文摘
败血症仍然会导致死亡,往往通过心脏衰竭和线粒体功能障碍。饮食ω3多不饱和脂肪酸被防止心脏功能障碍和败血症杀伤力。本研究着手确定早期低幅度的脓毒症心肌线粒体功能改变了动物的美联储西式饮食和饮食二十碳五烯酸(EPA)政府是否保护心肌对脓毒症的危害和如果是寻求可能的影响机制。美联储一个老鼠分成两组ω3 PUFA-deficient饮食(“西方饮食,“DEF集团)或一个EPA-enriched饮食(EPA组)5周。每组分成两个子组:sham-operated老鼠和老鼠受到盲肠的结扎和穿刺(CLP)。在活的有机体内心脏机械功能检查,线粒体是收获,以确定其功能活动。氧化应激是评估与几个因素一起参与活性氧代谢的调节。脓毒症对心脏机械功能影响很小但强烈压抑DEF组线粒体功能。相反,饮食环境极大地保护线粒体通过减少线粒体基质的氧化应激。后者可能是由于增加解偶联蛋白质3表达,sham-operated已经见过的动物。CLP EPA组的老鼠也显示增加线粒体sirtuin-3蛋白表达可以强化氧化磷酸化的维护。饮食EPA预处理心脏对脓毒性损伤通过一些修改,保护线粒体的完整性。这种预处理可以解释饮食EPA在脓毒症的保护作用。
1。介绍
脓毒症,由于细菌污染,影响到每年3000万人,是全球死亡率的主要原因,与一些600万年度死亡(1]。由于贫穷的卫生,脓毒症的发病率更高在低收入和中等收入国家,与一个特定的风险免疫系统脆弱的人(新生儿,老年人,孕妇、住院的人,和艾滋病患者,肝硬化、癌症、肾病、糖尿病、等等)。然而,脓毒症也非常频繁的在工业化国家,是一个成本负担他们的医疗系统的发展对脓毒性休克时2]。
感染性休克是由骨(3)与脓毒症持续低血压(收缩期动脉压力低于90 mmHg)尽管适当的血管充盈,与异常组织灌注(乳酸酸中毒、少尿和不安的意识)。经常观察过程中抵抗抗生素治疗和触发致命multiorgan障碍。2010年,大约15%的法国发达脓毒性休克患者诊断为败血症,尽管死亡率逐渐降低的发生率与新治疗的进步,它仍然很高,39.5%的速度(4]。的幸存者,42%的患者显示至少一个疾病。重要的是,心脏衰竭占大约50%的死亡(5),心脏被感染的首选目标之一。然而,除了心跳的刺激发生在脓毒症的早期阶段6),检测到变化在心脏机械功能只有在重病患者使用最新技术(回波描记术,MRI):他们首先表现为舒张功能受损,而发展对降低收缩功能在最严重的情况下(7,8]。
治疗方法必须应用触发脓毒症后不久,后续的知识了解太少,疾病严重程度。心脏功能的确定不是一个精确的估算疾病严重程度的方法。它会有用一个心脏参数迅速影响即使在低幅度的脓毒症;选择治疗可以通过有效的评价支持这个参数在生理范围。
最近的假设提供了解释心脏中遇到干扰脓毒症包括细菌脂多糖。这些toll样受体结合激活NF -κB通路。NF -κB核迁移,引发急性炎症反应。释放的细胞因子,主要是肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1β),通过一种机制,抑制线粒体功能可能涉及严重的氧化应激和钙超载(9]。通过抑制氧化应激抑制能源生产的克雷布斯循环顺乌头酸酶(10)并激活炎症反应在一个恶性循环11]。这导致孔隙的渗透率过渡,线粒体的断开,hypocontractility [12,13),并通过细胞凋亡或坏死细胞死亡(14,15]。线粒体是肯定的一个重要目标在脓毒症的病因16]。
欧米伽- 3 (ω3)多不饱和脂肪酸(欧米伽)是已知的在几个心血管病理生理情况下包括缺血/再灌注(17,18),肥大(19),和心律失常20.)通过保护线粒体的完整性(17,18]。二十碳五烯酸(C20:5n3、EPA)是最著名的21,22]。在西方饮食omega - 3脂肪酸很少,太丰富的促炎ω6(欧米伽23]。动物研究使用ω3 PUFA补充清楚显示,这些脂肪酸在脓毒症(保护24- - - - - -26]。然而,这种保护机制还没有正确记录和可能涉及线粒体功能。
本研究着手(i)提前确定心脏线粒体的功能是改良的发生收缩dysfunctions-in早期低幅度引起的败血症盲肠的结扎和穿刺在西方饮食喂养的老鼠,(2)确定饮食二十碳五烯酸(C20:5n3、EPA)保护这些细胞器的完整性,和(3)寻求潜在机制负责观察效果。为此,老鼠的饮食缺乏ω3欧模型典型的西方饮食或一个富含EPA。心肌功能评估的几个特征:在活的有机体内心脏机械功能、线粒体代谢(耗氧率、ATP生产和活性氧释放),心脏磷脂脂肪酸组成,几个参数与氧化应激和炎症有关。我们假设(i)早期低幅度的脓毒症引起的炎症和破坏增加线粒体完整性在吃西式饮食的老鼠和(2)饮食环保署保护心脏线粒体相关矩阵通过减少氧化应激增加UCP3 SIRT3蛋白质表达。
2。材料和方法
2.1。伦理批准
所有实验遵循欧盟建议的护理和使用实验动物用于实验和科学。所有的动物工作是经当地动物实验伦理委员会批准(拉西'ethique倒l 'experimentation animale,奥弗涅),通知我们实验室的研究动物设施(授权。APAFIS # 2213 - 2016082409264678 v2)。研究符合到动物研究指南(27]。
2.2。实验大鼠和饮食
