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氧化医学与细胞寿命
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氧化医学与细胞寿命/2019/文章
特殊的问题

天然产品：通过调制氧化还原平衡来优化癌症治疗

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研究文章|开放获取

体积 2019 |文章的ID 9165784 | https://doi.org/10.1155/2019/9165784

Tomasz Kowalczyk, Przemysław Sitarek, Ewa Skała, Patricia Rijo, Joana M. Andrade, Ewelina Synowiec, Janusz Szemraj, Urszula Krajewska, Tomasz Śliwiński那 “提取物对dna保护作用的评价menyanthes trifoliataL.植物来源体外与氧化还原平衡和其他生物活动相关的培养＂,氧化医学与细胞寿命那 卷。2019那 文章的ID9165784那 13 页面那 2019． https://doi.org/10.1155/2019/9165784

提取物对dna保护作用的评价menyanthes trifoliataL.植物来源体外与氧化还原平衡和其他生物活动相关的培养

托马斯Kowalczyk那1 Przemysławsitarek.那2 ewaskała.那2 Patricia Rijo.那3.那4. 琼娜·m·安德雷德那3. Ewelina Synowiec那5. Janusz Szemraj.那6. Urszula Krajewska.那7. 和 Tomaszśliwiński5.

1Lodz大学，Banacha 12/16,90-237 Lodz，波兰的分子生物技术和遗传学系

2罗兹医科大学生物和药用植物学系，Muszynskiego 1,90 -151，波兰罗兹

3.生物科学和健康技术研究中心（CBIOS），媒体艺术德·葡萄牙1749-024 1749-024

4.Instituto deInvestgaçãodo Medicalyo（Imed.ulisboa），Faculdade deFarmácia，Lisboa大学，葡萄牙1位Lisboa，1649-003

5.Lodz大学，Pomorska 141/143，90-236 Lodz，波兰，罗兹大学医学遗传学实验室

6.罗兹医科大学医学生物化学系，Mazowiecka 6/8,92-215 Lodz，波兰

7.罗兹医科大学分子生物学实验室药物生物化学系，波兰罗兹，Muszynskiego 1,90 -151

学术编辑：Gabriele Saretzki
已收到 2019年3月4日
公认 2019年8月24日
发表 2019年10月16日

摘要

menyanthes trifoliata是在欧洲、北美和亚洲发现的一种有价值的药用植物，生长在泥炭沼泽和沼泽中。在民间医学中，它长期被用来治疗各种疾病。这是第一次报道从植物的地上部分(MtAPV)和根(MtRV)提取的水乙醇提取物具有保护抗氧化和抗炎作用在体外生长的植物在人脐静脉内皮细胞（Huvecs）上。它描述了测试提取物对抗氧化剂表达的影响（HO-1，NQO1，NRF2那keap1.， 和GCLC)及炎症相关基因(il - 1α那il - 1β那il - 6那肿瘤坏死因子-α， 和干扰素-γ）在用h刺激的细胞中2O.2或LPS分别。此外，M. Trifoliata.发现提取物适度影响某些细菌和真菌病原体的生长，具有最强的抗菌作用假单胞菌铜绿假单胞菌和肠球菌粪便器．M. Trifoliata.对ROS引起的线粒体DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)损伤具有保护作用，减少了线粒体DNA损伤的数量ND1.和ND2.基因和NDNA损坏TP53和HPRT1基因和降低PARP1-和γ.-H2A。X-positive细胞。根提取物体外M. Trifoliata(MtRV)似乎有更好的抗炎、抗氧化、抗菌和保护性能从地上部分(MtAPV)。这些生物性质的差异可能是由于MtRV中所选择的酚类化合物和白桦酸的含量高于MtAPV提取物。

1.介绍

几千年来，植物促进健康的特性一直被用于预防和治疗许多人类疾病。目前，据估计全世界有30万种植物[1];然而，很少有研究证实其具有治疗或保护作用。幸运的是，现代的方法和设备可以更快、更准确地分析隐藏在植物中的资源。众所周知，它们能合成大量的代谢物，这些代谢物起着重要的作用，包括防御食草动物、其他植物或病原体，其中一些可成功用于一般保健[2-5.］．多酚是一类极有价值的植物次生代谢物，它能使植物对应激剂做出反应。当这些天然化合物通过水果、蔬菜、茶或药用和烹饪药草的饮食吸收时，它们在人体的抗氧化保护中发挥着关键作用，并被认为对降低癌症或心血管疾病的风险有显著影响[6.］．因此，需要在自然界中具有富含这些化合物的富含来源，并研究其生物学性质。

