,7-dimethoxyflavone (DDF), one of the flavonoid compounds, is isolated from Reevesia formosana. Whether DDF induced HO-1 expression on human cardiac fibroblasts (HCFs) remained unknown. Here, we found that DDF time- and concentration-dependently induced HO-1 protein and mRNA expression, which was attenuated by pretreatment with reactive oxygen species (ROS) scavenger N-acetyl cysteine (NAC) in HCFs. DDF-enhanced ROS generation was attenuated by NAC, but not by either diphenyleneiodonium chloride (DPI, Nox inhibitor) or MitoTempol (mitochondrial ROS scavenger). Interestingly, pretreatment with glutathione (GSH) inhibited DDF-induced HO-1 expression. The ratio of GSH/GSSG was time-dependently decreased in DDF-treated HCFs. DDF-induced HO-1 expression was attenuated by an inhibitor of p38 MAPK (p38i VIII) or siRNA, but not by MEK1/2 (PD98059) or JNK1/2 (SP600125). DDF-stimulated p38 MAPK phosphorylation was inhibited by GSH or p38i VIII. Moreover, DDF-induced HO-1 expression was mediated through Nrf2 phosphorylation and translocation into the nucleus which was attenuated by NAC or p38 siRNA. DDF also stimulated antioxidant response element (ARE) promoter activity which was inhibited by NAC, GSH, or p38i VIII. Interaction between Nrf2 and the ARE-binding sites on the HO-1 promoter was revealed by chromatin immunoprecipitation assay, which was attenuated by NAC, GSH, or p38i VIII. We further evaluated the functional effect of HO-1 expression on the thrombin-induced fibrotic responses. Our result indicated that the induction of HO-1 by DDF can attenuate the thrombin-induced connective tissue growth factor expression. These results suggested that DDF-induced HO-1 expression is, at least, mediated through the activation of the ROS-dependent p38 MAPK/Nrf2 signaling pathway in HCFs. Thus, the upregulation of HO-1 by DDF could be a candidate for the treatment of heart fibrosis."> 感应的HO-1 5 8-Dihydroxy-4 7-Dimethoxyflavone通过激活ROS p38 MAPK / Nrf2变弱Thrombin-Induced结缔组织生长因子表达在人类心脏成纤维细胞 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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氧化医学和细胞寿命
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氧化医学和细胞寿命/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 1080168 | https://doi.org/10.1155/2020/1080168

肩中杨Li-Der萧、林囟会Hui-Ching曾,汪东城长谷川Situmorang, Yann-Lii低浓缩铀,Chuen-Mao杨, ”感应的HO-1 5, 8-Dihydroxy-4 ,通过激活7-Dimethoxyflavone ROS p38 MAPK / Nrf2变弱Thrombin-Induced结缔组织生长因子表达在人类心脏成纤维细胞”,氧化医学和细胞寿命, 卷。2020年, 文章的ID1080168, 18 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/1080168

感应的HO-1 5, 8-Dihydroxy-4 ,通过激活7-Dimethoxyflavone ROS / p38 MAPK / Nrf2变弱Thrombin-Induced结缔组织生长因子表达在人类心脏成纤维细胞

肩中杨,1,2 Li-Der萧,3 林囟会,3 Hui-Ching曾,3 汪东城长谷川Situmorang,3 Yann-Lii低浓缩铀,4 和 Chuen-Mao杨3,5,6

1中药学系Tao-Yuan,长庚纪念医院Kwei-San, Tao-Yuan 33302年,台湾

2中医学院,医学院,长庚大学Kwei-San, Tao-Yuan 33302年,台湾

3医学院药理学系,中国医科大学,40402年台中,台湾

4天然产品研究所、大学毕业的医学、台湾长庚大学,33302年桃园

5博士项目生物技术制药行业,中国医科大学,40402年台中,台湾

6学士学位阶段后的兽医、医学和健康科学学院,亚洲大学,聚,41354年台中,台湾

学术编辑器:Tullia Maraldi
收到了 2020年6月29日
修改后的 2020年11月11日
接受 2020年11月18日
发表 2020年12月04

文摘

血红素oxygenase-1 (HO-1)已被证明对作为一种抗氧化剂和抗炎酶在心血管炎症性疾病。黄酮类化合物被证明显示通过感应HO-1消炎和抗氧化的效果。5,8-Dihydroxy-4 ,7-dimethoxyflavone (DDF),其中一个黄酮类化合物,是孤立的Reevesia formosana。地区指定基金是否诱导HO-1表达人类心脏成纤维细胞(hcf)仍然未知。在这里,我们发现地区指定基金时间——和concentration-dependently诱导HO-1蛋白质和mRNA表达,减毒的预处理与活性氧(ROS)在hcf清道夫n -乙酰半胱氨酸(NAC)。DDF-enhanced ROS生成由南汽减毒,但不是通过diphenyleneiodonium氯(DPI,氮氧化物抑制剂)或MitoTempol(线粒体活性氧清除剂)。有趣的是,预处理与谷胱甘肽(GSH)抑制DDF-induced HO-1表达式。的比率GSH / GSSG时间减少DDF-treated hcf。DDF-induced HO-1表达减弱p38 MAPK的抑制剂(p38i八世)或核,但不是通过MEK1/2 (PD98059)或JNK1/2 (SP600125)。DDF-stimulated p38 MAPK磷酸化被谷胱甘肽抑制或p38i八世。此外,DDF-induced HO-1表达式是通过Nrf2介导的磷酸化和易位到原子核由南汽减毒或p38核。地区指定基金也刺激抗氧化反应元素()启动子活动由南京抑制谷胱甘肽或p38i八世。 Interaction between Nrf2 and the ARE-binding sites on the HO-1 promoter was revealed by chromatin immunoprecipitation assay, which was attenuated by NAC, GSH, or p38i VIII. We further evaluated the functional effect of HO-1 expression on the thrombin-induced fibrotic responses. Our result indicated that the induction of HO-1 by DDF can attenuate the thrombin-induced connective tissue growth factor expression. These results suggested that DDF-induced HO-1 expression is, at least, mediated through the activation of the ROS-dependent p38 MAPK/Nrf2 signaling pathway in HCFs. Thus, the upregulation of HO-1 by DDF could be a candidate for the treatment of heart fibrosis.