四十4女Wistar鼠(Janvier、Le Genest-Saint-Isle、法国)维护四个每笼照明、控制湿度和温度条件。经过一个星期的适应环境,老鼠被随机分配到两个饮食组4周。每个饮食包含(% )酪蛋白20日l42.4 0.3半胱氨酸,脂质5、淀粉、麦芽糊精12.7,蔗糖,纤维素5,3.5,矿物混合物混合维生素1,胆碱0.1。脂质分数包含大约2.25%的亚油酸(C18:2ω6、洛杉矶)。的脂肪酸成分表中给出的两个饮食1。第一组老鼠喂食ω3 PUFA-deficient饮食(DEF)。在第二组,0.625%的单不饱和脂肪酸(MUFAs)被二十碳五烯酸(C20:5所取代ω3、EPA)给一个ω6 /ω3 PUFA比3。
2.3。外科手术
喂养期间后,每个饮食组细分为两个相等的子组。在第一组,腹腔的盲肠被外部化,并立即重新定位(虚假的子组);第二,盲肠结扎和穿刺引起败血症(9月子组)。盲肠的结扎和穿刺(CLP)执行根据Toscano et al。28]。简单地说,老鼠与异氟烷麻醉(感应4%,维护2%)。毛剃须后,外部腹壁消毒酒精betadine和水平切口是在腹侧墙的水平盲肠进入腹腔。盲肠外部化,放在消毒外部腹壁。盲肠结扎在1厘米的顶点器官触发低强度脓毒症。两个穿孔然后通过结扎盲肠衬砌0.5公分的墙壁上的器官20量度针。软压力应用于结扎盲肠的一部分促进外化的digesta以外的器官。盲肠是插入之后立即进入腹腔,和丁丙诺啡(0.05毫克/公斤体重)皮下注射到脖子。腹膜随后关闭6.0的针脚缝合和皮肤缝合和金属夹。麻醉手术后,停了下来,老鼠被放置一个笼子在动物设施,他们醒来异氟烷撤军后3 - 5分钟。 The rats were then maintained in their cage for 48 h. The same diets as those given just before the surgical intervention were maintained during the postsurgery period.
确保脓毒症诱导,心脏收缩性是评价MRI(参见下面的段落)。我们观察到,CLP倾向于刺激心肌收缩性( )同样在两组之间的影响(cross-interaction饮食的 )。这显然表明,动物的两组人在脓毒症的初始高动力性的阶段(6]。
2.4。心脏核磁共振
最后48小时手术后的时期,在活的有机体内心脏功能和形态学评估核磁共振成像(MRI)。麻醉诱导麻醉框中使用5%异氟烷30/70%空气/氧气混合物。动物容易被定位在一个老鼠摇篮(设备Veterinaire Minerve, Esternay,法国),维持在1.5 - -2%异氟烷在1升/分钟空气/氧气流在核磁共振成像实验。老鼠的摇篮是设计用来定位磁铁。牙齿和耳朵酒吧安全系统安装以及线路的交付和清除麻醉气体,温度控制,呼吸和心电图(ECG)监测。温度保持通过摇篮使用热空气的流动。心电图信号并不是衡量在心脏成像,但记录在一些动物在电极提取和定位磁铁为回顾性图像重建估计心率。
在心脏磁共振成像、高分辨率电影磁共振成像(cine-MRI)进行力量117/16 BioSpec仪器配备了一个11.7吨(500 MHz)水平磁铁干扰一个皇冠三世控制台运行Paravision 6.0软件和屏蔽BGA 9 s梯度(力量BioSpin, Ettlingen,德国)。72毫米内径正交卷线圈(力量BioSpin, Ettlingen,德国)用于射频(RF)传输和MRI信号接收。核磁共振成像协议评估心肌功能是模仿人类的极震区左心室(LV)框架(29日]。的navigator-based self-gated快角度拍摄(IntraGate FLASH)明亮的血液用于电影心脏成像序列。十到十二获得连续的1毫米片覆盖被从基地到顶端。
图像分析,定位导航器片是平行于图像片,穿越集中到心脏和肺部最大化其灵敏度心肺运动。成像参数如下:重复时间(TR) / echo (TE) 6/2.5女士,翻转角度(FA) 8度,视野(FOV) ,矩阵 ,和切片厚度1毫米。四百重复进行收购整个原始数据集,和16个电影帧重建使用力量IntraGate重建算法,这是美联储的心率值(~ 400 bpm)记录前MRI和意味着动物呼吸频率估计参数。
图像分析是使用在自由段v2.1执行R5960软件(30.]。首先转化为图像DICOM格式之前加载到段软件细分使用内置的“另类左心室工具”算法。对于每一个老鼠,舒张末期容积(类别)和收缩末期容积(ESV)是全球最大和最小的首次发现左心室(LV)腔卷,分别以确保所有的片都在阶段。LV的半自动分割然后执行所述其他地方(31日]。简单地说,一个点第一次播种在LV血池的中心,适合的可变形模型的算法扩展向心内膜边界包括各种极震区片LV血池。根据需要进行手动调整之后主要为心内膜边界的心外膜边界一般和乳头肌出现分离心肌。中风卷( ),射血分数( ),心输出量( )计算从舒张和收缩末期卷。产品类别的时间曲线被用来推导出收缩和放松利率。
2.5。制备分离线粒体
