IGF1击倒阻碍心肌发展ROS-Dependent FOXO激活能量代谢障碍引起的鸡的心

文摘

胰岛素样生长因子1 (IGF1)是一种多功能细胞调节因子,可以调节通过调节生长激素刺激细胞生长和发展。然而,IGF1在心肌细胞功能障碍的机制发展很少报道。研究这个,我们采用的模型IGF1击倒在鸡胚胎体内和体外心肌细胞。我们检测到抗氧化能力,PI3K / Akt通路,能量代谢相关基因,心肌发展的基因。我们的研究结果显示,IGF1的低表达可以显著抑制活性氧的抗氧化能力,增加( )水平,激活AMPK和PI3K通路通过抑制IRS1的表达。我们还发现通过IGF1心肌能量代谢受阻,供过于求,IGFBP抑制,进一步诱导心肌发育障碍通过抑制Mesp1,叫,Nkx2.5, MyoD表达式。,我们得出这样的结论:低IGF1表达可以通过障碍阻碍心肌发展引起的能量代谢ROS-dependent FOXO激活。

1。介绍

胰岛素样生长因子(igf)是一组多肽的促生长作用。分泌细胞广泛分布于组织,如肝脏、肾、肺、心脏、大脑和肠道(1]。igf扮演重要的角色在细胞增殖,分化,个人成长和发展2]。IGF家族有两个亚型:胰岛素样生长因子1 (IGF1)和胰岛素样生长因子2 (IGF2)。IGF1的生产依赖于生长激素(GH),这是生命过程中一个重要的生长因子。心肌发育是一个复杂的过程,受许多发展因素组成的复杂的分子网络。许多研究表明,各种信号通路参与脊椎动物心脏的发展,包括骨形成蛋白(BMP), Wnt,切口,纤维母细胞生长因子4 (FGF 4)信号转导途径。BMP和Wnt信号通路发挥重要作用的发展早期中胚层细胞成心肌细胞;他们作用于心脏转录因子GATA4 Nkx2.5通过信号级联过程,促进心脏前体细胞的分化成心肌细胞(3,4]。Musaro等人证明了局部合成IGF1骨骼肌肥大,密切相关的分子途径类似于那些负责心脏肥大(5]。

胰岛素是由胰岛分泌的一种激素β细胞,它是唯一降低血糖的激素,促进糖原的合成,脂肪,蛋白质在动物(6]。胰岛素已经证明调节体内代谢和生长(7]。胰岛素受体(IR)是一个四聚物由两个α亚单位和两个β亚基形成二硫键。两个α亚基位于外的质膜和胰岛素的结合位点;两个β亚基是跨膜蛋白,在信号转导中发挥作用。红外家族包含红外,胰岛素样生长因子受体(IGFR)和胰岛素受体相关受体(IRR)。胞内信号是由激活细胞内酪氨酸激酶通过一系列结构构象变化红外与配体结合后,在体内发挥重要的生理功能(8]。心肌细胞膜富含IR,使心肌细胞非常重要的胰岛素作用的靶器官。胰岛素的调节起着关键作用的各个方面心血管代谢葡萄糖代谢,蛋白质合成,血管张力。IGF家族可以调节心脏血统感应通过扩大中胚层细胞群(9]。Bisping等人表明,尽管IGF1是不必要的心脏结构和功能,必须激活GATA4 IGF1途径发挥其功能(10]。

构象变化发生在β受体亚基当胰岛素结合红外形成一个复杂的,这导致自身磷酸化,激活酪氨酸激酶(TK)。复杂的磷酸化胰岛素受体底物(IRS)和激活磷脂酰肌醇3-kinase PI3K通路和增殖蛋白激酶(MAPK)途径。胰岛素增强心肌细胞收缩,增加了核糖体生物起源和蛋白质合成,刺激血管内皮生长因子(VEGF),从而抑制细胞凋亡,促进细胞存活和增加血液灌注的心肌主要通过PKB / Akt信号通路(11]。IGF1的过程可以调节膜装配在轴突生长锥通过激活PI3K通路(12]。朱等人发现IGF1可以上调VEGF-C乳腺癌的调停PI3K / Akt和MAPK / ERK1/2信号通路(13]。治疗隐静脉与IGF1的平滑肌细胞可以诱导PI3K-Akt / PKB的磷酸化和促进隐静脉平滑肌细胞的增殖14]。