1。介绍

越来越多的证据表明,氧化应激参与了心血管疾病。在心血管系统中,成纤维细胞是最丰富的细胞群和心脏发展发挥重要作用,心脏修复和重构,和心脏纤维化机械力,化学信号,或各种侮辱。活化的成纤维细胞表达profibrotic细胞因子和积极放大效应通过自分泌/旁分泌机制。例如,心脏纤维化的特点是由纤维细胞外基质(ECM)过度沉积和胶原蛋白的合成和沉积直接导致左心室(LV)功能障碍,改变电传导,增加冠状动脉阻力(1]。这些功能的改变可能与生成活性氧(ROS)通过诱导炎症介质通过激活多个信号组件的心脏成纤维细胞(2,3]。越来越多的证据表明,活性氧的形成之间的不平衡和抗氧化防御机制与增加炎症反应有关引发心血管疾病的发生和发展。在病理条件下,ROS升高生产会导致氧化损伤DNA,蛋白质和脂质和细胞功能的变化导致细胞死亡。事实上,一些研究表明,特异表达ROS生产有着至关重要的作用在许多心脏疾病,包括心力衰竭(HF)、心脏肥大,心肌缺血再灌注损伤(I / RI)和缺血性心肌病(3- - - - - -6]。因此,一个有效的抗氧化剂的发展战略目标这些组件可以提供一个有益的干预管理心血管疾病。

结缔组织生长因子(CTGF) cysteine-rich分泌蛋白,属于一套CCN家族的蛋白质结构相关。CTGF参与血管生成和细胞分化在正常情况下。此外,CTGF还调节伤口愈合和纤维化病理条件下7,8]。在组织损伤和纤维化反应,CTGF可能刺激成纤维细胞的增殖,分化走向myofibroblasts,增强细胞外基质(ECM)的生产。在肉芽组织和各种纤维紊乱,更高水平的CTGF检测各器官包括心脏(9]。因此,CTGF可能发挥关键作用的发展各种心脏疾病,如心肌纤维化(10]。CTGF的表达,立即早期基因,是由多种细胞类型和刺激,包括凝血酶(11- - - - - -13]。阿尔提耶里等人发现,凝血酶触发人类心房纤维母细胞主要分化myofibroblasts丰富α光滑的肌肉肌动蛋白(αSMA)、纤连蛋白和I型胶原蛋白(14]。Dabigatran,凝血酶抑制剂,可以减弱心脏纤维化高压引起的过载和改善全球心脏功能(14,15]。因此,凝血酶引起的CTGF的表达可能是心脏纤维化的发病机制中发挥重要作用。

血红素加氧酶- 1 (HO)被认为是一个潜在的治疗目标为人类疾病,包括心血管炎症性疾病。HO-1已被证明能够防止炎症反应和被各种刺激和诱导氧化压力(16,17]。HO-1可以抑制心肌细胞衰老,改善心肌梗死和老年小鼠的心脏功能(18]。证据显示,NF-E2-related因素(Nrf2) / HO-1信号通路是心血管内稳态的关键调节器通过抑制氧化应激,这可以防止氧化跟压力心脏重构和心脏衰竭(19,20.]。中国草药吸引了注意力的治疗炎症性疾病。特别是,梧桐科家族被发现展示几个生物活性,如抗炎和抗氧化活动(21,22]。几个组件从中国草药中提取含有黄酮类化合物,具有抗炎和抗氧化剂对病理生理条件包括心血管疾病的影响。5,8-Dihydroxy-4 ,7-dimethoxyflavone (DDF)是一种黄酮类化合物分离Reevesia formosana。这些研究促使我们探索地区指定基金是否能减弱的影响凝血酶在hcf CTGF的表达。

HO-1的upregulation不同刺激紧密调制通过不同的信号通路在各种类型的细胞(23]。例如,EGF-induced HO-1表达式是通过表皮生长因子受体介导,NADPH氧化酶(Nox)和活性氧产量HT-29细胞(24]。增殖蛋白激酶(MAPKs)也被证实移植HO-1表达式在应对不同的刺激25,26]。亚砷酸钠上调HO-1表达式通过JNK1/2在鼠肝细胞的激活27),通过ERK1/2和p38 MAPK通路通过谷胱甘肽的耗竭(谷胱甘肽)和氧化应激增加鸡肝癌细胞(28]。此外,有几个基因表达转录规定参与HO-1通过Sp1的激活,激活蛋白1 (AP-1),或Nrf2调制通过各种信号通路(29日,30.]。因此,本研究的目的是针对解剖地区指定基金是否能诱导HO-1表达和减弱thrombin-induced CTGF表达,与类似的共享机制如氮氧化物/ ROS, MAPKs, Nrf2 hcf。目前的结果显示,DDF-induced HO-1表达式,至少,介导的激活ROS-dependent p38 MAPK / Nrf2信号通路抑制了thrombin-induced hcf CTGF的表达。