结束的时候心脏MRI,大约200毫克的顶端的心冻结夹在液氮和存储−80°C为以后分析。提取线粒体如前所述[17]。心房,剩下的从心脏动脉被切断。心肌是碎用剪刀在寒冷隔离缓冲由甘露醇220毫米,70毫米蔗糖,拖把5毫米,和EGTA 2毫米,pH值7.4在4°C,脂肪无酸的血清白蛋白0.2%。心肌的碎片被多次冲洗过滤和均质Polytron搅拌器(0.4秒, )和包含15毫升Potter-Elvehjem组织磨床隔离缓冲a离心法后( ,10分钟、4°C)的上层清液subsarcolemmal线粒体被保存在冰。感冒颗粒resuspended在隔离缓冲B由氯化钾100毫米,拖把50 mM, EGTA 2毫米,pH值7.4在4°C,脂肪无酸的血清白蛋白0.2%。增加了蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶0.02%)1分钟消化在冰温度、肌原纤维和当时整个均质组织磨床(300 rpm, 3到4过渡)。之后,立即枯草杆菌蛋白酶行动停止通过添加隔离缓冲(30毫升)和离心法( ,10分钟,4°C)。浮在表面的丢弃,颗粒在隔离缓冲区b .匀浆resuspended当时离心机( ,10分钟,4°C),以及由此产生的上层清液与线粒体intermyofibrillar收集和过滤和其他上层清液。线粒体被离心法然后洗( ,10分钟,4°C)。线粒体的颗粒悬浮在冷隔离缓冲C由氯化钾100毫米,拖把50毫米,和EGTA 1毫米,pH值7.4在4°C, recentrifuged ( ,10分钟,4°C),最后resuspended约的浓度。15毫克/毫升。
2.6。呼吸测量
线粒体的耗氧量测量的速度在30°C的孵化室(Oxytherm OXYT1, Hansatech,国王林恩英格兰)Clark-type O2电极满1毫升的孵化介质(KH氯化钾125毫米,Tris-HCl 20毫米2阿宝410毫米,EGTA 1毫米,pH值7.2 30°C,脂肪无酸的牛血清白蛋白0.15%)。所有测量值都是通过线粒体(线粒体蛋白质0.2毫克/毫升)孵化与谷氨酸(5.5毫米)苹果酸(2.5毫米),palmitoylcarnitine (20μ米)苹果酸(2.5毫米),或琥珀酸(5.5毫米)鱼藤酮(2μ米)为基板(2)状态,在ADP 100毫米(3)状态和后来的寡霉素0.5μg / ml(4)状态。每个基质的pH值7.4严格固定在30°C。孵化介质维持在30°C和不断与内置电磁搅拌器搅拌和酒吧跳蚤。耦合的氧化磷酸化状态3 - 4呼吸率评估的比率,衡量的程度控制对氧化磷酸化(呼吸控制比例或软。Amplex®红(1μ米)和辣根过氧化物酶(5 U /毫升)被添加到培养基初的呼吸测量保持相同的实验条件的用于测量H2O2释放。
2.7。线粒体活性氧释放
线粒体活性氧的释放率是评估在相同条件下呼吸测量。它遵循线性增加荧光(激发在560 nm,排放在584海里)由于酶氧化Amplex®红色H2O2在辣根过氧化物酶的存在修改活动遵循由孤立的线粒体活性氧的生产速度在荧光计(Xenius XC、南非、摩纳哥)。线粒体蛋白质的反应条件是0.20毫克/毫升,辣根过氧化物酶5 U /毫升,1μM Amplex®红色与呼吸相同的基质和浓度测量。
2.8。基因表达
总RNA提取50毫克的心粉使用试剂盒®(热科学)根据制造商的指示。氯仿添加(0.2毫升/毫升的试剂盒®),样本混合和离心机为15分钟 在4°C。一个水相含有核糖核酸(RNA)收集,与异丙醇混合沉淀RNA和离心机( ,4°C, 15分钟)。使离心后,球是用乙醇70%(卷/卷),洗净晒干,悬浮在水中。RNA量化和完整性验证通过测量光密度的比例在260 nm和280 nm)和琼脂糖凝胶迁移,分别。互补脱氧核糖核酸合成了2μ使用高容量cDNA g的总RNA逆转录装备从应用生物系统公司(热费希尔科学、Asnieres-sur-Seine、法国)。逆转录的产品被用于定量实时聚合酶链反应(存在)使用特定的引物和Rotor-Gene SYBR绿色PCR大师混合Rotor-Gene Q系统(试剂盒、Courtaboeuf、法国)。信使核糖核酸(mRNA)量化使用本机cDNA和系列稀释的标准曲线。的心脏mRNA表达测定低氧诱导因子- 1 (HIF-1) sirtuin-3 (SIRT3),胞质Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD1),线粒体manganese-dependent超氧化物歧化酶(SOD2) interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),己糖激酶2 (HK2) phosphofructokinase-2 (PFK2),丙酮酸激酶muscle-type (11), M和H乳酸脱氢酶(LDH M和H)和丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)。引物序列和PCR条件展示在表2。一些看家基因测试(β肌动蛋白和次黄嘌呤phosphoribosyltransferase);β肌动蛋白最终选择的团体之间的稳定。
2.9。免疫印迹分析
