文摘
客观的。在这项研究中,我们评估的有效性辛伐他汀治疗非酒精性脂肪肝炎蛋氨酸和choline-deficient饮食诱导的小鼠及其可能的影响因素参与了疾病的发病机制,包括氧化应激和内质网应激。方法。男性C57BL6小鼠喂养正常饮食(控制)或蛋氨酸和choline-deficient饮食治疗4周,然后口头与辛伐他汀(4毫克/公斤每天一次)两个最后几周。最后实验时间、肝脏完整性、生化分析、肝脂质,组织学,DNA损伤、氧化应激生物标志物,内质网压力评估。结果。辛伐他汀治疗能显著降低肝损伤酶和肝脂质和降低肝细胞膨胀的程度,没有显示基因毒性效应。辛伐他汀引起显著降低脂质过氧化作用,一些抗氧化剂酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的变化。辛伐他汀通过Nrf2激活抗氧化酶,抑制肝脏内质网应激。结论。总之,研究结果提供的证据表明,在小鼠实验非酒精性脂肪肝炎引起的蛋氨酸和choline-deficient饮食,减少肝损伤的辛伐他汀与减毒氧化和内质网应激相关。
1。介绍
非酒精性脂肪肝(NASH)是一种常见的慢性肝病,和它的一个重要因素导致肝硬化和肝细胞癌(1]。纳什是一个重要的发展阶段,从简单的肝脂肪变性,肝纤维化、肝硬化的非酒精性脂肪肝病(NAFLD),表现为肝细胞气球样变性和坏死性炎症基于肝脂肪变性2,3]。
NASH的发病机理仍然知之甚少。一天,詹姆斯(4)提出了“两支安打”假说基于动物模型的NASH的发病机制仍然是一个基础研究在这个领域。根据这一理论,肝脂肪变性主要是代谢综合征引起的(第一个)。第二个打击包括细胞压力如氧化应激、细胞凋亡,内质网(ER)压力,gut-derived脂多糖(LPS) [3]。因此,经典的“两支安打”假说的发展为纳什正在由“多个平行的支安打”假说(修改5]。在上述因素生成第二个打击,氧化压力被认为是导致脂肪变性的发病和进展的主要因素纳什(5]。可用的治疗并不完全令人满意,综上所述,非酒精性脂肪肝和纳什是多学科的肝脏疾病,需要干预措施针对代谢疾病和肝脏疾病的有效治疗这些疾病的患者(6]。
他汀类药物(3-hydroxy-3-methyglutaryl辅酶A还原酶抑制剂)在全球范围内用于治疗脂质紊乱;特别是,他们减少了高水平的低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),从而减少心血管疾病和死亡率(7]。然而,有越来越多的文献中的数据显示,他汀类药物,如辛伐他汀(SIM),也可以起到抗炎作用,如抑制细胞因子的形成、粘附分子的表达,减少一氧化氮产量(8- - - - - -11),所有这些都可能有价值的防止病理性炎症和组织损伤。
有大量的样本试验和低风险的偏见是必要的在我们可能会建议他汀类药物作为NASH患者的有效治疗。但是,他汀类药物可以改善其他条件通常与纳什有关的不良结果(例如,hyperlipidaemia、糖尿病和代谢综合症),其使用在非酒精性脂肪肝炎患者可能是合理的(12]。
在这项研究中,我们评估SIM治疗的安全性和有效性纳什诱导蛋氨酸和choline-deficient (MCD)小鼠的饮食。本研究的目的是评估这种药物在疾病进展的影响,肝脏完整性和分子标记的氧化应激和ER应激。
2。方法
2.1。动物
在这个试验中,32岁的雄性C57BL / 6小鼠。8周大,平均重25克,并获得佩洛塔斯联邦大学的(UFPel)、回力球,南里奥格兰德。聚丙烯的动物被关在笼子里( 与4 - 6厘米),在标准条件下每个笼子里的动物。他们提供水和食物随意和保持12小时光/暗周期(光周期从7点到下午7点)温度控制( )和湿度( )动物实验部门的医院丹尼·德·阿雷格里港。
2.2。饮食成分
MCD饮食是由巴西公司PragSolucoes®,所描述的Newberne et al。13与修改),指出在Marcolin et al。14]。两种类型的鼠粮生产:MCD和控制。控制饮食是相同的MCD饮食但含有足量的蛋氨酸和胆碱。