menyanthes trifoliata薄荷科，提供了很多前景。这种药用植物，通常被称为Bogbean，产于北半球，主要在欧洲、北美和亚洲的环极地温带[7.］．在传统和民间医学中，它的叶子被用来治疗食欲不振、坏血病、发烧和皮肤疾病。提取得到在体外还发现该植物的培养物在胶质瘤细胞中诱导细胞凋亡[8.］．对其代谢物的生物学特性进行了研究[9.那10，他们的结果表明M. Trifoliata.是酚类或黄酮酚的来源[11]其中一些，其中一些，例如酚醛酸，微肽，芦丁或逻辑蛋白，可能具有潜在的医学应用[12-14］．

这项工作的目的是确定抗氧化，抗炎，抗菌和dna保护作用的地上部分和根提取物menyanthes trifoliata植物生长在在体外施森克和希尔德贝特（SH）培养基的文化与各种其他生物学特性。

2.材料和方法

2.1。植物材料

在体外射击M. Trifoliata.如前所述从种子中建立[8.］．在本研究中，幼叶，根和茎用于芽再生。将外植体培养为0.8％琼脂 - 凝固的Schenk和Hildebrandt（Sh）培养基，其补充有1.0mg / L 6-苄基腺嘌呤（6-Ba）和0.1mg / L.α.- 下列条件下的 - 萘酰基乙酸（NAA）：16/8小时光/暗光周期;光强度，40μ.摩尔米-2S.-1；和温度,26°C。14 d后外植体表面出现浅绿色愈伤组织;转移到含4.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L NAA的SH培养基上诱导芽。4周后，将愈伤组织的芽转移到添加0.3 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA的SH生根培养基上。两周后，将有根的幼苗转移到不含生长调节剂的SH固体培养基中，在上述条件下培养。在M. Trifoliata体外，传播步骤如图所示1（a）-1（d）．

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图1
后续阶段menyanthes trifoliata再生。(a)根在1.0 mg/L (6-BA)和0.1 mg/L (NAA)的SH培养基上培养20天后愈伤组织形成。(b)在含4.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L NAA的SH培养基上再生芽。第四周的孵化期(c)有根幼苗在添加0.3 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA的SH培养基上生长，然后转入新鲜的固体SH培养基。(d)再生植株在不含生长调节剂的固体SH培养基上生长5周。 ．
2.2。M. Trifoliata.地上部分和根提取物制备

从植物的地上部分和根部提取M. Trifoliata.植物生长在体外根据Sitarek等人制备[15］．简而言之，使用10g的空中零件和根的干重进行萃取。将植物材料用80％萃取15分钟（ / )甲醇水溶液(500 mL)在35°C超声波浴，然后用300 mL相同的溶剂浸泡15分钟。最后将提取液过滤，减压蒸发，冷冻干燥，然后在黑暗中保持干燥，直到进一步使用。收益率( / ）提取物为空中零件（MTAPV）和根（MTRV）的初始植物干重的52.8％和50.4％M. Trifoliata.植物分别。

２.３.植物提取物的植物化学分析M. Trifoliata.地上部分和根部

根据Kowalczyk等人的研究，MtAPV和MtRV提取物采用高效液相色谱(Dionex, Sunnyvale, USA)检测酚类化合物和白桦酸。[8.］．

2.4。细胞培养物

所有实验均在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上进行。这些细胞购自Gibco (Cascade Biologics®，目录号C0035C)，在培养基200 (Gibco，目录号M-200-500)中培养，并添加低血清G生长补充试剂盒(LSGS Kit;Gibco，目录编号S003K)在37°C和5% CO2在培养箱(Galaxy®170 R-CO2孵化器，新的不伦瑞克科学）在一个潮湿的氛围下。