组织地面三次在一个迷你珠搅拌器的裂解缓冲的消息灵通的50 mM,氯化钠150毫米,EDTA 10毫米,无水焦磷酸四元钠10毫米,β甘油磷酸盐25毫米,氟化钠100毫米,无水甘油1.086补充与磷酸酶抑制剂(西格玛奥德里奇,Saint-Quentin-Fallavier,法国)。连续离心进行收集和上层清液。蛋白质是量化使用bicinchoninic酸试验设备(热费希尔科学、Asnieres-sur-Seine、法国)。蛋白质免疫印迹,25岁μ克装载sds - page电泳分离的蛋白质和PVDF膜的转移。膜被适当的抗体免疫印迹检测的核因子k光多肽基因增强剂b细胞抑制剂α(我κBα)(# 9242)1:1000年,细胞信号,压敏电阻器anion-selective通道(VDAC)(# 4866) 1: 1000年,细胞信号,sirtuin-3 (SIRT3)(1: 500年,圣克鲁斯# sc - 365175),解偶联蛋白质3 (UCP3)(1: 200年,圣克鲁斯# sc - 31387), nitrosylated酪氨酸(1:1000年,热科学# 32 - 1900),乙酰化赖氨酸(1:1000年,细胞信号# 9441),和过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α(PGC-1α)(1:5000年,圣克鲁斯# sc - 13067)。检测到抗体绑定使用HRP-conjugated二级抗体和ECL免疫印迹基质(热费希尔科学、Asnieres-sur-Seine、法国)。免疫印迹是可视化使用化学发光成像系统(MF-ChemiBIS,医嘱能系统,耶路撒冷,以色列)并使用多计量化V3.2软件。检测nitrosylated蛋白质,蛋白质提取根据制造商的说明进行。几个管家蛋白包括α微管蛋白(σ1:1000 # 8203)和GAPDH (0.2μg / ml,σ# G9545)进行了测试,但没有一个稳定的四子组。然而,蛋白质微朱红色红色的稳定。因此决定与该参数规范化所有相关的蛋白质。
2.10。脂质分析
总脂质提取心脏组织根据Folch et al。32]。脂质提取(约。50毫克)准备使用4毫升chloroform-methanol (2: 1 )和1毫升0.9%氯化钠。磷脂分离后Sep-Pak墨盒,脂肪酸甲基酯是由气相色谱制备和分离(如前所述)(33]。
2.11。心肌氧化应激
线粒体SOD是化验使用商用设备(贝尔坦公司制药、Montigny-le-Bretonneux、法国)。
2.12。统计分析
结果给出了 。数据进行了双向方差分析(方差分析)描述的饮食和脓毒症的影响和它们之间的cross-interaction。必要的时候,意味着比较使用费舍尔最显著差异(LSD)测试。一个概率低于0.05被认为是显著的。使用摘要2007执行统计分析软件(摘要LLC, Kaysville UT)。
3所示。结果
3.1。通用数据
手术前身体重量的动物相似的四子组( , , ,和 DEF的骗局,DEF 9月,环保署骗局,环保局9月,分别)。手术会减少这些变量,但观察到的变化并不显著(数据未显示)。由于心肌的很大一部分是用于线粒体制备,这些老鼠的心脏重量不确定。
3.2。心脏磷脂脂肪酸组成
膜磷脂的脂肪酸成分起着至关重要的作用在调节心脏和线粒体功能不仅因为其参与合成前列腺素类也参与酶活动的调制通过膜流动性的改变。
现在饮食没有明显的修改中饱和脂肪比例的心脏膜(表3),但它的单不饱和脂肪酸C18:1下降ω9(−−16% 22%骗局和9月子组, )。虽然欧总额的比例不变,他们的个人资料大大改变了饮食。欧米伽的ω6系列被现在的饮食(减少虚假和−−19%和22%,9月子组, ),和ω3家人都相应地增加(+ 124 + 145%, )。花生四烯酸(ArA或C20:4ω6)及其代谢物(C22:4ω6和C22:5ω6)因此减少,环保局,C22:5ω3,C22:6ω三是大大增加( 所有的比较)。
脓毒症引起的磷脂脂肪酸的某些修改配置文件,只影响到欧米。DEF组,减少传染病的第一个代谢物ArA C22:4 (−−10% 10%ω6和C22:5ω6, )。EPA组病理总数的比例增加ω3欧,主要C22:6ω3 (+ 11 + 13%, )。
3.3。Sepsis-Induced心肌炎症
细菌脂多糖toll样受体和激活NF -链接κB通路。这个激活的特点是我的释放和退化κBα以及迁移的NF -κB一半细胞核和促炎细胞因子的诱导表达。减少我κBα测定心肌组织的四子组的动物(图1 (c))。饮食EPA并没有改变它的值在sham-operated动物,但增加后脓毒症(+ 103%, )而美联储9月动物DEF饮食。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
图1也描绘了膳食EPA和脓毒症对心脏的影响TNF -α和il - 1β信使rna表达。基因表达的肿瘤坏死因子-α(图1 (d))是不受败血症,但依赖于饮食PUFA摄入:大大减少了饮食EPA(−−56% 33%骗局和9月子组, 一般来说)。il - 1β信使rna表达(图1 (e))表现不同:它是大大增加了CLP DEF组(+ 530%, ),但不是在EPA组(−67%,NS,置信区间: )。
3.4。核磁共振研究
的在活的有机体内心脏形态和功能是由核磁共振(表4)知道这些参数是否足够敏感的早期低幅度的脓毒症和EPA治疗的影响。心脏形态学估计的舒张和收缩末期容量受饮食和手术的影响最小。这也是心脏功能的参数,包括射血分数、心率、心输出量和放松。然而,一个有趣的趋势指出收缩:脓毒症倾向于增加收缩速率在饮食组(+ 14%和+ 13% DEF和EPA组, ):然而,没有提到饮食效果。
3.5。线粒体功能
心脏线粒体后被立即收获牺牲来评估他们的能量代谢和活性氧释放(表5)来确定这些细胞器的功能被败血症和饮食EPA修改。主要的修改被观察到当谷氨酸/苹果酸作为衬底。DEF组,败血症减少国家3呼吸率(−42%, ),呼吸控制比(RCR) (−31%, ),和ATP生产速度(−37%, )。尽管H的基础利率2O2释放在州3和4的呼吸都不变,H的比率2O2释放的状态3呼吸率和H2O2释放ATP生产的速度是大大增加了脓毒症(分别+ 70 + 128% )。有趣的是,这些参数(状态3呼吸率、软、H2O2发布/状态3呼吸率,和H2O2发布/ ATP生产)的速度改变EPA-fed脓毒症的老鼠。