微生物可以产生自由基在正常新陈代谢,和过多的氧自由基可引起损伤人体组织和细胞结构(15,16]。能保持自由基平衡取决于抗氧化系统。身体可以调解的积累过量的活性氧(ROS)通过细胞信号转导,增强了许多保护蛋白质的表达的细胞。IGF能感觉到ROS水平的变化,从而影响胰岛素通路(17]。Papaiahgari等人表明,ROS能调解核转录因子的激活红细胞两个相关因子2 (Nrf2) PI3K / Akt通路(18]。

在我们之前的研究中,我们表明,缺硒中断胰岛素响应通过抑制PI3K / Akt通路产生过多的氧自由基(19,20.];同时,硒缺乏可下调IGF1的表达。然而,IGF1的角色在心肌发展仍然报道较少;在我们目前的研究中,我们开发了模型IGF1击倒在心肌细胞文化(siRNA)体外和IGF1击倒在鸡胚模型体内检测IGF1的影响抑制能量代谢,胰岛素通路,和心肌的发展。

2。材料和方法

本研究中使用的所有程序批准的东北农业大学动物保健和使用委员会制度(SRM-11)。

2.1。原发性心肌细胞培养

Twelve-day-old鸡胚被用来获得文化主要的心肌细胞。之后表面消毒(用75%的酒精),胸部是解剖收集的顶端部分心包(大约1/3的心),并立即转移到磷酸盐溶液(PBS) (4°C)和清洗去除脂肪,结缔组织和血凝块。随后,心肌组织切成小块,用PBS洗3次。酶消化后collagenase-II(0.1%) 15分钟在恒温磁力搅拌器(37°C, 100 r / min)驯化和离心,同等体积的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) / F12w含10%胎牛血清和1 x mycillin添加终止消化。颗粒是消化,直到小组织碎片完全消化。收集所有上层清液用300目和500目过滤器。在600 rpm的细胞悬液离心5分钟和resuspended DMEM / F12w两次微分粘附可支配培养皿(第一次是1 h;第二次是1.5 h)。不依从细胞(心肌细胞)收集,离心机在600 rpm,统计,在6-well盘子镀 ,和孵化37°C, 5%的公司₂贴壁培养,培养48 h (21]。

2.2。建立IGF1击倒的体外模型

心肌细胞融合孵化大约48小时后达到80%。鸡肉心肌细胞中的主要文化,这是我们之前的实验方法中描述的一样,IGF1是撞倒了使用核(5 - - - - - -GTTCGTATGTGGAGACAGA-3 ,反义5 - - - - - -TCTGTCTCCACATACGAAC-3 )之后两个洗Opti-MEM (prewarmed)。所有的细胞都被随机分为两组:C(对照组)和KD(可拆卸的组)。每组3复制准备 每复制心肌细胞( )。击倒组细胞转染了3μL (20μ小干扰rna和3米μL (Lipofectamine RNAi马克斯试剂(表达载体)2毫升Opti-MEM。细胞对照组服用2毫升Opti-MEM(表达载体),它只包含相同体积的Lipofectamine RNAi马克斯试剂。约48 h posttransfection细胞收获进行分析。

2.3。建立IGF1沉默模型体内

首先,50μg无内毒素的核酸与纯水稀释的浓度为1μ克/μL;最后的葡萄糖浓度为5%,最后成交100μl .然后,25μL (Entranster™体内试剂稀释了50μL 10%的葡萄糖溶液和纯水补充。最后运行的葡萄糖浓度为5%,最后成交100μL液体。

稀释的转染试剂添加到稀释核酸溶液形成转染复杂,当时离开在室温下15分钟。九十年孵化鸡蛋被随机分为两组每组(45),即,正常组(N)和核组(Si)。每个鸡蛋的subgerminal腔被注射1μg核和密封密封膜。所有的鸡蛋都是在恒温孵化器孵化。心中被6、8和10天为后续实验。

2.4。检测细胞内活性氧积累

Posttransfection ROS活动测量使用ROS分析工具包(南京建成生物工程研究所、中国)。首先,10μ二乙酸7-dichlorofurescin M DCFH-DA(2)添加到培养基,含有细胞样品进行测试,然后在恒温孵化(37°C) 45分钟。然后,介质被丢弃,PBS (37°C预热)被用来洗细胞三次。最后,收集细胞检测活性氧的活动的激发波长 和发射波长 。心肌细胞是可视化使用荧光显微镜。

2.5。测定氧化应激标记

细胞生长在6-well板的密度 ,盐水的收集与喷气机,离心机在700×g;然后,上层的收集。鸡胚的心被均质化的生理盐水和离心20分钟700克、和上层的收集。过氧化氢(H₂O₂)、谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA),诱导一氧化氮合酶(间接宾语),超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)内容是衡量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国),根据制造商的协议。SOD活性测定25°C使用自氧化焦棓酸的50 Mm三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8,100毫米焦棓酸(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。