2.5。细胞活力

采用MTT法测定不同浓度LPS或H处理的HUVECs的活力2O.2和MTRV和MTAPV提取物M. Trifoliata.植物生长在体外．简而言之，将细胞接种在 在96孔培养板中每孔的细胞并在治疗附着之前过夜。用MTRV和MTAPV提取物在浓度范围内孵育24小时，浓度范围为0-5mg / ml。炎症过程用1开始μ.G / ml LPS，分别，用50次刺激抗氧化反应 μ.M H2O.2．在下一次实验中，将细胞与1mg / ml MTRV和MTAPV提取物一起温育或用LPS或H预处理2O.2然后用植物提取物处理24小时。孵育完成后，细胞洗一次，用0.5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯溴化四唑(MTT)在37℃孵育4小时。然后小心地取出MTT和DMSO (100μ.L)加到每口井中。将混合物在低速下旋转5分钟，使蓝色晶体完全溶解。使用BioTek Synergy HT微孔板阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)在570 nm处测量吸光度，在630 nm处测量参比。独立实验重复三次。细胞存活率以相对于未处理(对照)细胞的百分比表示，对照组的定义为100%。

2.6。基因表达

首先在LPS或H存在下培养HUVEC2O.2持续1小时，然后用1mg / ml MTRV和MTAPV提取物24小时。然后根据制造商的说明，使用分离物II RNA迷你试剂盒提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒从总RNA合成cDNA。将1ng总RNA的样品用作总体积为10的模板μ.L，遵循制造商的说明。接下来，通过Taqman探针的实时PCR测定分析基因表达。Taqman探针（Life Technologies）用于分析10个基因（HO-1那NQO1、kAEP1那GCLC那il - 1α那il - 1β那il - 6那肿瘤坏死因子-α， 和干扰素-γ)和β肌动蛋白(ACTB）被包含作为参考基因。使用Taqman®实时PCR主混合物（Life Technologies）和CFX96™实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）进行QRT-PCR，用于CFX Manager™软件（版本3.1）．热循环条件如下：10分钟的聚合酶活化在95℃下，然后在60℃下在95℃和60℃下的30℃和60℃的60℃下的40个循环。每个样品一式三份运行。使用该基础表达水平计算 方法 [16］．

2.7。核DNA (nDNA)损伤和线粒体DNA (mtDNA)损伤的测定

将总基因组DNA（核和线粒体）与用1mg / ml MTRV和MTAPV提取物处理的细胞分离24小时，然后用50个处理μ.M H2O.2根据制造商的说明，使用Qiaamp DNA Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA）使用Qiaamp DNA Mini Kit（Qiagen，Valencia）。通过分光光度测量测量260nm的光度测量测定DNA浓度，并且使用Biotek Synergy HT微板读取器（Biotek Instruments，Winooski，VT，USA）计算纯度通过A260 / A280的比率计算。如前所述，使用半组经频定量RT-PCR（SLR-QRT-PCR）来评估线粒体DNA（MTDNA）和核DNA（NDNA）损伤，有一些修改[17］．先前描述了所有条件[18］．

2.8。细胞质ROS和线粒体ROS检测

将细胞与1mg / ml MTRV或MTAPV一起温育24小时，然后用50℃温育μ.M H2O.2一小时。DCFDA (molecular probe, Life Technologies)染色检测细胞质ROS。DCFDA稀释至5μ.mol/L终浓度与汉克斯平衡盐溶液(HBSS)， 37℃与细胞孵育30分钟。用MitoSOX红线粒体超氧化物指标测定线粒体ROS的产生。指示剂被稀释到5分μ.mol/L的HBSS终浓度，37°C孵育细胞30分钟。用HBSS冲洗细胞三次。使用BioTek Synergy HT酶标仪测量荧光发射。每个样品一式三份运行。

2.9。细胞磷酸化H2A.x分析和切割PARP水平

HUVECs被镀在一个六孔板上，密度为 可行的细胞。次日，用MtRV和MtAPV提取物(1 mg/mL)处理细胞24 h，再用50 μ g/mL孵育μ.M H2O.2一小时。孵育后，收集细胞，磷酸化H2A。采用细胞凋亡、DNA损伤和细胞增殖试剂盒(BD Pharmingen, 562253)，按照厂家提供的方案检测X-和裂解parp阳性细胞。使用FACSCanto II细胞分析仪(Becton Dickinson, San Jose, California, USA)分析细胞。

2.10。抗菌活性

测试以下菌株：金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923),肠球菌粪便器(ATCC29212),大肠杆菌（ATCC 25922），假单胞菌铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和酵母白色念珠菌(写明ATCC 10231)和酿酒酵母(写明ATCC 2601)。所有被测试的微生物的生长条件已经由Sitarek el al描述过。[19］．本研究采用MtRV和MtAPV提取物。所测提取物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌/杀真菌浓度(MBC或MFC)的测定如前所述[19］．