当琥珀酸/鱼藤酮或palmitoylcarnitine /酸盐作为基质,同样的趋势观察状态3呼吸和ATP生产,但没有显著的差异。然而,对于H2O2发布规范化状态3呼吸率或ATP生产,一般仍显著的差异就像那些观察谷氨酸/苹果酸为基质。
3.6。糖酵解酶mRNA表达
高葡萄糖氧化和低脂肪酸降解通常与心血管代谢相关配置文件(34,35]。表6总结了几个糖酵解酶的mRNA表达为了估计葡萄糖代谢。Sham-operated老鼠喂不同的饮食有相同的糖酵解酶mRNA表达除了丙酮酸激酶,它降低了EPA饮食(−30%, 通过单向方差分析)。丙酮酸脱氢酶激酶4基因表达也减少了EPA饮食(−62%, 通过单向方差分析)。脓毒症几乎没有影响糖酵解酶在DEF饮食大鼠mRNA表达:它往往只增加己糖激酶2基因表达(+ 41%, 通过单向方差分析)。相反,它强烈的表达下降几个酶在EPA饮食大鼠:磷酸果糖激酶2 (−41%, ),丙酮酸激酶(−61%, ),和肌肉(−37%, )和心脏(−60%,p< 0.01)乳酸脱氢酶。己糖激酶2和丙酮酸脱氢酶激酶4 mRNA表达也降低(−50%和77%,分别 通过单向方差分析)。线粒体赖氨酸乙酰化反映的速度β氧化(36]。在sham-operated动物,赖氨酸乙酰化表达式(图2)是减少饮食EPA (−66%, )。脓毒症降低DEF的赖氨酸乙酰化组(−48%, )但增加EPA组(+ 102%, )。
(一)
(b)
(c)
3.7。氧化和Nitrosative压力
在整个心肌氧化应激进一步评估通过确定SOD mRNA表达。胞质SOD1(图3(一个))增加EPA子组(+ 58 + 54%的骗局和9月子组, 一般)与DEF子组相比,但并不影响脓毒症。相比之下,线粒体SOD(图2的基因表达3 (b))降低了现在的饮食(−59%, )但这是重要的只有在9月小组(−76%, )。这个参数不受DEF组败血症。总线粒体SOD活性(图3 (c))不会受到饮食,但增加了脓毒症(DEF + 19% + EPA组, )。
(一)
(b)
(c)
线粒体蛋白质的亚硝基化作用强度呈现在图4。Sham-operated EPA组的动物表现出较低程度的亚硝基化(−55%, )比美联储DEF饮食。脓毒症这个参数在DEF组减少(−26%),但增加在EPA组(+ 51% CI: )。最后,败血性EPA饮食组的老鼠表现出更高程度的线粒体蛋白质亚硝基化(+ 54%, )比DEF-fed老鼠。
(一)
(b)
(c)
3.8。HIF-1和SIRT-3基因表达式
活性氧(ROS)在线粒体基质中已知调节低氧诱导因子- 1的表达式(HIF-1)和sirtuin-3 (SIRT3) [37]。由于线粒体DEF集团似乎过量的活性氧,这两个蛋白的基因表达从而评估在整个心肌。HIF-1 mRNA表达(图5(一个))是影响饮食和类型的手术。EPA饮食中强烈的存在减少了基因表达的参数(−−44% 40%骗局和9月子组, )。脓毒症也降低效果(−−33% 29% DEF和EPA组, )。
(一)
(b)
SIRT3 mRNA表达(图5 (b))不同的发展越来越影响的饮食环境保护局(+ 61 + 51%的骗局和9月子组, )并没有明显的脓毒症的影响。
3.9。线粒体解偶联蛋白质3 (UCP3) Sirtuin-3 (SIRT3)和心肌压敏电阻器阴离子通道(VDAC)表达式
UCP3已知调节线粒体氧化和nitrosative压力(38]。图6 (c)显示了线粒体UCP3表达。饮食环境大大增加了这种蛋白质的表达无论手术(+ 207%, )。脓毒症并不影响这种蛋白质的表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
线粒体sirtuin-3蛋白表达(图6 (f))是影响饮食和类型的手术。sham-operated子组,其内容较低时的饮食富含EPA (−39%, )。脓毒症诱导相反的影响根据膳食条件(CI:这个参数 )。检查这个重要cross-interaction更密切,单向方差分析描述脓毒症的影响表现在每个饮食组:DEF组败血症的影响不显著(−25% NS),但在EPA组,脓毒症显著增加蛋白质的量(+ 60%, )。
心肌线粒体是评估的内容估计线粒体压敏电阻器阴离子通道的蛋白质含量(VDAC)在整个器官和孤立的细胞器。在心肌组织(图6(我)增加了),VDAC现在饮食(+ 43%, )。的增加虚假的老鼠很低(+ 8%,NS),但在CLP组尤为明显(+ 87%, )。重大cross-interaction表明VDAC往往减少了DEF组败血症(−20% NS),但增加了EPA组的病理(+ 39%, )。
在孤立的线粒体,VDAC内容不受饮食和外科手术(数据没有显示)。
因为所有这些结果表明增加EPA组的感染性心肌线粒体含量,PGC-1α蛋白表达是决定在不同的子组。结果表明,膳食和外科干预没有修改这种蛋白质的表达(数据没有显示)。
4所示。讨论