2.3。实验的程序
实验建立的协议符合规范伦理和健康研究委员会的研究和研究生的研究医院丹尼阿雷格里港,以及研究涉及动物的原则(15]。纳什被喂养的动物诱导MCD饮食随意4周。对照组的动物收到同样的饮食,尽管添加足够的蛋氨酸和胆碱的浓度。动物被随机分为四组( ):控制+车辆(CO + V)收到了4周+车辆控制饮食;控制+ SIM 4毫克/公斤(SIM 4),获得了控制饮食4周+辛伐他汀4毫克/公斤;纳什+车辆(纳什+ V),获得了MCD饮食4周+车辆;和纳什+ SIM 4毫克/公斤(纳什+ SIM 4),这对于4周收到了MCD饮食+辛伐他汀4毫克/公斤。SIM是由填喂法2周。汽车是由羧甲基纤维素钠(CMCNa) 1%,充当一个载体SIM (16]。
2.4。实验设计
在实验的第一天,动物被随机分配到组,给出相应的饮食。他们监视整个实验。四个星期后,他们被吸入异氟烷的称重和麻醉,这样他们的血液可以采样肝脏retroorbital丛的完整性和生化分析。动物被杀害在SIM上届政府后24 h,深麻醉下放血,紧随其后的是颈椎错位中描述美国兽医协会的指导方针在安乐死17]。肝脏被通过媒介腹剖腹手术总肝切除术,其中一部分是准备组织学分析,而其余组织在液态氮冷冻甘油三酸酯和胆固醇浓度,彗星试验,氧化应激和网状应力分析。
2.5。彗星试验
描述的碱性彗星试验进行了泰斯et al。18),小的修改。图像100随机选择的细胞(50细胞从每个两个复制幻灯片)从每个动物进行了分析。细胞也在视觉上得分根据尾大小为五类从破损(0)最大限度地损坏(4),导致单个DNA损伤分数为每个动物,因此对于每一个研究小组。因此,损伤指数(DI)的范围可以从0(完全破损, )到400(最大的伤害, )。
2.6。肝脏完整性分析
肝脏完整性评估通过测量血液中的酶天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和标准实验室方法在医院丹尼·德·阿雷格里港。
2.7。总胆固醇和甘油三酸酯分析
系统性生化分析包括总胆固醇和甘油三酸酯水平。他们使用标准的实验室测定方法在医院丹尼·德·阿雷格里港。
2.8。肝脂质
为了测量肝脏脂质含量,冻在冰上肝脏样本解冻,均质在去离子水。提取和分离的脂质产生脂质提取进行了干。脂质提取的肝脏胆固醇和甘油三酯含量被化验酶比色法。
2.9。组织学
肝脏的组织学评估,一块被浸泡在10%削减和固定缓冲福尔马林24 h。获得块在一系列分级的乙醇脱水,嵌入在石蜡,苏木精和伊红染色(他)。纳什的最小组织学诊断标准与肝细胞脂肪变性的存在相关膨胀涉及区3和小叶炎症浸润。坏死炎性组织活性的分级和纤维化进行冲击等提出的分类。19]。
2.10。脂质过氧化反应,胞质超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)
9毫升的肝脏是均质磷酸盐缓冲剂(氯化钾140毫米,磷酸20毫米,pH值7.4)每克组织。这些肝匀浆中的蛋白质浓度测定用标准溶液的牛白蛋白据布拉德福德(20.]。肝脏lipoperoxidation由TBARS决定(21]。胞质SOD是化验spectrophotometrically肾上腺素自氧化速率,这是逐步被越来越多的匀浆SOD;的酶量导致了50%的最大抑制被定义为1单位SOD /毫克港。GPx分析是根据Flohe et al。22]基于消费减少氧化谷胱甘肽的NADPH和价值观在nmol /毫克普罗特表示。
2.11。免疫印迹