2.11。数据分析

采用GraphPad Prism 5进行统计学分析。本研究中所有实验值均表示为 (SD)。采用夏皮罗-威尔克检验分析结果分布的正态性。然后，使用Levene检验对结果进行方差相等性分析。使用多重比较的方差分析检验确定显著差异，然后进行Dunnet后HOC.测试。

3.结果

３.１.植物地上部分(MtAPV)和根系提取物(MtRV)的化学组成M. Trifoliata.植物

先前已在MTRV和MTAPV提取物中鉴定出以下酚类化合物：绿原酸（177和258μ.G / g干重分别，鞣酸（518和451 μ.G / G干重，可接受的），锡丁酸（146和71μ.分别为G / G干重)、丁香酸(114μ.G / g干重和未检测到），芦丁（256和153 μ.G / G干重)，五环三萜白桦酸(5437和395μ.G / G干重分别）[8.］．植物提取物的主要成分在表中呈现1．
化合物 MtRV MtAPV
μ.g / g干重
桦木酸
绿原酸
鞣花酸
芦丁
Sinapinic酸
Syringic酸 留言。
表格1
选择地上部(MtAPV)和根(MtRV)的次生代谢产物menyanthes trifoliata植物生长在体外[8.］．
3.2。MTAPV和MTRV提取物对细胞活力的影响

我们的结果表明，MTRV和MTAPV提取物M. Trifoliata.在测试浓度(0-5 mg/mL)的人脐静脉内皮细胞孵育24小时后，植物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)没有任何细胞毒性作用(图)2)．


图2
MtRV和MtAPV提取物处理24小时后细胞活力M. Trifoliata.在HUVECs上浓度为0-5 mg/mL的植物。数据显示为 ．

在进一步的实验中，1μ.g / ml lps或50 μ.M H2O.2:这些值没有显示50%的生长抑制(IC50值)，并分别用于诱导炎症或抗氧化作用(数据未显示)。此外，还测定了两种提取物对细胞活力的影响M. Trifoliata.与LPS或H2O.2．结果发现，HUVECs在用MTRV或MTAPV提取物处理后，MTRV或MTAPV与H组合治疗后，细胞活力没有显着差异2O.2，以及MtRV或MtAPV联合LPS(见图)3.)．


图3
细胞活力在24小时后处理Huvecs，1mg / mlM. Trifoliata.MtRV和MtAPV的提取及LPS和H2O.2．数据显示为 ．
３．3.基因表达

定量实时RT-PCR用于测量抗氧化基因HO-1，NQO1的mRNA水平，NRF2那kaep1.， 和GCLC和炎症基因il - 1α那il - 1β那il - 6那肿瘤坏死因子-α， 和干扰素-γ用50次治疗后μ.M H2O.2或1μ.MtRV或MtAPV提取物处理1小时后M. Trifoliata.为24小时。我们的结果表明，两种提取物在浓度为1 mg/mL的情况下都能改变H2O.2-刺激的HUVECs与对照组相比。炎症基因也得到了类似的结果。与对照组相比，lps刺激的细胞中所有被测试的基因在两种提取物处理后均显示了表达的变化，但MtRV提取物的抗炎性能更好。结果如图所示4（a）和4（b）．

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图4
（a）24小时治疗MTRV和MTAPV提取物（1mg / ml）后抗氧化基因的mRNA表达M. Trifoliata.植物和刺激50μ.M H2O.2．(b) MtRV和MtAPV提取物处理24小时后炎症基因mRNA的表达M. Trifoliata.植物和1μ.g / ml lps。 对比对照MtAPV和MtRV提取物。＃比较MtAPV和MtRV提取物。ACTB作为参照基因。数据显示为 （ )．
3．4．核DNA (nDNA)和线粒体DNA (mtDNA)损伤的定量

通过SLR-QRT-PCR扩增从暴露于MTRV或MTAPV提取物中分离的DNA的SLR-QRT-PCR扩增检查24小时，然后50℃检查MTDNA和NDNA损伤μ.M H2O.2一小时。细胞暴露在50℃ μ.M H2O.2证明了病变率的显着增加ND1.和ND5.区域:每10 kb DNA约有5个病变。同样的，同样的细胞在HPRT1和TP53nDNA区域:每10 kb DNA约有5个病变。在细胞中，MtRV或MtAPV提取物处理24小时后，通过减少mtDNA损伤数量，对mtDNA和nDNA损伤具有保护作用ND1.和ND5.基因和NDNA损坏TP53和HPRT1基因（数字5.（一种）-5.(d))。