2。材料和方法

2.1。材料

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) / F-12和胎牛血清(的边后卫)从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。5,8-Dihydroxy-4 ,7-dimethoxyflavone (DDF,图1)请提供的天然产物实验室博士Yann-Lii列伊(台湾长庚大学)。Hybond C膜和增强化学发光(ECL)免疫印迹检测系统从通用电气医疗集团购买生物科学(英国白金汉郡,英格兰)。抗体phospho-p38和phospho-Nrf2购买从细胞信号(丹弗斯,MA)。放线菌素D (Act.D),放线菌酮(气),n -乙酰半胱氨酸,SP600125,谷胱甘肽,trolox, diphenyleneiodonium氯(DPI), PD98059和p38抑制剂八世(p38i八世)从Biomol购买(普利茅斯会议上,PA)。反β肌动蛋白抗体购自生源论(英国Boumemouth)。Anti-GAPDH (# MCA-1D4)获得EnCor生物技术(盖恩斯维尔FL)。Anti-HO-1平安谷胱甘肽(GSSG /谷胱甘肽)检测试剂盒恩佐买来生命科学(纽约法明岱尔)。CTGF抗体(sc - 25440)购买从圣克鲁斯(圣克鲁斯、钙、美国)。Mitotempol dihydroethidium(她),CM-H2DCFDA买来分子探针(尤金,或者美国)。sds - page试剂购买从MDBio Inc .(台北,台湾)。凝血酶和其他化学物质从σ购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。


图1
化学结构的5,8-Dihydroxy-4 ,7-dimethoxyflavone (DDF)隔绝Reevesia formosana。
2.2。细胞培养和治疗

人类心脏成纤维细胞(hcf)买来ScienCell研究实验室(美国圣地亚哥,CA)和在DMEM / F-12培养基培养补充10%的边后卫和抗生素(青霉素G 100 U /毫升、100 ng / ml链霉素,和250 ng / ml二性霉素b)在37°C湿润有限公司5%2的气氛。当文化达到融合,细胞用0.05%胰蛋白酶/ 0.53毫米EDTA为1分钟37°C。细胞悬液的稀释与DMEM / F-12含有10%的边后卫的浓度 细胞/毫升。的细胞悬液被播种(1毫升/)12-well文化板块(2毫升/)6-well文化板块,及10厘米(10毫升/盘)的培养皿中,静止在无血清DMEM / F-12融合通过孵化24 h。以下实验使用HCF段落从5到7。

2.3。细胞生存能力分析

hcf被播种到24-well文化板块融合,达到70% serum-starved 24 h,然后用不同浓度的地区指定基金孵化16 h。细胞生存能力评估细胞计数Kit-8 (CCK-8)检测通过检测mitochondrial-metabolized甲瓒代生活hcf直接成正比。ELISA测定样品的吸光度的读者(生物技术、H1)波长为450 nm。

2.4。准备样品和免疫印迹分析

hcf是静止在无血清DMEM / F-12 24 h,没有孵化或不同浓度的地区指定基金在37°C指定的时间间隔。抑制剂应用时,他们加了1 h表示之前接触地区指定基金除外。孵化后,细胞迅速用冰冷的PBS和细胞溶解样品包含125毫米Tris-HCl缓冲,1.25% SDS、6.25%甘油、3.2%β巯基乙醇和7.5μ溴酚蓝pH值6.8。样本变性,受到使用10% sds - page ( )运行凝胶,转移到硝酸纤维素。膜与初级抗体的免疫印迹(1:1000稀释)一夜之间在4°C,其后孵化peroxidase-conjugated二级抗体室温2 h。免疫反应性的乐队,被可视化增强化学发光试剂(西方照明+;美国珀金埃尔默,沃尔瑟姆,马)。免疫印迹的图像是通过使用一个UVP BioSpectrum 500成像系统(旱地、钙、美国),和微分析进行了使用UN-SCAN-IT凝胶软件(美国UT奥瑞姆)。

2.5。总RNA提取和实时PCR分析

总RNA提取1毫升试剂盒(表达载体)hcf处理地区指定基金为各种时间间隔。第一次执行链cDNA合成2μg总RNA的六聚体使用随机引物在最后的20倍μl (5μ克/μl随机五个一,1毫米核苷酸,2户/μl核糖核酸酶抑制剂,和10个单位/μl(上标2逆转录酶)。在37°C的反应进行了60分钟。合成互补dna作为模板PCR反应使用Q-Amp™2×筛查火Taq大师(Bio-Genesis技术,台北,台湾)和目标基因的引物。qPCR是由使用Kapa探针快速qPCR装备大师混合通用(美国Kapa生物系统公司,马威尔明顿)在StepOnePlus™实时PCR系统(ThermoScientific-Applied生物系统公司)。目标基因的相对数量计算使用ΔΔCt方法(Ct =阈值周期)。引物序列如下:

2.6。瞬时转染与siRNAs

hcf镀在 细胞/毫升12-well融合或10厘米的菜,直到达到约70%。细胞与PBS洗一次,然后添加与1毫升/或5毫升/盘Opti-MEM介质(美国纽约Gibco,大岛)转染。瞬时转染siRNAs (p38α和Nrf2)进行了使用Lipofectamine 2000转染试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。DNA Lipofectamine试剂复杂是添加到每个100海里的最终浓度siRNA然后孵化37°C 5 h。细胞转移到DMEM / F-12中含有10%的边后卫额外3 h与PBS洗两次,然后保存在无血清DMEM / F-12 16 h与地区指定基金治疗之前。

2.7。测量细胞内的活性氧积累

使用CM-H细胞内ROS水平测定2DCFDA和她。荧光强度的DCF和她染色观察荧光显微镜(蔡司,Axiovert 200)。hcf洗了温暖的PBS和孵化苯酚red-free中包含10μM CM-H2DCFDA或5μ在37°C M她30年或10分钟,分别。随后,中包含DCF-DA和她被删除,取而代之的是新鲜的媒介。hcf然后孵化与不同浓度的地区指定基金。相对荧光的荧光强度(单位)为495 nm励磁和529海里排放贴现或518海里励磁和605海里排放对她使用荧光标(协同HT1、BioTek Winooski, VT,美国)。