本研究着手(i)提前确定心脏线粒体的功能是改良的发生收缩dysfunctions-in早期低幅度引起的败血症盲肠的结扎和穿刺在西方饮食喂养的老鼠,(2)确定饮食二十碳五烯酸(C20:5n3、EPA)保护这些细胞器的完整性,和(3)寻求潜在机制负责观察效果。我们发现感染性动物吃西式饮食显示降低线粒体氧化磷酸化虽然心脏机械功能还没有减少。这是与线粒体氧化应激增加有关。饮食环保局对心脏保护通过减少线粒体氧化应激对这些变化,这可能与增加线粒体UCP3 SIRT3和表达式。
4.1。膳食模式的理由
在目前的研究中,脓毒症的影响,研究了在两个不同的截然不同的饮食喂养的老鼠的数量欧。第一个人口是美联储的饮食欧米是严格的ω6(亚油酸)。因此这个减肥法是缺乏ω3欧。它模仿西方饮食的一些特性,特点是过度摄入ω6欧和不足ω3 PUFA的摄入量。在工业化社会中,饮食的比率ω6欧米ω3欧米15,但世界卫生组织建议比率接近4 - 5。环境保护署的一个ω3环氧酶和脂氧合酶的底物,因此添加到第二个饮食。
饮食环境下降ω6欧米心磷脂,即C22:4花生四烯酸ω6,C22:5ω6,增加长链ω3 (C22:5和欧米伽C22:6ω3)。这些修改经典观察时ω6 PUFA-based饮食丰富ω3(欧米伽17,18,39]。PUFA ( )水平的磷脂膜流动性的相对恒定保持稳定。然而,有一个永恒的更新酰基半个宪法的这些复杂的脂质。它是由于活动的磷脂酶A1和A2 deacylate磷脂。由此产生的溶血磷脂是由lysophospholipid立即reacylated酰基转移酶植入酰基酰coa的半个这些分子。欧米伽的ω6系列和ω3家族争夺这些酶。介绍ω3欧的饮食从而诱发降低ω6欧和增加ω3欧米心脏膜。
4.2。研究的局限性
最大败血症持续时间是48 h和微生物感染的强度很低(结扎在盲肠的顶端只有1厘米)。败血症仅限于这个严重性(i)动物的福利,满足当地伦理委员会的要求对实验动物的使用和护理,我们的实验室和动物福利的细胞(2)限制动物死亡,所以有足够的样本容量验证统计分析。显然,结果局限于这段时间均短,低幅度的败血症和不允许外推到其他的情况。
4.3。饮食和外科手术对心脏机械功能
MRI心脏机械函数估计的有生命的动物和异氟烷麻醉。异氟烷的比例是严格管制的呼吸节奏。动物的体温(37°C)也严格控制通过调节气流的温度进入肺部。
我们的模型的脓毒症对心脏形态和功能几乎没有影响。脓毒症对心脏功能有不同的影响根据病理的严重性:脓毒症早期增加心率(6,40]对抗全身性低血压中遇到这种情况(41]。严重脓毒症,心脏舒张障碍发生(8]。最后,对感染性休克与进化,收缩障碍出现(7]。早期低幅度的脓毒症诱导在我们的研究没有引起预期增加心率发生在高动力性的阶段的病理。然而,收缩的速度往往是增加两组(+ 13%, ),暗示可能低血压的代偿机制。CLP的啮齿动物,体温下降(42]。在我们的研究中,体温维持在37°C在MRI测量。因为我们人为地增加了温度,刺激的速度收缩可能发生而不是增加心率。
4.4。饮食和外科手术对线粒体功能
sham-operated老鼠,EPA-induced膜磷脂脂肪酸组成的变化影响了心脏线粒体。氧化磷酸化是不变,但有几个因素与氧化应激相关的改变。亚硝基化的线粒体蛋白质被环保局下降。这表明减少衰减活性氧(ROS)生成。此外,SOD2 mRNA表达往往是减少在这个集团(−40%, )。SOD2的线粒体酶,降低它的mRNA表达与较低的蛋白质亚硝基化表明,ROS浸渍线粒体基质的减少。的ω3 PUFA-related减少线粒体氧化应激是至关重要的在调节氧化磷酸化:ROS可以阻止克雷布斯循环通过抑制顺乌头酸酶(43]。EPA-induced减少线粒体ROS浸渍可以提高氧化磷酸化。这种现象是与重要的中间代谢的变化。赖氨酸乙酰化反应的强度β氧化率(36)是由美国环保署的饮食减少,表明低脂肪酸氧化。此外,丙酮酸脱氢酶激酶4 mRNA表达降低了ω3 PUFA。因为这种酶抑制丙酮酸脱氢酶,这一发现表明,丙酮酸的氧化脱乙酰辅酶a的线粒体基质加快。最后,饮食EPA似乎底物氧化转向心血管模式特点是高葡萄糖氧化和低脂肪酸降解[34,35]。
脓毒症强烈压抑心脏线粒体的氧化磷酸化DEF-fed动物建模人类西方饮食,虽然心脏机械功能退化尚未观察到。通过无氧糖酵解补充能源生产可能发生。与氧化应激增加异常线粒体活动有关。这是通过分离线粒体的行为:他们显示H的比率增加2O2生产氧化磷酸化的底物使用。这表明活性氧释放总是以同样的速率更高的能源生产。线粒体氧化应激中遇到这些大鼠的心肌可以解释减少氧化磷酸化:ROS和钙是公认的效应器的线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)[44]。注射的mPTP药物打开允许释放小型水溶性实体( )从线粒体基质,即NADH和腺嘌呤核苷酸,这个版本减少线粒体氧化磷酸化(17]。sepsis-induced赤字在线粒体能量转化为一个减少生产线粒体蛋白质乙酰化反映了下降β氧化率。丙酮酸氧化并不是增加补偿(糖酵解酶mRNA表达不变)。线粒体氧化应激也解释了il - 1的增加β心肌的mRNA表达:炎性细胞因子表达的线粒体ROS,可以触发线粒体氧化应激在一个恶性循环45]。CLP后毒性从而一定程度上是由于炎症,这可能导致的促炎的积累ω6在膜磷脂(欧米伽23,46]。