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图5
通过SLR-qRT-PCR扩增人脐静脉内皮细胞暴露于MtRV和MtAPV (1 mg/mL)提取物24小时后的总DNA，定量核DNA (nDNA) (a, b)和线粒体DNA (mtDNA) (c, d)每10 kb DNA的损伤频率μ.M H2O.2一小时。 对比对照MtAPV和MtRV提取物。＃比较MtAPV和MtRV提取物。数据代表了 三个重复。
3.5。细胞质ROS和线粒体超氧化物产生检测

分别用MtRV和MtAPV (1 mg/mL)提取物处理24小时和50 mg/mL提取物处理1小时后测定细胞质和线粒体ROS水平μ.M H2O.2．经过24小时的处理后，与只处理H2O.2，表明存在保护作用(图6（a）和6 (b))．

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图6
MtRV和MtAPV提取物对人脐静脉内皮细胞产生ROSM. Trifoliata.（1 mg / ml）24小时，然后是50 μ.M H2O.2使用探针:DCFDA (a)和MitoSOX (b)进行测量。 对比对照MtAPV和MtRV提取物。＃比较MtAPV和MtRV提取物。结果表示 ．
3.6。PARP1-和γ.-H2A。MtAPV和MtRV提取物处理后，流式细胞术检测x阳性细胞水平

的水平γ.H2A。以X-和裂解的聚(adp -核糖)聚合酶1- (PARP1-)阳性细胞为实验材料，观察MtRV和MtAPV提取物对50μ.M H2O.2．发现Huvecs用50次治疗 μ.M H2O.2产生更高级别的γ.H2A.x-和切割的PARP1阳性细胞比未处理的细胞。反过来，用MTRV和MTAPV提取物24小时孵育细胞对细胞的保护作用对50次治疗后细胞 μ.M H2O.2，反映出明显较低的百分比γ.H2A。和parp1阳性细胞的分裂。虽然两种提取物都显示了保护作用，但MtRV提取物的效果更好(图)7(一)和7 (b))．

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图7
图表显示了H2A的百分比。MtRV和MtAPV提取物暴露24小时后，X磷酸化- (a)和PARP1- (b)阳性的人脐静脉内皮细胞μ.M H2O.2一小时。 对比对照MtAPV和MtRV提取物。＃比较MtAPV和MtRV提取物。值表示 三个独立实验。
3.7。MtAPV和MtRV提取物的抗菌活性评价

MtRV和MtAPV提取物的抑菌活性金黄色葡萄球菌那假单胞菌铜绿假单胞菌那大肠杆菌那肠球菌粪便器那酿酒酵母， 和白色念珠菌采用MIC和MBC/MFC方法筛选。两种提取物均表现出中等抑菌活性(表1)2)对不同菌株的MIC值范围(150-925μ.g / ml）和MBC / MFC（500-2500 μ.g / mL)。MtRV提取物的抗肿瘤活性优于MtAPV提取物铜绿假单胞菌和粪大肠，MIC值为150 μ.克/毫升。MtRV提取物的抗真菌活性也优于MtAPV提取物白念珠菌和S. Cerevisiae.， MIC值为625μ.克/毫升和725年μ.g/mL, MFC值为625μ.g / ml和1500 μ.分别g / mL。
植物材料 金黄色葡萄球菌 假单胞菌铜绿假单胞菌 大肠杆菌 肠球菌粪便器 酿酒酵母 白色念珠菌
麦克风(μ.g / mL) MBC 麦克风(μ.g / mL) MBC 麦克风(μ.g / mL) MBC 麦克风(μ.g / mL) MBC 麦克风(μ.g / mL) MFC. 麦克风(μ.g / mL) MFC.
Mt RV提取物 225 >500 150 >500 250 >500 150 >500 725 625 625 1500
太APV提取 250 >500 250 >500 250 >500 250 >500 725 725 925 2500
积极的控制 7.82班车 >500 <0.48也不 >500 0.98也不 >500 1.95班车 >500 <0.48ANF. >5000 <0.48ANF. >5000
表2.
MtRV和MtAPV提取物的抑菌活性M. Trifoliata.．范：万古霉素;也是：诺福克西林;ANF：两性蛋白B.数据代表三份中的中值值。