2.8。谷胱甘肽测定

hcf没有预处理或与各自的抑制剂1 h,然后孵化10μM地区指定基金指定的时间间隔。上层清液是用来测量的比率减少谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSSG)氧化应激的标记,确定使用谷胱甘肽的检测装备,根据制造商的说明(美国纽约恩佐生命科学、法明岱尔)。

2.9。免疫荧光染色

hcf培养在6-well文化板块融合盖玻片,直到达到约70%,血清24 h。细胞治疗没有或抑制剂1 h,然后孵化与地区指定基金指定的时间间隔。与冰冷的PBS洗两次后,这些细胞被permeabilized冷甲醇10分钟,然后用5%固定BSA为30分钟37°C。染色后的孵化与anti-Nrf2多克隆抗体(1:100稀释)1% BSA在一夜之间在4°C,与PBS洗涤三次,孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭山羊anti-rabbit抗体(1:100稀释)1% BSA 1 h,并与PBS清洗三次。荧光显微镜图像捕获(Axiovert 200;卡尔蔡司,Thornwood,纽约,美国)。

2.10。染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定

检测核蛋白质之间的关系和人类HO-1启动子,在10厘米菜种植hcf融合和血清24 h。治疗后与地区指定基金protein-DNA复合物被1%甲醛固定介质。固定细胞被洗和细胞溶解SDS-lysis缓冲区(1% SDS, 5毫米EDTA, 1毫米PMSF和50 mM Tris-HCl)。细胞溶解产物被用在4°C到DNA的大小成为200 - 300个碱基对。样本离心机,可溶性染色质被孵化与剪切事先批准鲑鱼精子dna蛋白质琼脂糖在4°C 30分钟旋转。事先批准后,样本离心机和上层清液被转移到一个新管。样品的浓度是量化和平衡。一分的DNA样本作为输入控制,仍是孵化anti-phospho-Nrf2抗体在一夜之间在4°C。收集antibody-protein-DNA利用蛋白质的免疫沉淀反应复合物的珠子在一夜之间旋转在4°C。孵化后,样本用低盐缓冲(0.1% SDS, 1% Triton - 100, 2毫米EDTA, 20毫米Tris-HCl, pH值8.1,和150毫米氯化钠),高盐缓冲(0.1% SDS, 1% Triton - 100, 2毫米EDTA, 20毫米Tris-HCl, pH值8.1,和500毫米氯化钠),氯化锂缓冲区(脱氧胆酸盐NP-40 0.25氯化锂,1%,1%,1毫米EDTA, Tris-HCl 10毫米,和pH值8.1),和Tris-EDTA (pH值8.0),然后用洗脱缓冲(1% SDS,筛选了100毫米NaHCO3)。protein-DNA交联的复合物被孵化了一夜之间在65°C。DNA提取和resuspended H2O和使用TaqMan芯片QPCR试验进行PCR扩增。

2.11。统计分析的数据

统计分析是由使用GraphPad Prizm程序6.0软件(GraphPad,圣地亚哥,CA)。我们用单向方差分析后跟Dunnett事后测试当比较两组以上的数据或非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验,其次是邓恩的多重比较检验当比较多个独立团体和方差分析常态假设不满足。 0.05被认为是具有统计学意义的价值观。事后测试只有在运行 实现 和方差齐性的假设了。所有的数据都表示为 ,至少三个不同的实验( =数量的独立的细胞培养的准备)。误差是省略了时的尺寸符号。

3所示。结果

3.1。地区指定基金诱导HO-1 hcf蛋白质和mRNA的表达

调查地区指定基金是否诱导HO-1表达式,hcf服用各种浓度(3、10和30μ米)的地区指定基金指定的时间间隔(0、2、4、8、16和24 h)。HO-1蛋白质表达的水平是由蛋白质印迹。如图2(一个)、地区指定基金诱导HO-1蛋白质表达时间和浓度的方式。当细胞暴露于10到30μ在16 h M,最大HO-1蛋白表达增加三倍比的控制。此外,我们发现地区指定基金不大于50μM对细胞生存能力没有显著的影响,取决于CCK8分析工具包(图2 (b))。因此,使用地区指定基金10点的浓度μ米以下实验。

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图2
地区指定基金诱导HO-1 hcf蛋白质和mRNA的表达。(一)hcf孵化与不同浓度的地区指定基金(3、10和30μ米)为指定的时间间隔(0、2、4、8、16和24 h)。HO-1和的水平β肌动蛋白免疫印迹分析蛋白表达检测。(b)细胞与不同浓度的地区指定基金孵化(1、3、10、20、30、50μ米)16 h。细胞的生存能力是由使用CCK-8工具包。(c)与10细胞被孵化μM地区指定基金指定的时间间隔(0、1、2、4、6和8 h)。HO-1和GAPDH mRNA分析实时PCR。数据表示为 三个独立的实验。# ,与控制。

进一步确定影响的地区指定基金HO-1基因转录,HO-1 mRNA表达的水平是由实时PCR。hcf服用10μM地区指定基金指定的时间间隔(0、1、2、4、6和8 h)。已达到最大地区指定基金时间诱导HO-1 mRNA表达反应在6 h和8 h(图内略有下降2 (c))。这些结果表明,地区指定基金可能导致hcf HO-1 mRNA和蛋白表达。

3.2。DDF-Induced HO-1表达式需要持续的转录和转译过程

检查是否DDF-induced HO-1表达介导的转录或翻译水平,hcf和放线菌素D(法进行预处理。D)或环己酰亚胺(CHI)与10 1 h然后孵化μM地区指定基金16 h(蛋白表达)或6小时(mRNA表达)。预处理与CHI或行动。D降低DDF-induced HO-1蛋白质浓度的方式表达(数字3(一个)和3 (b))。此外,DDF-induced HO-1 mRNA表达被抑制预处理与行动。D,分析了实时PCR(图3 (c))。这些结果表明,DDF-induced HO-1蛋白表达依赖于增加HO-1 hcf基因转录。

