文摘

氧化低密度脂蛋白(oxLDL)动脉粥样硬化的发病机理中发挥关键作用的激活炎症信号事件最终导致内皮功能障碍和衰老。在目前的工作中,我们调查了indicaxanthin的影响,生物有效性,redox-modulating植物化学的仙人掌属植物榕树籼水果,抗炎活动,反对oxLDL-induced内皮功能障碍。人类脐静脉索细胞(HUVEC)与人类oxLDL刺激,和indicaxanthin被评估的影响范围5 - 20μ米,与水果餐后血浆水平一致(7μ米)。预处理indicaxanthin显著和concentration-dependently抑制oxLDL-induced细胞毒性;ICAM-1、VCAM-1 ELAM-1增加;和ABC-A1减少蛋白质和mRNA水平。从机械的角度来看,我们也提供了证据,indicaxanthin的保护作用是redox-dependent和相关色素抑制NF -的功效κB转录活动。总之,在这里我们将演示indicaxanthin小说,饮食植物化学的,能够起到显著的保护血管作用在体外营养浓度相关。

1。介绍

动脉粥样硬化是一个长期的、多因子的炎症过程的特点是脂类的积累在墙上的大型和中型动脉(1,2]。根据氧化理论的动脉粥样硬化,其修改在过去的十年里,高胆固醇血症是这种情况的主要危险因素之一,因为它触发的积累氧化低密度脂蛋白(oxLDL) subintimal空间(1,2]。在动脉粥样硬化的风险(例如,在动脉分岔),动荡的血液流动诱发内皮细胞激活,以局部炎症反应,生成一个细胞内的氧化和nitrosative压力(3]。活性氧和氮水平的增加物种(罗恩)激活选择redox-dependent转录因子,如NF -κB,这进而诱导内皮细胞粘附分子的超表达如ICAM-1 VCAM-1, ELAM-1 [1,2]。这种现象会增加白细胞的粘附,最终在皮下空间轮回,他们在巨噬细胞被转换。同时,增强内皮通透性偏好低密度脂蛋白的涌入到皮下内膜的炎症细胞产生罗恩诱导累进LDL氧化。oxLDL,与内皮细胞(EC)交互,破坏血管内皮细胞的抗氧化防御系统,提高白细胞趋化作用,加强整个炎症反应导致持久EC功能障碍。因此,建立慢性全身性炎症反应,最终导致巨噬细胞的增殖泡沫细胞和脂肪条纹的形成,动脉粥样硬化早期病变的标志(3]。

与低密度脂蛋白在动脉粥样硬化的关键作用,磷酸腺苷盒式A1 (ABC-A1),胆固醇流出系统存在于所有组织,包括内皮,已经证明提供antiatherogenic保护(4,5]。确实,在生理条件下,合成胆固醇流出从欧共体到ABC-A1维持胆固醇体内平衡。扰动流和oxLDL抑制ABC-A1-mediated胆固醇流出。因此,胆固醇是通过其他途径可能导致脂质沉积在皮下空间(4- - - - - -6]。

尽管动脉粥样硬化的氧化理论的坚实基础,绝大多数的临床试验和结果出人意料地得出这样的结论:抗氧化维生素补充剂对心血管事件没有有益的影响。另一方面,“地中海饮食”和减少之间的联系主要慢性退化性疾病,包括心血管的,健壮的和决定性的1,7,8),这表明其他的参与redox-dependent分子控制。相比其他水果内的“地中海饮食”(例如,橘子,柠檬和葡萄),仙人掌梨(仙人掌属植物榕树籼L轧机)水果是减少消耗和研究,尽管其丰度在选定地区的意大利,西班牙,希腊,和北非国家。

Indicaxanthin(图1),一个betalain色素从仙人掌梨果实,一直良好的实验工作的对象在过去年9]。和许多植物化学物质一样,它是一个redox-active化合物和已被证明作为抗氧化的在体外研究[9]。有趣的是,由于其带电部分,得组,亲脂性的根,它是两亲性10),并通过与细胞膜相互作用[11]。这个特性允许生物活性化合物与细胞相互作用至关重要并启动信号事件。在这方面,indicaxanthin可以调节特定redox-dependent信号通路参与巨噬细胞活化和细胞凋亡和上皮和内皮功能障碍在体外(9,12,13]。值得注意的是,与大多数饮食植物化学物质,indicaxanthin高度生物利用率(14]。分子已被证明改变肠道上皮细胞在体外被吸收通过paracellular连接(11]。符合,indicaxanthin被发现在人血浆7μM峰值浓度3 h后四个仙人掌梨水果的摄入含有28 mg的色素14]。此外,其amphiphilicity允许穿过血脑屏障,位于中枢神经系统,调节其生物活性(15]。最后,由于其生物利用度和redox-modulating属性,indicaxanthin施加显著的药理作用在活的有机体内。事实上,口服营养的植物化学的相关剂量(2μ摩尔/公斤)生成、大鼠血浆峰浓度为0.2μM能够发挥强大的抗炎作用在急性炎症模型16]。