4.讨论

植物众所周知，对人类健康有益。他们对生物活性化合物的非凡财富使它们对人类生命不可或缺，并允许预防许多文明疾病。一种含有许多有价值的生物活性化合物的一种植物物种是menyanthes trifoliata．该植物的提取物和输注用作抗炎，利尿剂或清洁剂，成为植物症的重要因素[20.］．

这项工作是第一个证明保护性质的工作M. Trifoliata.从栽培植物的地上部分和根中提取的提取物在体外．它检查了抗炎和抗氧化特性M. Trifoliata.在先前用LPS或H治疗的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中提取（MTRV和MTAPV提取物）2O.2．炎症是在不同刺激的影响下在组织中发生的一种非常复杂的生理现象，是由多种特定成分介导的。它涉及白细胞、巨噬细胞和肥大细胞产生的信号分子之间的相互作用，以及补体的激活[21-23］．一系列的研究描述了植物提取物对广泛的正常细胞和癌细胞的抗炎特性[24-26］．

这项研究的目的之一是调查其抗炎特性M. Trifoliata.通过脂多糖(LPS)刺激24小时后对HUVECs细胞的作用。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。它通过toll样受体4激活单核吞噬细胞和其他细胞类型，促进包括TNF-在内的炎症介质的分泌α.IL-6和IL-1β[27］．结果表明，紫花苜蓿的地上部分(MtAPV)和根部分(MtRV)提取物在体外-衍生的M. Trifoliata.通过降低编码炎症相关细胞因子(IL-1)的特定基因的表达，显示出抗炎作用α.，IL-1β、il - 6、TNF -α.，和ifn-γ.)．

许多报告指出M. Trifoliata.是酚类化合物的来源，如香豆素、黄酮醇或环烯醚酯[11］．我们以前的研究还显示出在提取物中存在各种酚类化合物在体外- 和在活的有机体内-衍生的M. Trifoliata.植物中，鞣花酸含量(299-518μ.G / G干重)、绿原酸(129-258μ.G / G干重)、芦丁(82-256μ.G / g干重）根据植物部分和生长条件而变化。戊类酸，一种五胞苷三萜，在其源自植物根部的最高浓度下被发现在体外文化。这种植物化合物的抗炎和抗氧化活性在文献中也有很好的记载[28-30.］．

我们目前的研究结果表明M. Trifoliata.提取物赋予测试细胞系的DNA保护作用。我们推测桦木酸和鉴定的酚酸（注射酸，锡酸，鞣果酸，鞣酸和绿原酸）可能是这种阳性效应的原因，特别是因为已发现桦木酸和锡丁酸抑制炎症细胞因子（如IL）。6或tnf-α.[31那32］．白桦脂酸(羽扇烷型三萜)对暴露于致死剂量LPS下的小鼠具有保护作用，并可减少LPS诱导的TNF-α.生产。此外，白桦酸也被称为IFN-的抑制剂γ.生产(33］．Kim等人报道该化合物是一种消炎药，通过抑制核因子-发挥作用κ..B (NF -κ..B)途径。同样，抑制肿瘤坏死因子-α.（TNF-α.)、白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-1β(il - 1β）在桦木酸治疗后在LPS激活的原料264.7巨噬细胞中证明了[34］．SINAPINIC酸还描述了类似的性质[35-37]，鞣花酸[38[或绿原酸[39.］．

本研究还分析了两者的影响M. Trifoliata.氧化应激相关基因表达的提取。基因的表达变化编码血红素加氧酶1 (HO-1),醌脱氢酶1 (NQO1),核转录因子(erythroid-derived-2)如2 (NRF2) Kelch-like ECH-associated蛋白1 (kEAP1),或glutamate-cysteine连接酶催化亚基(GCLC)给所起的保护作用的组件测试提取在H2O.2刺激细胞。MtRV和MtAPV提取物，剂量为1 mg/mL，可影响其表达HO-1那NRF2那keap1.那NQO1， 和GCLCH.的基因2O.2-Stimulated Huvecs，MTRV提取物证明比MTAPV更好的保护性。