2.6。测定有关IGF1基因的mRNA表达,PI3K / Akt通路,胰岛素,心脏分化

因心脏组织总RNA分离三个点的时间和心肌细胞用试剂盒试剂按照制造商的指示(罗氏、巴塞尔、瑞士)。干的RNA丸resuspended在50μL(二乙基pyrocarbonate-treated水。总RNA浓度和纯度的测定使用分光光度计。5的互补脱氧核糖核酸合成μg总RNA使用oligo-dT底漆和上标II的逆转录酶根据制造商的指示(Promega,北京)。互补脱氧核糖核酸是稀释的比例1:5和无菌水储存在−80°C。

底漆总理软件(总理Biosoft国际、美国)被用来设计特定的引物对IGF1和活化蛋白激酶(AMPK)、磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K) c-Jun n端激酶(物),threonine-protein激酶(激酶),forkhead盒蛋白(FOXO)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R),葡萄糖transporter-1 (GLUT1),葡萄糖《非常人贩3》(GLUT3),葡萄糖transporter-8 (GLUT8)、胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP1)、胰岛素样生长因子结合protein-2 (IGFBP2)、胰岛素样生长因子结合蛋白质3 (IGFBP3)、胰岛素样生长因子结合含有(IGFBP4)、胰岛素样生长因子结合protein-5 (IGFBP5)、胰岛素样生长因子结合protein-7 (IGFBP7),胰岛素受体(IR),胰岛素受体底物(IRS1) MyoD, myogenin (MyoG),心脏转录因子中胚层后1 (Mesp1),肌原性的把5 (MYF5),肌原性的factor-6 (MYF6) GATA-binding蛋白4 (GATA4) GATA-binding蛋白6 (GATA6) NK2同源框5 (Nkx2.5),并根据已知的鸡glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)序列(表1)。首先,普通PCR进行确认引物的特异性。定量实时PCR (qPCR)然后用罗氏执行检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。反应进行了20μ包含10 L反应混合物μL 2 x SYBR绿色我PCR掌握混合(罗氏、巴塞尔、瑞士),2μ0.4 L的cDNA、μ每个引物(10 Lμ0.4米),μL 50 x火箭参考染料二世和6.8μL PCR-grade水。PCR过程对IGF1和AMPK, PI3K物,一种蛋白激酶,FOXO, IGF1R, GLUT1、GLUT3, GLUT8、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP7, IR, IRS1, MyoD, MyoG, Mesp1, MYF5, MYF6, GATA4, GATA6, Nkx2.5,和GAPDH由95°C的30年代紧随其后40 95°C的周期15秒,60°C 30年代,30年代和60°C。对于每一个PCR,解离曲线1.0软件(应用生物系统公司)是用于分析解离曲线以检测和消除可能的引物二聚体和非特异性扩增。

2.7。相关的蛋白表达的蛋白质测定IGF1, PI3K / Akt通路,胰岛素,心脏分化

总蛋白提取、蛋白质溶解产物受到15% SDS-polyacrylamide减少条件下凝胶电泳。分离蛋白被转移到2 h 100 mA的硝化纤维膜转移装置包含Tris-glycine缓冲和20%甲醇。膜被5%的脱脂牛奶24 h和孵化隔夜稀释主要抗体IGF1 (Proteintech 1: 500年,中国),PI3K(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),一种蛋白激酶(圣克鲁斯生物技术1:500年,美国),P-Akt (Proteintech 1: 500年,中国),FOXO(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),P-FOXO(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国)、物(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),P-JNK(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),14-3-3 (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),P-14-3-3(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),GLUT3(圣克鲁斯生物技术1:300年,美国),IGF1Rβ(中国)1:500年,Proteintech IGFBP2 (Proteintech 1: 500年,中国),MyoG (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),和MyoD (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),后跟一个辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体兔(IGF1, PI3K Akt, P-Akt, FOXO, P-FOXO,物,P-JNK, 14-3-3, P-14-3-3,供过于求,IGF1Rβ、IGFBP2 MyoG, MyoD)免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术1:5000年,美国)。验证等于加载的样品,膜与单克隆抗体GAPDH孵化(圣克鲁斯生物技术1:1500年,美国),紧随其后的是一个HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 3000)二级抗体。信号检测与x射线电影(TransGen生物技术有限公司、北京、中国)。每个乐队的光学密度(OD)决定使用一个图像VCD凝胶成像系统,IGF1的相对丰度,PI3K, Akt, P-Akt, FOXO, P-FOXO,物,P-JNK, 14-3-3, P-14-3-3, GLUT3 IGF1Rβ,MyoG IGFBP2和MyoD蛋白质的比例计算并显示在OD的这些蛋白质GAPDH。