在动物美联储现在的饮食,心肌线粒体的氧化磷酸化没有抑郁的脓毒症。确定的低SOD2 mRNA表达和孤立的线粒体活性氧释放,EPA-induced保护是由于减少氧化应激的矩阵。这种情况允许(i)维护氧化磷酸化通过注射预防mPTP药物打开,(ii)维护的中间代谢的强度增加β氧化率尽管明显降低糖酵解建议减少基因表达的酶直接参与糖酵解途径(HK2和11),和(3)减少炎症反应的特点是疲软的NF -κ和减少il - 1 B途径β基因的表达。这突显了EPA对脓毒症的心血管效应,这是有据可查的文献中众多人类研究[47- - - - - -62年]。
VDAC是至关重要的维持一个高氧化磷酸化,由于孔隙由这种蛋白质允许进出溶质通过线粒体外膜。其在整个心肌表达增加了膳食EPA感染性子群,虽然这是不变的线粒体。这表明线粒体密度增加。然而PGC-1α没有过表达,表明线粒体生物起源是不变的:因此可能放缓了mitophagy降低氧化应激,导致nitrosylated蛋白质的逐步积累。从长远来看,这可能是有害的对心脏和解释一些人类研究描述缺乏EPA-induced心脏保护(62年- - - - - -64年[]甚至负面影响65年,66年]。
4.5。饮食EPA心血管效应的机制
4.5.1。饮食EPA Sham-Operated动物
我们的研究表明,饮食EPA增加线粒体UCP3的内容。这样的观察已经注意到在C2C12细胞(67年]。降低矩阵的氧化应激引发的EPA-enriched心里观察线粒体UCP3增加内容(68年]。UCP3允许维护的氧化代谢69年]:UCP3表达促进矩阵驱逐脂肪酸,减少他们的退化β氧化途径。因此,更高的matrix-free辅酶a内容可用丙酮酸氧化。假定UCP3-related降低线粒体酰coa内容也可以考虑减少矩阵氧化应激这些有毒的脂质积累有利于已知的线粒体ROS生产(70年]。这一现象与增加SIRT3和减少HIF-1 mRNA表达。贝尔et al。37)报告主要在小鼠胚胎成纤维细胞,减少氧化应激诱导减少HIF-1矩阵α表达式。EPA减少矩阵氧化应激和预处理的心肌mRNA表达。线粒体功能时以孤立的细胞器,没有观察到线粒体功能变化除了EPA-induced增加呼吸控制比(RCR)当palmitoylcarnitine /苹果酸盐被用作基质(+ 38%, )。众所周知,UCP3-induced减少氧化应激和脂质氧化:ROS注射打开mPTP药物和有利于质子漏44),这降低了软。EPA-related ROS清除活动提高了软,但增强仅限于产生的活性氧β氧化途径。蛋白质和/或基因表达的变化可能在sham-operated动物的心肌构成预处理允许EPA-induced心脏保护在脓毒症。
4.5.2。饮食EPA在感染性动物
较低的氧化应激的线粒体基质EPA-fed老鼠维持在脓毒症。它允许(我)生产、减少炎性细胞因子(2)注射的维护mPTP药物在一个封闭的配置的在活的有机体内情况,和(3)维护的高氧化磷酸化维持心脏机械功能。
在这个模型的早期败血症,UCP3表达式仍然是高动物接受环保局的心脏线粒体。这是与亚硝基化蛋白质增加有关。一个UCP3-induced减少氧化应激赞成增加nitrosative压力已经描述了高活性氧的生产条件下(38]。减少氧化应激的注射防止mPTP药物打开和青睐的维护氧化磷酸化。我们的研究首次表明,线粒体的nitrosative压力更少的有害的氧化应激早期败血症的这些条件。此外,线粒体,SIRT3也增加。在压力条件下,这河畔+端依赖脱乙酰酶是易位到细胞核和线粒体71年]。在细胞核中,组蛋白脱乙酰酶限制NF -据报道κB激活(72年]。因此限制了炎症过程(73年)和线粒体基质的氧化应激有关。这种效应可能会使高表达,SIRT3激活几个参与活性氧清除酶活性(74年]。此外,增加蛋白质乙酰化作用观察感染性线粒体的EPA组显示的刺激β氧化途径。蛋白质乙酰化有很强的监管影响几个线粒体酶(75年):那块通过抑制丙酮酸葡萄糖和脂肪酸氧化,非常长链酰coa,和长链酰coa脱氢酶,但它会刺激enoyl-CoA水合酶/ 3-hydroxyacyl-CoA脱氢酶(76年),可能导致两亲性,也许有毒3-ketoacyl-CoA的积累。通过作用于有限数量的关键酶,SIRT3能够克服这些有害的影响通过脱乙酰作用相关蛋白(77年):因此允许高的维护β氧化和氧化磷酸化。
4.6。结论(见图7)
脓毒症诱发心脏线粒体功能失调吃西式饮食的老鼠在收缩异常。他们的特点是氧化应激和氧化磷酸化的影响。饮食EPA和/或其延伸产品(DPA和DHA)产生一个强大的保护作用,定义的缺失或延迟的炎症和维护能量代谢的生理范围。的原因ω3 PUFA-induced抗炎效应是低渗线粒体ROS疑似与增加UCP3和SIRT3表达式。这些影响已经出现在生理情况下通过信使rna表达的变化,心肌的先决条件。他们可以解释抗脓毒症。n - 3欧的抗氧化效果一直定期观察短期政府(直到10周)后的脂肪酸(78年- - - - - -80年]。然而,Firuzi et al。81年)注意倾向增加循环8-iso-PGF2α浓度和降低红细胞谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活动持久扩张型心肌病患者治疗6个月后。因此有必要做进一步调查以确定是否长期管理的n - 3欧抗氧化和消炎作用。此外,未来的研究与人类心脏线粒体是现在需要确认保护期间观察大鼠早期败血症。
缩写
| ArA: | 花生四烯酸 |
| ADETEC: | 外科协会的发展和增强心血管疾病的筛查和治疗技术 |
| ADP: | 二磷酸腺苷 |