以前的研究提供了丰富的信息，描述了植物酚类化合物对Huvecs的细胞保护作用[40-42］．一些影响氧化应激相关基因的表达;例如，绿茶提取物中含有的血红素加氧酶-1 (HO-1) mRNA水平增加了人类主动脉内皮细胞[43]，而多酚抗氧化剂部分来自睡莲属nouchali叶片增加RAW 264.7细胞HO-1和Nrf2水平[44］．最近，已经特别注意炎症和氧化应激之间的密切关系。过量的自由基的外观与细胞膜脂肪酸，蛋白质或DNA反应，导致突变，从而达到许多疾病的发展。在这种情况下，寻找保护来自不利变化的自然组分非常理想。

本研究还检测了H2O.2- 用MTRV和MTAPV提取物治疗后刺激HUVEC。我们用二氯二氢 - 荧光素二酸和红色线粒体超氧化物指示剂（Mitosox）获得的结果，发现植物提取物通过降低细胞中细胞质和线粒体ROS水平来发挥保护作用。MTRV提取物证明了比MTAPV提取物更强的抗氧化效果。众所周知，ROS在上皮细胞中由许多酶产生，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOx），一氧化氮合酶或黄嘌呤氧化酶（XOD），以及呼吸链复合物[45］．ROS是非常重要的元素，在炎症过程的启动中发挥关键作用。炎症部位多态核中性粒细胞(PMN)产生的ROS水平升高可导致上皮细胞功能障碍和随后的组织损伤[46］．相当大的证据表明，ROS的过量细胞产量可能与炎症的诱导密切相关，从而影响阿尔茨海默，帕金森或癌症等疾病的发展[47］．我们的研究结果证实了M. Trifoliata.提取物显示出保护性的抗氧化性能，这可能是由于已鉴定出的酚类化合物和五环三萜类化合物的存在，如白桦酸，这与文献数据一致[48］．还应注意，MTRV提取物似乎提供最强的细胞保护作用。

对暴露于植物提取物的HUVECs的DNA进行SLR-qRT-PCR扩增，定量分析细胞核和线粒体DNA损伤情况μ.M H2O.2．两种提取物均有保护作用，MtRV和MtAPV提取物孵育后，所有检测的细胞核和线粒体DNA区域的损伤率均较单独孵育的细胞有所降低μ.M H2O.2．虽然线粒体和细胞核DNA的损伤，以及检测提取物的保护作用，可以通过各种方法检测，如Southern blot分析或彗星试验，但本研究使用了基于rt - pcr的半长时间运行检测。此外，MtRV提取物比MtAPV提取物对ros源DNA损伤具有更强的保护作用。

已知植物酚醛化合物赋予对DNA对各种物理或化学因素的保护作用[49-51］．一种类似的研究来调查保护效果鼠尾草officinalis和胸腺寻常胸腺Kozics等人对HepG2细胞的DNA进行了提取[52］．他们的结果表明h2O.2在用这两种植物提取物预处理的细胞中，DNA损伤显著减少，这两种植物提取物还发现含有酚类化合物和白桦酸。另一项研究检验了提纯后的效果Eugenia jambolan.叶子和水果提取物在hepg2细胞上;发现提取物是许多酚类化合物和桦木酸的富含来源，并表现出抗原毒性和抗毒性作用[53］．

其他研究表明，酚醛化合物，包括酚酸，可以降低各种细胞类型中的氧化DNA损伤水平[54那55］．然而，本研究首先报告的能力在体外-衍生的M. Trifoliata.植物提取物以保护细胞免受DNA损伤。如前所述，我们的结果表明，所检测的提取物证明的保护效果与其酚醛化合物含量有关，包括桦木酸，以及提取组分之间的协同作用。

流式细胞术分析显示M. Trifoliata.提取物对被试细胞有保护作用。HUVECs经H2O.2产生更高级别的γ.H2A.x-和切割的PARP1阳性细胞比未处理的细胞。另一方面，24小时与研究的MTRV和MTAPV提取物孵育表现出对H预处理的保护作用2O.2通过减少γ.H2A。和parp1阳性细胞的分裂。聚(adp -核糖)聚合酶1 (PARP1)负责adp -核糖基化过程(PARylation)，这是一种常见的DNA损伤翻译后修饰。这种修饰调节许多其他生物过程，包括染色质重组或DNA损伤反应(DDR)。此外，PARP是caspases的底物，在凋亡过程中裂解为86和24 kDa片段[56那57］．因此，PARP1充当了一个良好的DNA损伤传感器[58］．类似地，H 2 -X蛋白是修复受损DNA的关键因素，并且可以在DNA损伤的存在下在第139次丝氨酸残留物中磷酸化[59］．磷酸化蛋白导致DNA-H2A.x复合物的构象变化，这允许募集需要修复DNA损伤所需的蛋白质[60］．