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图3
DDF-induced HO-1表达式需要hcf正在进行的转录和翻译。(a, b) hcf使用各种浓度的气(a)或(b)的行为。与10 D 1 h,然后孵化μM地区指定基金16 h。HO-1和的水平β肌动蛋白免疫印迹分析蛋白表达检测。(c)细胞使用30 nM的行为。与10 D 1 h,然后孵化μM地区指定基金6 h。HO-1和GAPDH mRNA分析实时PCR。数据表示为 三个独立的实验。# ,而单独使用地区指定基金。
3.3。ROS生成的地区指定基金诱发HO-1言论刺激

一项研究表明,活性氧可以作为第二信使的生理和病理反应包括感应HO-1表达式(31日,32]。确定ROS生成是否参与DDF-induced HO-1表达式,南汽的活性氧清除剂是用于这一目的。如数据所示4(一)和4 (b)预处理,NAC浓度依赖性弱DDF-induced HO-1蛋白质和mRNA的表达。直接检测活性氧的水平一代hcf接受10μM地区指定基金,活性氧的水平一代使用荧光探针测定H2DCF-DA。我们发现地区指定基金增强活性氧生成与最大响应时间的方式(约1.28折)在h(图1 - 24 (c)),由预处理明显减毒NAC(图4 (d)),但不是通过预处理DPI(氮抑制剂)或MitoTempol(线粒体活性氧清除剂(图)4 (d))。这些结果进一步支持的DCF和她染色图像的数据使用荧光显微镜(图观察到4 (e))。这些结果表明,感应HO-1的地区指定基金通过ROS-dependent介导的机制,而不是通过氮氧化物或线粒体ROS介导的一代。进一步,我们调查是否DDF-induced HO-1蛋白表达介导通过谷胱甘肽的耗竭;谷胱甘肽是用来测试这个假说。如图4 (f),DDF-induced HO-1表达式被预处理与减毒谷胱甘肽浓度的方式,但不是Trolox。因此,我们推测DDF-induced ROS-dependent HO-1表达式可能介导通过谷胱甘肽的耗竭导致氧化应激水平。进一步,确保ROS的产生是由于二硫化谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG)之间的不平衡,我们发现谷胱甘肽的比例/ GSSG hcf暴露于10μM地区指定基金,用作氧化应激的标记。如图4 (g)地区指定基金的比例下降,谷胱甘肽(GSSG导致活性氧积累,从而增强HO-1 hcf表达式。

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图4
ROS生成参与DDF-induced HO-1表达式。(一)hcf使用不同浓度的南汽与10 1 h然后孵化μM地区指定基金16 h。HO-1和的水平β肌动蛋白免疫印迹分析蛋白表达检测。(b)细胞使用10毫米南汽与10 1 h然后孵化μM地区指定基金6 h。HO-1和GAPDH mRNA分析实时PCR。(c, d)测量ROS生产的水平。细胞治疗10μM地区指定基金指定的时间间隔(c),细胞没有预处理或NAC 10毫米,10μM DPI或1μM MitoTempol 1 h,然后孵化与10μM地区指定基金30或60分钟(d)。(e)细胞使用10毫米南汽与10 1 h然后孵化μM地区指定基金1 h,并贴上DCFDA或她。荧光强度的活性氧积累使用荧光显微镜观察(放大倍数= 400×)。(f)细胞进行预处理与谷胱甘肽或Trolox 1 h,然后孵化10μM地区指定基金16 h。HO-1和的水平β肌动蛋白免疫印迹分析蛋白表达检测。(g)细胞孵育10μM地区指定基金指定的时间间隔,然后GSG / GSSG的比例决定了谷胱甘肽检测设备。数据表示为 三个独立的实验。# ,与控制。
3.4。p38 MAPK的表达需要HO-1引起的地区指定基金

的激活MAPK-dependent Nrf2已被证明加强HO-1表达式(26]。确定MAPKs参与了地区指定基金诱导HO-1表达式,我们评估p38 MAPK的影响(p38i八世),MEK1/2 (PD98059)和JNK1/2 (SP600125) DDF-induced HO-1表达式。如数据所示5(一个)和5 (b)第八,预处理p38i concentration-dependently HO-1降低蛋白质和mRNA表达引起的地区指定基金。然而,预处理的抑制剂MEK1/2 (PD98059)或JNK1/2 (SP600125)未能改变DDF-induced HO-1表达式(图5(一个))。确保p38 MAPK在DDF-induced HO-1表达式,如图5 (c)小干扰rna撞倒,转染hcf p38 MAPK p38 MAPK蛋白质水平和减毒DDF-induced HO-1蛋白表达。此外,探讨p38 MAPK磷酸化是否需要HO-1表达式,hcf服用10μM地区指定基金指定的时间间隔(0、5、15、30、60和120分钟),和细胞提取物被免疫印迹分析使用一个antiphosphorylated p38 MAPK抗体。如图5 (d),地区指定基金刺激p38 MAPK磷酸化与最大响应时间的方式在30 - 120分钟。预处理与谷胱甘肽或p38i八世减少DDF-stimulated p38 MAPK磷酸化。此外,确保p38 MAPK磷酸化的作用与HO-1表情刺激地区指定基金,转染的hcf p38 MAPK siRNA撞倒p38 MAPK蛋白质水平和减毒DDF-stimulated p38 MAPK磷酸化(图5 (d)),但没有影响HO-1蛋白表达观察期间(数据没有显示)。这些结果表明DDF-induced HO-1表达式是通过激活ROS介导/ p38 MAPK在hcf。