| 艾滋病: | 急性免疫缺陷综合症 |
| 方差分析: | 方差分析 |
| 到达: | 动物研究:报告在活的有机体内实验 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| CaCl2: | 氯化钙 |
| 互补脱氧核糖核酸: | 互补脱氧核糖核酸 |
| 辅酶a: | 免费的辅酶 |
| 有限公司2: | 二氧化碳 |
| Cu-Zn: | 铜-锌 |
| DEF: | ω3多不饱和脂肪酸acid-deficient饮食 |
| DHA: | 二十二碳六烯酸 |
| 日本: | 医学数字成像和通信 |
| : | 线粒体膜电位 |
| : | 最大的增长速度在左ventricular-developed压力 |
| : | 最大下降率在左ventricular-developed压力 |
| 心电图: | 心电图 |
| 发射极耦合逻辑: | 增强化学发光 |
| EDTA: | 乙二胺四乙酸 |
| 产品类别: | 舒张末期容积 |
| EGTA: | 乙烯glycol-bis (2-aminoethylether)N,N,N ,N - - - - - -四乙酸 |
| 环保局: | 二十碳五烯酸 |
| ESV: | 收缩末期容积 |
| FADH2: | 还原型黄素腺嘌呤二核苷酸 |
| FFC: | 法国心脏病联合会 |
| FoxO3a: | Forkhead盒子O3转录因子 |
| 收紧: | 铁降低抗氧化能力 |
| 盐酸: | 盐酸 |
| 玫瑰: | (4)- 2-Hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸 |
| HIF-1: | 低氧诱导因子- 1 |
| H2O2: | 过氧化氢 |
| 合: | 辣根过氧化物酶 |
| HSE: | 雨果·萨克斯Elektronik |
| il - 1β: | Interleukin-1β |
| 氯化钾: | 氯化钾 |
| KH2阿宝4: | 磷酸二氢钾 |
| 拉: | 亚油酸 |
| 迷幻药: | 最小显著性差异 |
| LV: | 左心室 |
| MgSO4: | 硫酸镁 |
| 拖把: | 3 - (N吗啉代)propanesulfonic酸 |
| mPTP: | 线粒体通透性转换孔 |
| 先生: | 核磁共振 |
| 核磁共振成像: | 磁共振成像 |
| 信使rna: | 信使核糖核酸 |
| MUFA: | 单一不饱和脂肪酸 |
| 生理盐水: | 氯化钠 |
| 兆瓦: | 分子量 |
| NADH: | 还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸 |
| NaHCO3: | 碳酸氢钠 |
| NF -κB: | 核因子kappa-B |
| 摘要: | 统计人员统计软件 |
| O2: | 氧气二氧化碳 |
| ω: | ω |
| PUFA: | 多不饱和脂肪酸 |
| PVDF: | 聚乙二烯二氟化物 |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应 |
| 软: | 呼吸控制的比例 |
| RNA: | 核糖核酸 |
| ROS: | 活性氧 |
| 9月: | 败血性 |
| sds - page: | 聚丙烯酰胺凝胶电泳的变体 |
| 扫描电镜: | 平均数标准误差 |
| SIRT3: | Sirtuin-3 |
| SV: | 体积收缩 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| TBARS: | 硫代巴比土acid-reactive物质 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α |
| UCP3: | 解偶联蛋白质3 |
| VDAC: | 压敏电阻器anion-selective通道。 |
数据可用性
在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
信息披露
完全的责任作者和内容并不一定代表官方观点的性状研究的研究所,法国心脏病联合会和ADETEC。
的利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。
作者的贡献
蒂博莱热、Kasra Azarnoush,让•保罗•Rigaudiere Chrystele Jouve, Damien布维耶,文森特沙平,吕克·Demaison导致了技术方面的研究。特拉奥雷Amidou Guilhem页面和露西Cassagne导致核磁共振数据的采集和分析。布鲁诺•佩雷拉执行统计分析。让-玛丽•波尼,Kasra Azarnoush,吕克·Demaison导致的研究概念和设计,分析和解释数据。Luc Demaison写手稿,Kasra Azarnoush重新审视它批判性和最终批准出版的版本。
确认
这项工作得到了法国心脏病联合会(FFC)和外科协会的发展和增强心血管疾病的筛查和治疗技术(ADETEC)。作者热情地感谢工作人员的实验单位动物营养研究所的性状研究Theix / Saint-Genes-Champanelle动物保健。他们也想谢谢理查德·瑞恩编辑稿件。