我们的结果清楚地表明了这一点M. Trifoliata.从植物中提取的提取物在体外培养物在测试细胞的DNA保护中发挥着重要作用。这与其他文献数据一致，表明多酚丰富的天然产物也抑制切割PARP水平的增加[61那62］．类似地，先前已经发现，在红茶或含有DNA损伤的另一个DNA损伤的决定因素的磷酸化H2A.x的水平。Camptosorus sibiricus提取(63]在其他细胞中。最有可能在MTRV和MTAPV提取物中存在的酚类化合物和五胞苷三萜可能是对本研究中观察到的生物学效应的原因。

该研究还研究了抗菌和抗真菌特性M. Trifoliata.提取物。测试的MTRV和MTAPV提取物表现出比抗真菌作用更强的抗菌作用。还表明MTRV提取物对测试的微生物具有比MTAPV更强的效果。获得最佳的细菌生长抑制作用假单胞菌铜绿假单胞菌(写明ATCC 27853)和肠球菌粪便器(ATCC29212)的MtRV提取( )．MtAPV提取物对所有受测细菌均有类似效果( )．MtRV提取物对真菌生长的抑制作用强于MtAPV提取物白色念珠菌(写明ATCC 10231)和酿酒酵母（ATCC 2601），麦克风白色念珠菌是625. μ.克/毫升。许多植物物种自然产生具有抗菌或抗真菌特性的化合物[64-66］．Ivanišová等[67]检查了抗微生物活性M. Trifoliata.叶提取物，丰富的多酚和类黄酮的来源，以及其他植物提取物对三种革兰氏阴性细菌和两种革兰氏阳性物种。的M. Trifoliata.结果表明，该提取物具有较强的抑菌活性大肠杆菌那沙门氏菌肠道亚普。entenica.那Bacillus thuringiensis.那金黄色葡萄球菌亚普。葡萄球菌， 和假单胞菌铜绿假单胞菌，这与我们的结果相符。本研究发现M. Trifoliata.成为研究中所有分析的野生植物中的多酚，黄酮类化合物和酚醛酸的最富有来源。抗菌和抗真菌特性M. Trifoliata.也通过Paudel等人进行了提取物。[68通过测试它们对病原微生物的影响，如金黄色葡萄球菌那大肠杆菌， 和白念珠菌．在这种情况下，植物提取物仅激活金黄色葡萄球菌．作者将这些抗菌活性的差异归因于测试样品中抗菌代谢物的变化。

由于病原体对传统药物的耐药性日益显现，寻找新的抗菌化合物已成为一个极其重要的问题;从这个意义上说，植物源化合物可能发挥着潜在的重要作用。它们通常具有特定的化学结构，可以通过新的作用机制抑制细菌生长[69];然而，这组次级代谢物也可能在开发针对人类病原体的新化合物中具有重要意义。根据以往研究所得的数据[70-72]，很可能白桦酸可能是被测提取物的抗菌和抗真菌作用的主要原因[70那73］．另外，我们怀疑酚醛酸可能具有类似的效果，并且与其他组分表现出协同作用，特别是因为MTRV提取物显示出最佳的抗微生物性质。通常，许多酚类化合物的抗菌和抗真菌机制尚未完全理解[69］．一些研究表明它们与一系列靶标如DNA，DNA丙糖相互作用[74]，蛋白激酶[75]、解旋酶等[69］．应该尝试确定新的抗菌成分，特别是随着环境中出现越来越多的耐多药菌株[76］．

结论

我们的研究结果首次证明MtRV和MtAPV提取M. Trifoliata.植物来自的在体外体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)对H2O.2或LPS，其中，MTRV提取物证明了最强的活动。此外，观察到保护效果与DNA损伤的降低，细胞质和线粒体ROS水平降低相关，降低γ.H2A.x-并切割PARP1阳性HUVEC编号。此外，测试提取物对各种致病细菌和真菌菌株进行了适度的抗微生物活性。因此，该植物可能在治疗和预防许多文明疾病中发挥潜在作用。

数据可用性

所有数据可应审阅者或其他感兴趣的人员的要求提供。

的利益冲突

作者声明没有竞争利益。

致谢

本研究由罗兹大学法定基金资助号B1711000000201.01。

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