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图5
p38 MAPK参与DDF-induced HO-1但不是物和Erk表达。(一)hcf使用不同浓度的p38抑制剂八世,PD98059,和SP600125 1 h,分别,然后与地区指定基金孵化(10μ米)16 h。蛋白质的表达了HO-1免疫印迹分析。(b)细胞用p38抑制剂预处理八世1 h,然后用地区指定基金孵化(10μ米)6 h。HO-1 mRNA的水平被实时PCR分析。(c)细胞转染炒或p38α核,然后与地区指定基金孵化(10μ米)16 h。p38的蛋白质含量,HO-1,β肌动蛋白免疫印迹分析测定。(d)与地区指定基金(10细胞治疗μ米)为指定的时间间隔有或没有预孵化与谷胱甘肽(1毫米)和p38抑制剂八世(0.1μ米),分别或转染争夺或p38核。磷的含量和total-p38 MAPK和GAPDH是由蛋白质印迹。数据表示为 三个独立的实验。# ,而单独使用地区指定基金。
3.5。地区指定基金刺激Nrf2核易位和磷酸化参与HO-1表达式

Nrf2已经报道的激活驱动中发挥重要作用的抗氧化酶的表达,包括HO-1,防止细胞毒性(33- - - - - -35]。调查是否参与Nrf2 DDF-induced HO-1表达式,转染的hcf Nrf2 siRNA撞倒Nrf2蛋白质水平(图6(一)(图)和减毒DDF-induced HO-1蛋白质6(一)),信使rna(图6 (b))表达式。确定的水平Nrf2磷酸化相关HO-1表达式,我们发现转染与Nrf2 siRNA撞倒Nrf2水平和减毒DDF-stimulated Nrf2磷酸化(图6 (c))。此外,预处理与南汽或转染p38 siRNA也抑制Nrf2磷酸化刺激地区指定基金(图6 (c)),这表明Nrf2是ROS的下游组件/ p38 MAPK在hcf。激活Nrf2已被证明可能促使进入细胞核和启动抗氧化蛋白的表达。因此,Nrf2磷酸化水平和易位的原子核是由蛋白质印迹。我们发现地区指定基金时间刺激Nrf2磷酸化和易位胞液成核(图6 (d))。这些结果进一步支持的成像数据显示,DDF-stimulated Nrf2磷酸化和易位immunofluorescent染色观察到耦合使用这些药理抑制剂。DDF-induced Nrf2磷酸化和易位到细胞核被预处理与南汽减毒,谷胱甘肽或p38i八世(图6 (e))。

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图6
Nrf2参与地区指定基金诱导HO-1表达式。(一)hcf转染炒或Nrf2 siRNA,然后孵化地区指定基金(10 U /毫升)16 h。HO-1 Nrf2的蛋白质含量,β肌动蛋白免疫印迹测定。(b)细胞转染与炒或Nrf2 siRNA然后用地区指定基金孵化6 h。实时PCR HO-1 mRNA表达进行了分析。(c)细胞被使用或没有NAC(10毫米)或与炒核转染,p38核,或Nrf2 siRNA,单独,然后与地区指定基金孵化(10μ米)为指定的时间间隔。含磷的水平和total-Nrf2总p38 MAPK和GAPDH是由蛋白质印迹。(d)与地区指定基金(10细胞治疗μ米)为指定的时间间隔。核和胞质提取物的准备,Nrf2的蛋白质含量,p-Nrf2,核纤层蛋白A, GAPDH是由蛋白质印迹。(e)细胞被使用或没有NAC(10毫米)、谷胱甘肽(1毫米),或p38i八世(0.1μ米),然后与地区指定基金孵化2 h。磷酸化Nrf2核易位是用FITC标记和免疫荧光显微镜观察到。酒吧、规模50μm。# ,而单独使用地区指定基金。

进一步研究是否这些信号组件和Nrf2参与DDF-regulated hcf转录活动,芯片和荧光素酶启动子活动进行了分析。如图7(一)、地区指定基金中启动子活动最大响应时间增加3 h,减毒的预处理与南汽、谷胱甘肽或p38i八世(图7 (b))。此外,芯片的数据分析进一步表明,预处理与南汽、谷胱甘肽或p38i八世抑制Nrf2绑定ARE2 HO-1启动子(数字7 (c)和7 (d))。因此,这些结果表明,DDF-induced HO-1表达式是通过激活介导的ROS / p38 MAPK导致Nrf2绑定在hcf结合位点。

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图7
DDF-mediated Nrf2激活HO-1发起人通过绑定在hcf网站。(a, b) hcf cotransfected promoter-Luc和β牛乳糖然后孵化地区指定基金(10μ米)为指定的时间间隔(1、2、3、4和5 h)(一个);使用或没有NAC(10毫米)、谷胱甘肽(1毫米),或p38i八世(0.1μ米),然后与地区指定基金孵化(10μM)对3 h (b)。细胞溶解产物测定是启动子荧光素酶的活动。(c, d)的转录活动Nrf2由芯片分析决定。细胞治疗的地区指定基金(10μM)为指定的时间间隔(1、2和4 h) (c),细胞被使用或没有NAC(10毫米)、谷胱甘肽(1毫米),或p38i八世(0.1μ米),然后与地区指定基金孵化2 h (d) # ,而单独使用地区指定基金。
3.6。地区指定基金变弱的Thrombin-Induced CTGF的表达

调查地区指定基金是否会产生一个antifibrotic效应体现为CTGF的表达水平,hcf治疗与不同浓度(1、3和10 U /毫升)的凝血酶显示时间间隔(0、2、4、8、16和24小时)。CTGF蛋白表达的水平是由蛋白质印迹。如图8(一个),凝血酶诱导CTGF蛋白表达时间和浓度的方式与8 h内最大的表达式。预处理的地区指定基金6 h显著抑制thrombin-induced CTGF表达在hcf(图8 (b))。这些结果表明,地区指定基金可以抑制thrombin-induced CTGF表达通过,至少部分的HO-1 upregulation hcf。