2.8。ATP的测量

心肌细胞生长在6-well板的密度 ,收集与裂解的解决方案,和离心机在700×g。上层清液收集,resuspended盐水和孵化35分钟25°C。的心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)是衡量使用ATP检测设备(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的指示。使用紫外分光光度计进行检测(协同NEO, BioTek仪器)检测波长为636 nm。

2.9。组织病理学检查

心肌细胞种植密度 然后用PBS洗3次;4%多聚甲醛溶液中添加24-well板细胞修复。12小时后,4%多聚甲醛溶液24-well板被0.01 PBS添加;然后,井被浸泡 。苏木精染色的解决方案是添加到井和浸泡1分钟。染色的解决办法是删除,添加蒸馏水浸泡5分钟。蒸馏水然后删除并放置在1%盐酸酒精。1 - 3秒后,吸气。自来水加入浸泡5分钟回到蓝色的细胞。然后,自来水被移除,Yihong添加了染料溶液浸泡1分钟。伊红染色的解决方案是吸气,在蒸馏水中浸泡1分钟。爬片被移除,甘油乙醇添加一滴一滴地。在显微镜下观察染色效果和200倍显微镜下拍照22]。

心肌组织快速固定在10%甲醛至少24 h和嵌入在石蜡显微镜检查。从准备石蜡块,部分(5μ米厚)被削减、获得和苏木精和伊红染色(阁下)光显微观察。

2.10。高分辨率的呼吸运动计量法线粒体功能

心肌细胞生长在6-well板的密度 。所有的细胞都被随机分为两组:C(对照组)和KD(可拆卸的组)。可拆卸的组的细胞转染3μL (20μ小干扰rna和3米μL (Lipofectamine RNAi马克斯试剂(表达载体)2毫升Opti-MEM。细胞与对照组治疗2毫升Opti-MEM(表达载体)包含同样体积的Lipofectamine RNAi马克斯试剂。大约48 h posttransfection,分析细胞收获,收集细胞溶解的解决方案,和离心机在700×g。上层清液的收集和resuspended是高分辨率的呼吸运动计量法的媒介。分析了线粒体呼吸功能的双通道滴定喷射呼吸器(Oxygraph-2k;Oroboros仪器,奥地利因斯布鲁克)。细胞悬液分别转移到oxygraph钱伯斯在最后一个密度约为2 。经过短暂的稳定时间,钱伯斯被关闭和数据记录使用DatLab软件5.2(奥地利因斯布鲁克Oroboros仪器)。

2.11。统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 5.0软件,使用未配对和所有数据评估 - - - - - -测试, 被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。发展的IGF1击倒在细胞和鸡胚模型

IGF1的信使rna和蛋白质水平显著降低( )KD组(数字1(一)和1 (b))。结果证实,我们成功建立了IGF1击倒的体外模型。

IGF1的mRNA水平被发现在6、8、10天,我们发现IGF1的表达明显减少了10天。进行进一步的验证,我们把鸡胚在10天来检测蛋白质的IGF1水平。与N组相比,圣莱科特的mRNA水平下降( )在(图8天,10天1 (c))。圣莱科特表现出显著降低了蛋白质含量与N组(图1 (d))。结果证实,我们成功地建立了IGF1的沉默模型体内。

3.2。检测细胞和鸡胚的抗氧化能力

评估氧化应激之间的关系和IGF1 ROS的产生,H的水平₂O₂、MDA和T-AOC谷胱甘肽的活动,氧化酶SOD,猫,进气阀打开,以心肌细胞。提出了图2ROS活动显著增加( )与C组相比。H的水平₂O₂、MDA和伊诺KD组显著增加( )(数据3 (d)- - - - - -3 (f))。谷胱甘肽的水平、氧化酶、猫,SOD, T-AOC KD组明显低于C组( )(数据3(一个)- - - - - -3 (c),3 (g),3 (h))。

为了进一步证明IGF1沉默体内的抗氧化能力,我们还研究了心肌的抗氧化能力。如图3,H的水平₂O₂、MDA和伊诺显著增加在圣莱科特( )6、8、10天(数字3(左)- - - - - -3 (n))。谷胱甘肽的水平、氧化酶、猫,SOD, T-AOC Si组明显低于N组( )6、8、10天(数字3(我),3 (j),3(左),3 (o),3 (p))。