之间的强烈联系炎症,动脉粥样硬化,和饮食,抗炎和redox-modulating indicaxanthin的性质,这项工作的目的是评估的植物化学成分的影响,在营养浓度相关,在一个在体外先天免疫激活模型由oxLDL-induced内皮功能障碍。为此,我们调查是否indicaxanthin防止oxLDL-mediated粘附分子过度,差别和ABC-A1对这些基因在人类培养电子商务。机械的细节redox-dependent NF -κB转录活动也被调查。

2。材料和方法

2.1。试剂

除非另有说明,所有试剂都来自Sigma-Aldrich(意大利米兰)和可用的最高纯度等级。

2.2。提取和纯化的Indicaxanthin仙人掌梨果实

Indicaxanthin隔绝仙人掌梨(仙人掌属植物榕树籼(黄色)水果品种)如前所述16]。

2.3。隔离和人类的低密度脂蛋白的氧化

健康受试者的血样与知情同意通宵禁食后得到。低密度脂蛋白是孤立的从等离子体如前所述17)和稀释到100μg蛋白在PBS /毫升。蛋白质浓度的粒子是由布拉德福德评估分析报告(其他地方17]。

整除的本地LDL (nLDL)接受了脂质氧化治疗5μM CuSO₄在37°C 24 h,如前所述[14]。

低密度脂蛋白的氧化态,共轭二烯烃(CD)氢过氧化物和硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS),被评为之前报道(14]。

oxLDL然后集中与离心过滤器设备根据制造商的指示(微孔、米兰、意大利)值为100μg蛋白/毫升。所有样品(nLDL和oxLDL) filter-sterilized (0.2μ米微孔过滤器、意大利米兰)整除,储存在-80°C到一个月。

2.4。细胞培养

HUVEC(人类脐静脉内皮细胞)从Lonza购买(意大利米兰),生长在内皮生长介质(Lonza) 37°C下湿润孵化器有限公司5%₂亚文化的胰蛋白酶化,并使用通道4。

2.5。HUVEC治疗

为了进行实验,细胞被播种在6-well板块2×10的密度⁴细胞/。在80%的融合,HUVEC孵化,隔夜饥饿后,没有(控制单元)或100年的存在μ为16 h g oxLDL /毫升无血清内皮基底介质(Lonza、米兰、意大利)。必要时,HUVEC 1 h和预处理indicaxanthin然后刺激oxLDL如上所述。

2.6。细胞生存能力测试

细胞毒性的oxLDL评估通过MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl-2H溴化四唑)转换试验根据制造商的指示(表达载体、米兰、意大利)。细胞生存能力表示为吸光度值测量控制HUVEC的百分比。

2.7。流式细胞术分析

孵化时间,年底HUVEC用PBS,收获与细胞分离介质,和稀释清洗包含PBS缓冲,0.1%牛血清白蛋白,CaCl 1毫米₂。整除(0.1 - 0.5×10⁶细胞在20μl)被播种在96孔板和孵化与2 4°Cμg /好鼠标反ICAM-1 VCAM-1或ELAM-1 ABC-A1单克隆抗体FITC-conjugated(表达载体、米兰、意大利)。在4°C 1 h后,细胞被清洗和分析为荧光流式细胞分析仪(史诗II,贝克曼库尔特,美国)。至少20000事件对每个样本进行分析。数据表示为平均荧光强度(MFI)单位,测量FL1(绿色)频道488海里(激励)和530 nm(排放)滤波器组。

