介导的κB（NF）κB）[54]和p53的转录因子，均通过SIRT1催化脱乙酰调节[55]。有趣的是，GPX1与糖尿病的矛盾机制有关[10]。而一些研究支持的保护功能GPX1在胰腺保存β-胰岛细胞与高血糖降低[56，其他研究表明肌肉骨骼细胞中高水平的GPX1有助于胰岛素抵抗[57]。在我们的研究中，GPX1被发现从CVDRF个人人类CC样品中显著上升，这意味着针对由SIRT3上升支持ROS生产过剩的代偿防御机制。GPX1的相对于水平SOD2增量还表明，所产生的活性氧可有效地降解为无害的产品，拥有由SOD2并最终由H2O GPX1顺序转化为H 2 O 2。但是，考虑到争议上面提到的，增量的GPX1有害作用，对肌肉细胞和胰岛素的调节不能排除。

在与SIRT3上调，在磷酸化AMPK的增量线α在B组中发现，但在总AMPK中也没有发现显著差异α和磷酸化AMPKα/总AMPKα比也不在PGC-1α患者的代谢性疾病中观察到组间表达，又一个增量倾向。两者合计，总AMPK的增加趋势α、SIRT1和PGC-1α和磷酸化AMPK的增量α在B组患者中观察到的SIRT3表明，与NOX1增加相关的氧化负荷的代偿机制。

目前的研究提出了一些限制可能解释缺乏的患者群体中所研究的蛋白水平显着性差异。主要的原因是各组患者在低数量。此外，在编程手术或者摘取器官进行移植，这意味着在获得了CC样品未知假定的混杂因素，如锻炼实践，饮食，不确定的酒精或滥用药物使用和药物处方与AMPK / SIRT1-PGC干扰-1α-SIRT3通路，如激活AMPK的二甲双胍[58]，也可以在同一组患者之间不同。生活方式的差异可能会影响氧化负担和氧化损伤的细胞反应。三，患者CVDRF建立一个定性属性，这意味着暴露于CVDRF的档次不是在每个单独的完全量化。对于进一步的研究，这将是有趣的细节代谢图谱和量化参数，如肥胖指数，糖化血红蛋白和氧化低密度脂蛋白的水平和血液中氧化的蛋白质。此外，更多的临床信息，如诊断，药物治疗方案，通过问卷与DM和高血压，心脏性测试，以及生活习惯有关可以帮助完善我们的数据并发症的存在时间。

5.结论

总之，AMPK / SIRT1-PGC-1α-SIRT3途径和miR-421的miR-34a的，的miR-200A和miR-206进行了研究，首次在阴茎糖尿病的中年男子的组织，这表明CVDRF附加到DM在应对产生重大影响氧化损伤。多个CVDRF的积累导致AMPK / SIRT1-PGC-1α-SIRT3通路激活，作为一种保护机制。然而，SIRT3表达的整体增加并没有反映在SOD2的表达中，因为该酶被发现下调。因此，有必要进一步分析以确定SOD2背后的调控机制及其对临床用药反应的影响。

数据可用性

在概念和使用本稿件的写入数据可在考研或SCOPUS。无法访问该组的任何先前的文章，可以要求给我们。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表没有利益冲突。

致谢

阿德里安娜R.罗德里格斯是由葡萄牙政府和欧洲联盟（DL57 / 2016 / CP1355 / CT009）的支持。

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