3.3。蛋白质和PI3K / Akt的mRNA表达Pathway-Related基因在细胞和鸡胚

检查是否IGF1击倒的表情PI3K / Akt pathway-related基因,我们发现AMPK的信使rna表达水平,PI3K,物,一种蛋白激酶,以及FOXO FOXO的蛋白表达水平,P-FOXO,物,P-JNK, PI3K, Akt, P-Akt, 14-3-3, P-14-3-3。IGF1击倒的影响在鸡PI3K-related基因的mRNA丰富心肌细胞在图所示4(一)。与C组相比,qPCR结果显示,AMPK的mRNA表达,物,FOXO显著增加( )KD组。然而,PI3K和Akt的mRNA表达下降( )。结果显示,与C组相比,FOXO的蛋白表达,P-FOXO,物,P-JNK KD组显著增加( )。然而,PI3K蛋白表达,一种蛋白激酶,P-Akt, 14-3-3, P-14-3-3减少KD组( )(图4 (b))。

此外,我们发现IGF1沉默的影响PI3K-related基因的mRNA丰富(AMPK, PI3K,物,一种蛋白激酶,FOXO)心肌的鸡胚,如图4 (c)。qPCR结果显示,AMPK的mRNA表达,物,FOXO显著增加( )在圣莱科特6、8和10天。PI3K的mRNA表达增加6和8天,但明显减少( )在10天。Akt的mRNA表达增加了6天,显示在8天没有显著变化,并显著降低( )在10天。免疫印迹分析来确定PI3K-related基因的蛋白表达。结果显示,与N组相比,FOXO的蛋白表达,P-FOXO,物,P-JNK Si组显著增加( )。然而,PI3K蛋白表达,一种蛋白激酶,P-Akt, 14-3-3, P-14-3-3减少在圣莱科特( )(图4 (d))。

3.4。蛋白质和Insulin-Related基因的mRNA表达细胞和鸡胚

我们还研究了IGF1击倒的影响insulin-related基因的mRNA丰富(IGF1R, GLUT1、GLUT3 GLUT8、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP7,红外光谱、和IRS1)在鸡心肌细胞(图5(一个));qPCR结果表明IGF1R的mRNA表达GLUT1、GLUT3, GLUT8、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP7,红外,IRS1显著下降( )KD组。免疫印迹分析来确定insulin-related基因的蛋白表达。结果显示,与C组相比,IGF1R GLUT3的蛋白表达β,IGFBP2 KD组显著减少( )(图5 (b))。

此外,我们研究了IGF1击倒的影响insulin-related基因的mRNA丰富(IGF1R, GLUT1、GLUT3 GLUT8、IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP7,红外光谱、和IRS1)心肌的鸡胚,如图5 (c)。qPCR结果表明IGF1R的mRNA表达GLUT1、GLUT8、IGFBP1, IGFBP2,和IGFBP7在圣莱科特增加6天,显示在8天没有显著变化,并显著降低( )在10天。的mRNA表达GLUT3、IGFBP3 IR, IRS1增加6和8天,但明显降低( )在10天。的mRNA表达IGFBP4增加6天,但显著减少在8 - 10天。IGFBP5的mRNA表达显著下降( )在8 - 10天。免疫印迹分析来确定insulin-related基因的蛋白表达。结果显示,与N组相比,IGF1R GLUT3的蛋白表达β,IGFBP2 Si组显著减少( )(图5 (d))。

3.5。心肌细胞耗氧率和ATP含量

评估IGF1击倒在能量代谢的影响,耗氧率和ATP含量检测。结果显示,IGF1击倒显著降低(图三磷酸腺苷含量6(一))。耗氧率的结果显示,IGF1击倒集团的耗氧率为15.166,而对照组的耗氧率为24.019,表明IGF1击倒显著降低心肌耗氧率相同的条件下,相同的初始氧浓度(图6 (b))。

瞬时耗氧率提供了不同组心肌细胞的表2。

3.6。蛋白质和心脏Differentiation-Related基因的mRNA表达细胞和鸡胚

IGF1击倒的影响心脏differentiation-related基因的mRNA丰富(MyoD、MyoG Mesp1, MYF5, MYF6, GATA4, GATA6,和Nkx2.5)在鸡心肌细胞(图所示7(一)),qPCR结果表明mRNA的表达MyoD, MyoG, Mesp1, MYF5, MYF6, GATA4 GATA6, Nkx2.5显著下降( )KD组。免疫印迹分析来确定心脏differentiation-related基因的蛋白表达。结果显示,与C组相比,MyoG的蛋白表达和MyoD KD组显著减少( )(图7 (b))。