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图8
Upregulation HO-1通过地区指定基金抑制thrombin-induced CTGF的表达。(一)hcf孵化与不同浓度的凝血酶(1、3和10 U /毫升)为指定的时间间隔(0、2、4、8、16和24 h)。CTGF和的水平β肌动蛋白蛋白表达被免疫印迹检测。(b) hcf预处理没有或10μM地区指定基金6 h,然后用10 U /毫升挑战凝血酶16 h。CTGF和的水平β肌动蛋白蛋白表达被免疫印迹检测。数据表示为 三个独立的实验。# ,而单独使用地区指定基金。

4所示。讨论

炎症和氧化应激是高度交联的过程中扮演重要角色各种心血管炎症性疾病。HO-1已被证实能产生一种抗氧化剂和抗炎的酶,这种酶改善失败heart-induced肥大,纤维化和氧化应激36]。类黄酮是一组多酚化合物中发现了水果、茶、和医学草药。多项研究表明,黄酮类化合物显示抗氧化和抗炎作用通过抗氧化蛋白的upregulation包括HO-1在各种类型的细胞(26,37,38]。然而,机制DDF-induced HO-1表达式在hcf仍未知。在这项研究中,我们表明,地区指定基金显著诱导HO-1 hcf表达式。地区指定基金的详细分子机制诱导HO-1表达式,至少在某种程度上,通过激活介导的ROS-dependent p38 MAPK / Nrf2通路和减毒thrombin-induced CTGF表达在hcf(图9)。我们所知,这是第一个报告显示DDF诱发ho-1基因表达可以预防和管理心血管炎症性疾病。


图9
所涉及的信号通路示意图DDF-induced HO-1表达抑制thrombin-stimulated CTGF在hcf感应。DDF-induced HO-1表达式,至少部分介导的激活ROS-dependent p38 MAPK / Nrf2通路,这减毒thrombin-stimulated CTGF归纳。“⟶”意味着“激活”和“⊥”意味着“抑制”。

在这项研究中,我们发现ho-1基因被激活在hcf地区指定基金。地区指定基金的时间——concentration-dependently诱发HO-1蛋白表达,这对细胞生存能力没有显著影响。upregulation HO-1蛋白质的地区指定基金是通过新的HO-1信使rna介导的合成、减毒的行动d实时PCR分析进一步表明地区指定基金诱发HO-1 mRNA表达、减毒的行动。D但不是在hcf环己酰亚胺。这些结果表明DDF-inducedho-1基因表达主要是在转录水平调节。

氮氧化物家庭是主要的细胞内活性氧的来源。Nox-dependent ROS生成可以诱导HO-1表达式通过各种刺激在体外和在活的有机体内研究[35,39- - - - - -42]。hcf,我们发现地区指定基金可以诱导活性氧生成减毒的预处理与南汽(活性氧清除剂),但不是DPI(氮抑制剂)和MitoTempol(线粒体活性氧清除剂)。此外,NAC能抑制DDF-mediated ROS生成和HO-1表达式。然而,南汽的结构有一个硫醇(sh)集团与Trolox不同。硫醇组织谷胱甘肽的主要结构,充当减少代理。另一方面,南京也被称为合成谷胱甘肽的前体。谷胱甘肽的区别和Trolox DDF-induced HO-1表达可能是由于不同的化学性质和反应hcf ROS。尤其是Trolox报道刺激Nrf2-mediated HO-1表达式主要保护人类和小鼠肺泡II型细胞从烟伤43]。在最近的一项研究中,黄酮类化合物诱导合成谷胱甘肽和HO-1表达,防止氧化应激(44]。在这项研究中,我们发现地区指定基金治疗细胞内谷胱甘肽(GSSG比率降低,增加活性氧水平导致hcf HO-1表达式。这些结果表明,DDF-induced HO-1表达可能是由于在hcf谷胱甘肽的耗竭,符合报告证明了Oguro et al。(1996)45]。这些结果进一步支持的数据预处理与谷胱甘肽也减毒DDF-induced HO-1 hcf表达式。

MAPKs包括三个亚科,包括ERK1/2 JNK1/2和p38 MAPK调节生理和病理过程。几项研究已经表明,MAPKs继电器信号从细胞表面成核(46等)参与基因表达的启动HO-1诱导氧化应激在各种类型的细胞(47- - - - - -49]。这三个MAPKs已被证明参与的表达HO-1 dihydroquercetin诱导的巨噬细胞和枯否细胞(26]。HO-1的感应andrographolide在星形胶质细胞(50)和一氧化氮在海拉细胞48部分由p38 MAPK和ERK1/2信号。此外,JNK1/2和p38 MAPK已被证明参与lonchocarpine-induced HO-1表达大脑胶质细胞(37]。在这项研究中,我们发现DDF-induced HO-1表达减弱了p38 MAPK的抑制剂,但不是MEK1/2或JNK1/2 hcf,暗示p38 MAPK的参与在这些反应。这些结果是一致的,il - 10 (34],butein [38],[镉49通过p38 MAPK)诱导HO-1表达介导的各种类型的模型。此外,我们还发现,ROS生成可以刺激p38磷酸化由预处理抑制与南汽和p38抑制剂,这意味着p38 MAPK的下游组件hcf ROS-mediated反应。