罗恩浓度被染色的细胞2评估 ,7-dichlorofluorescin二醋酸盐染料(DCFDA)报道其他地方18]。

2.8。定量实时逆转录聚合酶链反应

总RNA被雇佣一个孤立RNeasy迷你工具按照制造商的指示(试剂盒、米兰、意大利)。RNA (5 - 10μg)使用上标然后reverse-transcribed cDNA三世逆转录酶后,制造商的协议(表达载体、米兰、意大利)和存储在-20°C到测试。实时PCR ICAM-1、VCAM-1 ELAM-1或ABC-A1 glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PDH)进行实时RT™SYBR绿色RT PCR混合和大师²PCR引物按照制造商的指令集(SuperArray、米兰、意大利)使用ABI棱镜7700序列检测系统(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)。以下引物被用于本研究:人类VCAM-1: 5(向前) - - - - - -CTTAAAATGCCTGGGAAGATGGT-3 ,(反向)5 - - - - - -GTCAATGAGACGGAGTCACCAAT-3 ;人类ICAM-1(前锋):5 - - - - - -GGCTGGAGCTGTTTGAGAAC-3 ,(反向)5 - - - - - -CTGACAAGTTGTGGGGGAGT-3 ;人类ELAM-1(前锋):5 - - - - - -GCCTGCAATGTGGTTGAGTG-3 ,(反向)5 - - - - - -ACGAACCCATTGGCTGGATT-3 ;人类ABC-A1(前锋):5 - - - - - -TGTCCAGTCCAGTAATGGTTCTGT-3 ,(反向)5 - - - - - -CGAGATATGGTCCGGATTGC-3 );和人类GAPDH(前锋):5 - - - - - -CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ,(反向)5 - - - - - -CCAGGCGCCCAATACG-3。热循环条件包括预运行2分钟的50°C和15分钟在95°C紧随其后40周期在95°C 30年代,30年代55°C, 72°C 30年代。RT²pcr数据量化阈值(Ct)的周期值,和每个基因的相对表达规范化管家GAPDH基因。

2.9。报告基因分析

NF -κB活动使转染了HUVEC与pNF。虽然κB-Luc荧光素酶构建(美国CA Stratagene)报道其他地方(19]。转染HUVEC cocultured 100μM oxLDL缺席或indicaxanthin如上详细的存在。6 h后,细胞与PBS和细胞溶解洗5分钟在4°C使用裂解缓冲根据制造商的指示(美国WI Promega)。荧光素酶活动表示为相对发光单元(RLU)×10³后阅读TD / 2020光度计(特纳生物系统、钙、美国)。

2.10。统计分析

所有的实验报告的数据 。数据进行分析,提出了使用GraphPad棱镜软件(GraphPad)。比较两个值都用学生的 - - - - - -测试和 指定了三重星号。由单向方差分析进行多重比较(方差分析)其次是图基的修正。意义是当零假设被拒绝接受 的水平。

3所示。结果

3.1。oxLDL的氧化状态评估

的氧化状态oxLDL被分析CD氢过氧化物和TBARS水平评估。nLDL相比,治疗5μM CuSO₄24小时确定显著增加( )CD和TBARS粒子(图2)。

3.2。影响Indicaxanthin oxLDL-Treated EC的可行性

与100年HUVEC的孵化μg oxLDL /毫升16 h决定明显降低( )细胞的生存能力比控制EC(图3)。另一方面,与indicaxanthin HUVEC 5的预处理μ米没有改善细胞生存能力,在15μM引起显著( )抑制细胞死亡是完全阻止20μM indicaxanthin(图3)。

3.3。Indicaxanthin对oxLDL-Induced蛋白质和mRNA Upregulation EC的粘附分子

与100年HUVEC的孵化μg oxLDL /毫升16 h诱导显著( )增加ICAM-1、VCAM-1 ELAM-1有关蛋白质和mRNA水平(数字4(一)- - - - - -4 (f)与控制细胞相比,分别)。值得注意的,预处理的EC indicaxanthin 5到20之间的浓度范围μ引起显著( )所有上面所引的粘附分子的浓度减少对蛋白质和mRNA水平(数字4(一)- - - - - -4 (f)分别)。重要的是,培养的EC 20μM indicaxanthin没有oxLDL没有修改粘附分子,对蛋白质和mRNA水平,相比,HUVEC的控制。

3.4。Indicaxanthin对EC的ABC-A1差别oxLDL-Induced对这些的影响

与100年欧共体的刺激μg oxLDL /毫升诱导显著( )减少ABC-A1有关蛋白质和mRNA水平,相比,控制HUVEC(数字5(一个)和5 (b)分别)。值得注意的,预处理EC与indicaxanthin 5到20之间μ引起显著( )浓度增加ABC-A1表达式,对蛋白质和mRNA水平(图5)。另一方面,培养的EC 20μM indicaxanthin没有oxLDL没有修改ABC-A1蛋白质和mRNA水平,相比,HUVEC的控制。

3.5。影响的Indicaxanthin oxLDL-Induced罗恩生产

与控制HUVEC相比,与100年欧共体的刺激μg oxLDL /毫升诱导显著增加的罗恩水平( )(图6)。另一方面,预处理的EC indicaxanthin 5到20之间的浓度范围μ引起显著( )浓度减少室内的罗恩生产相比,控制EC(图6)。相反,孵化的EC 20μM indicaxanthin没有oxLDL没有修改罗恩水平,相比,HUVEC的控制。