IGF1击倒的影响心脏differentiation-related基因的mRNA丰富(MyoD、MyoG Mesp1, MYF5, MYF6, GATA4, GATA6,和Nkx2.5)心肌的鸡胚图所示7 (c)。qPCR结果表明mRNA的表达MyoD, Mesp1,和MYF5增加在圣莱科特6和8天,但明显降低( )在10天。的mRNA表达MyoG、GATA4 GATA6增加6天,但显著降低了8 - 10天。的mRNA表达MYF6增加6天,显示在8天没有显著变化,并显著降低( )在10天。的mRNA表达Nkx2.5下降( )6、8和10天。免疫印迹分析来确定心脏differentiation-related基因的蛋白表达。结果显示,与N组相比,MyoG的蛋白表达和MyoD Si组明显减少( )(图7 (d))。

3.7。细胞形态学观察和阁下染色细胞和鸡胚的心肌

在显微镜下观察,正常心肌细胞梭状,紧密相连的,整个看起来像铺路石伴随着伸出伪足伸出细胞之间,交织成网在对照组(图8(一个))。KD组,细胞生长的密度减少,心肌细胞和细胞间连接的体积明显减少。我们观察到心肌纤维和肌肉纤维束被解体,细胞之间的伪足没有交织成网状KD组(图8 (b))。我们观察到心肌细胞通过苏木精和伊红染色(阁下)。对照组显示正常的心肌细胞形态(图8 (c))。然而,许多细长的心肌细胞出现在IGF1击倒组(图8 (d)),这表明,心肌细胞发展受阻。

心肌损伤和超微结构的损伤在图所示8 (f)。血管破裂和增加组织间隙中观察到IGF1-deficient胆小鬼组比正常组(图8 (e))。

4所示。讨论

IGF1多肽亲神经的因素与胰岛素类似的结构和功能。IGF1的单链蛋白质,促进细胞分化和增殖,它有一个广泛的生物功能和参与各种器官的调节。IGF1扮演着一个重要的角色在人类和脊椎动物胚胎的发展23]。在目前的研究中,我们建立了一个IGF1击倒模型体内和体外转染的小干扰RNA (siRNA)和IGF1的mRNA和蛋白水平检测支持这一点。重大损伤心肌组织,血管断裂,并增加组织间隙被观察到在IGF1-deficient鸡心脏通过组织病理学观察,证明IGF1抑制导致心肌细胞和心肌组织的发育不良。

生理条件下自由基的浓度很低,这是很重要的细胞信号调节、代谢、生存和凋亡[24,25]。然而,大量的自由基诱导生物体是由物理因素刺激或外源性化学物质;自由基可以共价结合《peroxidize生物膜脂质生产各种毒性作用[26),这可能导致许多疾病,如心肌梗死的发生(27,28和各种癌症29日]。氧自由基可使脂质脂肪酸脂质过氧化物和进一步分解为一系列复杂的化合物,包括MDA;因此,脂质氧化的程度可以检测到MDA的水平30.]。伊诺是一种氧化应激(自由基),利用一氧化氮,可在细胞受到刺激时产生,激活。细胞可以形成一个复杂的抗氧化酶防御系统,主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽,等等,可以保护人体免受过氧化损伤(26,31日]。SOD可以消除体内的自由基,保护细胞免受自由基损伤。SOD活性水平反映了antifree自由基的能力。SOD可以转换超氧化物阴离子(O2^{- - - - - -})H₂O₂,和猫将H₂O₂成水,有毒啊₂^{- - - - - -}和H₂O₂转化成无害的水分子(32,33]。谷胱甘肽是催化转化为氧化谷胱甘肽(GSSH)氧化酶的协助下,可以减少氧化物质,减轻其毒性(34,35]。近年来,IGF1逐渐发现的抗氧化功能;Tumati等人发现低IGF1可以诱导过度ROS,将进一步放缓JNK-induced上皮cytoprotection [36]。ROS,作为一种重要的内源性体内刺激器,可以刺激多种途径包括心肌发展。Huk等人发现,ROS作为第二信使来影响心脏瓣膜发展(37]。ROS可能参与不良心脏重构(38]。在我们目前的研究中,我们发现,减少IGF1的表达导致增加活性氧生成,表明IGF1可能参与活性氧的规定和氧化应激的发生。IGF1显著减少了猫、SOD、谷胱甘肽,氧化酶活动体内和体外。这些变化是伴随着T-AOC下降,这是一个重要的指标来确定人体的抗氧化能力;与此同时,伊诺的表达显著增加。这些结果表明,IGF1抑制可以显著降低人体的抗氧化能力,充实许多体内氧自由基;这可能是心肌损伤和发育不良的重要原因之一。