转录因子Nrf2被认为是调节和激活抗氧化反应元素(是)在启动子区域,负责监管HO-1等抗氧化和解毒基因的表达。Keap1-Nrf2通路是内生和外生cytoprotective反应的主要监管机构压力引起的活性氧与亲电试剂51]。在正常情况下,Nrf2由Keap1隐藏在细胞质中,促进其泛素蛋白酶体降解。在压力条件下,sh组的修改Keap1或磷酸化Nrf2-Keap1 Nrf2促进离解的复杂。Nrf2把成核和结合序列然后增加转录Nrf2-regulated二期抗氧化酶,衰减ROS生成(52]。氧化应激是指细胞内活性氧水平升高,破坏蛋白质、脂质和DNA。然而,最近的研究表明,略有增加,活性氧是必要的调节生物和生理过程和细胞信号过程的好处。在hcf,我们发现Nrf2参与DDF-induced HO-1表达式通过磷酸化的积累Nrf2 hcf的细胞核。因此,我们发现,预处理与南汽、谷胱甘肽,和p38抑制剂显著降低Nrf2表达式,由免疫荧光染色。此外,我们进一步透露,南汽、谷胱甘肽和p38抑制剂阻止Nrf2绑定在HO-1启动子结合位点。因此,我们建议Nrf2可以绑定在HO-1启动子序列,最后导致HO-1 hcf表达式。

凝血酶可以起到至关重要的作用在心脏肥大和postinjury重建过程14,53]。此外,CTGF在几个心脏疾病的发病机制是一个重要的组件(10),由凝血酶诱导的(12,13]。目前的结果表明,在hcf,凝血酶显著诱导CTGF表达减毒的地区指定基金通过upregulation HO-1。这些发现与之前的研究一致表明抑制凝血酶反应可以减弱心肌纤维化和改善心脏功能(14,15]。因此,地区指定基金可能是有益的治疗心脏衰竭和心脏纤维化。根据我们的数据,凝血酶引起的地区指定基金可能会阻止CTGF的表达,因为预处理的地区指定基金6小时可以抑制CTGF归纳。黄et al。(2020)发现HO-1和CTGF呈现负相关的糖尿病性视网膜病变大鼠模型(54]。核黄素治疗对糖尿病心肌病有很大好处,这可能会导致从提高心肌HO-1和减少心肌CTGF水平在同一时间(55]。我们的数据也表明,过度的HO-1可以在hcf减弱CTGF表达凝血酶引起的,这一发现证明地区指定基金的抑制性影响CTGF表达由凝血酶引起的,至少部分,来自HO-1感应。此外,地区指定基金的详细机制抑制thrombin-stimulated CTGF感应是一个很重要的问题进行进一步的调查。

5。结论

总之,我们证明了DDF-induced HO-1表达式,至少,介导的激活ROS-dependent p38 MAPK / Nrf2信号通路和变弱thrombin-stimulated CTGF感应(图9)。因此,地区指定基金可能是一个潜在的治疗干预治疗心脏疾病的管理。然而,本研究的局限性,没有证据表明澄清HO-1表达引起的地区指定基金,防止心脏疾病在活的有机体内。因此,重要的是要进一步转化细胞培养成一个动物研究的结果。的结果在活的有机体内研究可以提供治疗应用的地区指定基金管理的可能性的心脏疾病。

缩写

的行为。D: 放线菌素D
是: 抗氧化反应的元素
BSA: 牛血清白蛋白
气: 环己酰亚胺
芯片: 染色质免疫沉淀反应
DCF-DA: 2 ,7 - - - - - -二乙酸二氯荧光素
CTGF: 结缔组织生长因子
她: Dihydroethidium
DMEM / F-12: 杜尔贝科的鹰的中/火腿F-12修改
DPI: Diphenyleneiodonium氯
发射极耦合逻辑: 增强化学发光
ECM: 细胞外基质
表皮生长因子受体: 表皮生长因子受体
兵: 细胞外调节蛋白激酶
的边后卫: 胎牛血清
FITC: 异硫氰酸荧光素
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
销售税: 谷胱甘肽S-transferase
HO-1: 血红素oxygenase-1
HCF: 人类心脏成纤维细胞
物: c-Jun-NH2-terminal激酶
Keap1: Kelch决定将蛋白质1
LV: 左心室
MAPK: 增殖蛋白激酶
南京: N-acetyl-L-cysteine
NADPH: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
Nrf2: NF-E2-related因子2
PBS: 磷酸盐
PKC: 蛋白激酶C
PMSF: Phenylmethylsulfonyl氟化
ROS: 活性氧
rt - pcr: 逆转录-聚合酶链反应
sds - page: 钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳
核: 小干扰RNA
Sp1: 特异性蛋白1
肿瘤坏死因子-α: 肿瘤坏死因子α
Tris-HCl: 三羟甲基甲胺盐酸盐
ttb: Tween-Tris-buffered盐水
VCAM-1: 血管细胞粘附molecule-1。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

JHS CCY, LDH、HHL HCT,葵花籽油,c my设计并进行了研究。CCY、LDH、HHL JHS, HCT执行和收集数据。CCY、LDH、HHL、HCT、JHS, c my分析和解释数据。CCY和c my准备手稿。JHS CCY, LDH、HHL HCT,葵花籽油,c my回顾了手稿。JHS CCY, LDH、HHL HCT,葵花籽油,c my批准最后的手稿。

确认

我们赞赏chen yu博士王他的建议和构建质粒在这项研究中应用。这项工作得到了科技部,台湾(格兰特数字:most107 - 2320 - b - 039 - 071 my2 most108 - 2320 - b - 039 - 061, most109 - 2320 - b - 039 - 061, most108 - 2320 - b - 182 - 014,和most109 - 2811 - b - 039 - 525);中国医科大学、台湾(格兰特数字:CMU109-MF-09);长庚医疗研究基金会、台湾(格兰特数字:CMRPG5F0203、CMRPG5J0142 CMRPG5J0143)。

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