3.6。Indicaxanthin oxLDL-Induced NF -的影响κB转录活动

与100年欧共体的刺激μg oxLDL /毫升诱导显著( )增加了NF -κB转录活动,与控制HUVEC相比(图7)。值得注意的,预处理的EC indicaxanthin 5到20之间的浓度范围μ引起显著( )浓度降低的转录活动(图7)。另一方面,培养的EC 20μM indicaxanthin没有oxLDL没有修改NF -的转录活动κB相比,HUVEC的控制。

4所示。讨论

目前的调查属于激烈的研究饮食和免疫功能之间的相互作用。单位、数量和保护剂的作用机制,我们认为通过日常饮食在很大程度上仍未知,需要进一步的研究。然而,定义适当的临床试验之前,通过合适的评估是至关重要的在体外化验,植物衍生的化合物的促进健康的影响,以确定最有前途的(1- - - - - -3]。

符合这个角度看,我们调查的保护作用对indicaxanthin从仙人掌梨水果,营养浓度相关,在一个在体外先天免疫激活模型由oxLDL-induced内皮功能障碍。我们的研究结果表明,indicaxanthin保护EC oxLDL-induced损害在体外评估,增加电子商务的可行性进行预处理与植物化学的范围在15至20μm . ICAM-1 VCAM-1, ELAM-1超表达是发病的关键事件和电子商务发展的障碍。贴切地,它不仅增加indicaxanthin细胞生存能力还保存的细胞功能抵消oxLDL-induced粘附分子过度,从5到20μm .从机械的角度来看,这些影响是由调制基因表达的差别,导致了对这些ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1 mRNA水平。

如上所述,很多植物化学物质显示免疫调节效应,在体外。然而,这些化合物的就业的主要限制是他们较低的生物利用度。恰恰相反,现在的结果出现的利益indicaxanthin有效营养相关的浓度,实现在人类摄入的水果14]。

已是不争的内皮细胞粘附分子表达是几个redox-regulated转录因子的控制,包括主看守者NF -κB (20.]。此外,oxLDL已经演示了各种转录因子激活,NF -κ包括B。符合这一点,这里展示了一个抑制NF - indicaxanthin的转录活动κb .这个结果看起来符合我们之前报道的发现在NF -κB-dependent indicaxanthin的免疫调节和抗炎作用在活的有机体内和在体外。贴切地,抑制NF -κB转录活动似乎是严格一致的能力indicaxanthin抑制oxLDL-induced细胞内的氧化和nitrosative压力。沿着这些线路,所以我们提议的植物化学的中和oxLDL-induced粘附分子过度通过抑制NF -κB转录活动,通过redox-dependent机制。

连同ICAM-1、VCAM-1 ELAM-1过度,破坏反向胆固醇转移在内皮,差别通过ABC-A1对这些代表了电子商务功能障碍的另一个关键方面和胆固醇在动脉壁沉积。众所周知,oxLDL减少ABC-A1水平欧共体通过抑制肝X受体(LXR) [4]。我们发现这里,indicaxanthin抵消oxLDL-induced。差别ABC-A1对这些观察到的抑制性影响indicaxanthin NF -的转录活动κB也可以与它能够抵消oxLDL-induced。差别ABC-A1对这些事实上,一些证据表明,ABC-A1可以调节,而不是通过LXR通路的激活,通过redox-sensitive ERK / NF -的抑制κB通路(21- - - - - -25]。

最后,尽管indicaxanthin 5μM不改善电子商务可行性,,然而,显著降低粘附分子过度,NF -κB转录活性,罗恩生产和增加ABCA-1表达式。

5。结论

评估活动的健康、植物的化合物通过适当选择最有前途的在体外化验之前必须定义适当的临床试验。我们这里证明indicaxanthin、可利用redox-modulating植物化学的抗炎活性,能够产生显著的保护作用在体外模型的血管炎症,在营养相关的浓度。根据其调节能力具体内皮基因参与白细胞粘附和胆固醇运输,通过redox-dependent NF -κB-mediated机制,indicaxanthin可能进一步调查在活的有机体内作为一个潜在的endothelial-protective代理的膳食来源。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目是由一个在其2014 - 2020年Ricerca e Innovazione授予意大利教育部,大学和研究,题为“PROGEMA——工艺绿色/ l 'Estrazione di Principi Attivi e la Depurazione di Matrici di Scarto e非”(ARS01_00432)电脑