FOXO,一个高度保守的转录调控蛋白,是一种下游蛋白的PI3K / Akt, AMPK / 14-3-3信号通路(39,40]。PI3K / Akt / FOXO信号通路参与各种生理过程的调节,如增殖,凋亡和胰岛素抵抗。PI3K / Akt通路可以被激活了这些刺激,和ROS是最重要的因素之一。脂肪形成的分化可以通过激活介导的氧化应激的PI3K / Akt通路在初级鼠成骨细胞(41]。施迪等人发现IGF1 / PI3K / Akt通路起着重要的作用在防止泛素连接酶的表达通过抑制FOXO转录因子(42]。AMPK在真核细胞是一种重要的蛋白激酶。AMPK的能源监管能维持正常的心肌细胞ATP水平(43]。AMPK调节全身能量的利用率,这被认为是能源监管机构(44]。FOXO是一个重要的下游分子AMPK参与信号转导和调节各种细胞生物学过程,如抑制细胞增殖和促进细胞凋亡45,46]。IGF1刺激可以减少AMPK水平磷酸化在F1和F3/4颗粒细胞(47]。Hinchy证明了线粒体活性氧释放可以激活AMPK间接(48]。此外,FOXO已被证明是需要在内皮而不是心肌细胞谱系在心血管发育(49]。Evans-Anderson等人证明FOXO转录因子是一种消极监管机构(心脏发育期间的心肌细胞增殖50]。在我们目前的研究中,我们发现IGF1损耗抑制IRS1的表达,PI3K,和一种蛋白激酶调节mRNA和蛋白表达AMPK和FOXO;与此同时,物的表达显著增加IGF1抑制组,这是重要的IRS1上游。这些结果表明,IGF1击倒可以通过抑制激活FOXO IRS1的表达。结合ROS的结果,我们得出的结论是,IGF1抑制引发活性氧释放激活FOXO,进一步抑制心肌的发展。

线粒体作为能源转换器在动物细胞,是细胞内的主要网站氧化磷酸化和ATP的形成。Pawlikowska等人表明,线粒体是基本细胞器insulin-mediated肌肉形成和胰岛素刺激线粒体和促进线粒体功能(51]。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs) IGF家庭的重要部分;IGFBPs无法与胰岛素结合而形成一个与igf复杂。他们可以调节胚胎的正常生长和产后器官,也是一个非常重要的工具,IGF1运输和存储。IGF1-IGFBP复杂会分解和释放IGF1,这将进一步结合在细胞膜IGF1R的催化下红外(52]。IGF1保护从分解的高亲和力和IGFBP,延长半衰期IGF1体内循环的细胞。IGFBPs避免身体对胰岛素过量的负面影响,减少血液中自由IGF1的浓度。此外,研究表明,IGFBP可以帮助IGF1识别靶细胞,调节IGF1的活动(53]。IGF1-IGFBP复杂会导致一连串的各种磷酸化过程的细胞,最终导致葡萄糖转运体分子的条目(GLUT1、3和8)进入细胞膜,增加细胞中葡萄糖的速率传输。葡萄糖运输主要依赖于过剩,它起着重要的作用在调节葡萄糖运输和维护心脏能量平衡(54]。IGF1RS /国税局通过PI3K / Akt信号调节细胞能量代谢信号通路,和其下游基因已经被发现55]。FOXO起着重要的作用在调节胰岛素和生长因子的影响不同的生理功能(56]。在目前的研究中,我们证明了IGF1击倒显著减少的表达GLUT3 IGFBP,表明IGF1抑制能量代谢。进一步验证这些结果,我们也发现了ATP含量和耗氧率在两个不同的组织;结果显示,IGF1击倒可以极大地阻碍心肌细胞利用氧的能力,从而减少生产ATP。考虑我们的结果显示FOXO激活IGF1击倒,我们得出这样的结论:FOXO可以抑制心肌发展通过干扰心肌能量代谢。

肌原性的监管因素(mrf)是阳性的类监管机构决定cell-directed分化的功能。磁流变液在脊椎动物肌肉发展至关重要56]。磁流变液包括MYF5, MyoD、MyoG MRF4;磁流变液的作用是将间充质干细胞转变为成肌细胞,这将进一步激发和维持细胞的分化状态。磁流变液家族的每个成员扮演不同的角色在不同的州。MyoD和MYF5扮演重要的角色在细胞的增殖早期阶段(57]。MYF5负责成肌细胞增殖,MyoD调节成肌细胞的分化过程。MyoG MRF4可以推动终端分化。成肌细胞的增殖过程MyoG后是正常的,但随后的分化过程显著抑制(58]。Mesp1和Mesp2关键基因在调节心脏分化。Mesp1可以直接激活其他基因在心脏核心绑定到其他基因启动子在心肌细胞。Mesp1和减少Mesp2可以阻碍了心发展59]。GATA4和Nkx2.5转录因子参与心脏发展和超表达GATA4可以加速心肌分化(60]。胚胎早期发育需要的生产和消耗大量的细胞生长的细胞能量。胰岛素可以通过中介调节骨骼肌细胞分化的激活MAPK和PKB磷酸化61年]。Montarras等人证明了胰岛素或IGF是细胞分化所必需的62年]。细胞能量代谢,其中包含脂肪酸参与胎儿心脏发育(63年]。在目前的研究中,我们发现IGF1击倒可以显著减少的表达MyoD, Mesp1, MYF5, MYF6, GATA4, GATA6, Nkx2.5,表明IGF1抑制可以阻止心肌发展。我们建议减少能量代谢抑制心肌发展因素的表达通过关于能量代谢的综合结果。

综上所述,我们得出结论,IGF1击倒阻碍心肌发展通过ROS-dependent FOXO激活能量代谢障碍引起的鸡的心。我们的研究结果表明IGF1的心肌细胞的新假说。

缩写

IGF1:	胰岛素样生长因子1
igf:	胰岛素样生长因子
IGF1R:	胰岛素样生长因子1受体
IGF2:	胰岛素样生长因子2
“大酒店”:	生长激素
骨形态发生蛋白:	骨形态发生蛋白
FGF4:	纤维母细胞生长因子4
红外光谱:	胰岛素受体
IGFR:	胰岛素样生长因子受体
IRR:	胰岛素受体相关受体
TK:	酪氨酸激酶
国税局:	胰岛素受体底物
PI3K:	磷脂酰肌醇3-kinase
VEGF:	血管内皮生长因子
ROS:	活性氧
H2O2:	过氧化氢
谷胱甘肽:	谷胱甘肽
氧化酶:	谷胱甘肽过氧化物酶
猫:	过氧化氢酶
MDA:	丙二醛
伊诺:	诱导一氧化氮合酶
SOD:	超氧化物歧化酶
T-AOC:	总抗氧化能力
IGFBP1:	胰岛素样生长因子结合蛋白1
IGFBP2:	胰岛素样生长因子结合蛋白2
IGFBP3:	胰岛素样生长因子结合蛋白3
IGFBP4:	胰岛素样生长因子结合蛋白4
IGFBP5:	胰岛素样生长因子结合蛋白5
IGFBP7:	胰岛素样生长因子结合蛋白7
GLUT1:	葡萄糖转运蛋白1
GLUT3:	葡萄糖转运蛋白3
GLUT8:	葡萄糖转运蛋白8
一种蛋白激酶:	Threonine-protein激酶
P-Akt:	Phosphorylation-threonine-protein激酶
FOXO:	Forkhead盒蛋白质
P-FOXO:	Phosphorylation-forkhead盒蛋白质
物:	c-Jun n端激酶
P-JNK:	Phosphorylation-c-Jun n端激酶
GATA4:	GATA-binding蛋白4
GATA6:	GATA-binding蛋白6
Nkx2.5:	NK2同源框5
AMPK:	活化蛋白激酶
MyoG:	Myogenin
Mesp1:	心脏转录因子中胚层后1
MYF5:	5肌原性的因素
MYF6:	肌原性的因子6
O2- - - - - -:	超氧化物阴离子
GSSH:	氧化谷胱甘肽
ATP:	三磷酸腺苷
IGFBPs:	胰岛素样生长因子结合蛋白
磁流变液:	肌原性的管理因素
MAPK:	增殖蛋白激酶
Nrf2:	核转录因子2红细胞两个相关因素
PBS:	磷酸盐溶液
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者读了手稿,同意提交当前形式考虑出版的杂志。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(31872531)、中国农业研究系统(没有专项基金。汽车35-04),资助动物营养学国家重点实验室(2004 da125184f1725),基于成绩的黑龙江省的返回海外学生资助(2018 qd0005),黑龙江省博士后基金项目“学术骨干”的东北农业大学(17 xg11)。

补充材料

整个手稿的图形抽象。(补充材料)

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