免疫印迹分析胞质及核从肝匀浆提取做好准备。浮在表面的分数被收集并存储在-80°C整除,直到使用。蛋白质浓度测定的布拉德福德试验(20.]。溶菌产物蛋白质被钠十二烷基分馏sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被封锁与脱脂奶粉5% Tris-buffered盐水含0.05%渐变20 (ttb) 1 h在室温和探测与多克隆anti-NQO1一夜之间在4°C, anti-Keap1, anti-Nrf2, anti-ATF6,和反毕普/ GRP78抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)在1:200 - 1:1.000与ttb稀释5%脱脂奶粉。绑定主要抗体检测(HRP-with anti-mouse免疫球蛋白,anti-rabbit免疫球蛋白,抗体或免疫球蛋白抗体)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。蛋白质通过化学发光检测进行了使用商业ECL工具包(Amersham法玛西亚生物技术,小都,英国)(23]。特定的乐队的密度与成像密度计量化软件(Scion形象、马里兰、马)。
2.12。统计分析
结果表示为 。使用Student-Newman-Keuls数据进行了分析事后方差分析测试。在彗星试验获得的统计评价数据进行了使用图基的测试。皮尔森的测试(卡方检验)是用于相关性分析。定性变量受到交叉表,显著性水平为5% ( )。软件使用SPSS 17.0。
3所示。结果
3.1。彗星试验
有显著增加DI纳什+ V组(89%)相比CO + V组,表明小鼠纳什表现出增加了肝脏的DNA损伤。4毫克/公斤SIM的剂量可以减少动物的DNA损伤指数实验纳什。DI纳什+ SIM 4(-23%)低于纳什+ V;这是统计学意义。SIM 4毫克/公斤也没有增加DI CO + V相比,表明这个剂量是无法引起DNA损伤(表1)
3.2。肝脏的完整性
血清AST和ALT水平显著升高纳什+ V组相比,那些公司+ V和SIM 4组,显示相当大的肝细胞损伤。AST和ALT显示差异纳什+ SIM 4相比,纳什+ V(表1)。我们的结果表明,一定剂量的4毫克/公斤对转氨酶控制没有影响动物和协助减少AST和ALT NASH-induced动物。
3.3。总胆固醇和甘油三酸酯分析
血清总胆固醇和甘油三酯水平显著降低纳什+ V组相比,那些公司+ V和SIM 4组,尽管没有显著差异观察之间的纳什+ V和纳什+ SIM 4组(表1)。
3.4。肝脂质
虽然动物的血清胆固醇水平的差异与纳什没有观察到,当评估脂质在肝脏组织的数量,我们观察到,在纳什+ V组血清水平明显升高而CO + V和SIM卡(表4组1)。然而,纳什的动物,对待SIM 4毫克/公斤,演示了一个减少(-50%)相比,肝脏中胆固醇的积累NASH动物。
3.5。组织学
没有动物收到公司+ V饮食显示任何组织学变化(数据未显示)。动物的肝脏组织学变化观察纳什+ V组:microvesicular脂肪变性,微小脂肪变性、炎症和肝细胞膨胀(数字1(一)- - - - - -1 (c))。SIM政府明显减毒主不断膨胀的过程(图1 (d)和表2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。脂质过氧化反应,SOD、GPx活性
分析lipoperoxidation(法律流程外包)TBARS有显著提高(300%),纳什+ V组相比,在CO + V组。纳什+ SIM 4显示明显降低(57%)的法律流程外包比纳什+ V(表3)。抗氧化剂酶活性的分析表明,SOD活性降低肝脏的纳什+ V组(-33%)相比CO + V和SIM 4组。SOD活性增加(50.6%)(纳什+ SIM 4)治疗组相比,在纳什+ V组(表3),恢复基线值。关于GPx活性,明显降低(-64%),纳什+ V组相比,CO + V组和GPx活性增加(48%)(纳什+ SIM 4)治疗组相比,在纳什+ V组(表3)。
3.7。免疫印迹
核Nrf2蛋白质underexpressed纳什+ V组。然而,纳什+ SIM 4组动物中也是Nrf2。NQO1表达降低与纳什动物,和纳什+ SIM 4组能增加这种蛋白质的表达(图2)。ER应激相关蛋白标记也被评估。纳什+ V组增加了激活内质网应激标记,ATF-6和GRP78等。SIM足以减少NASH-induced内质网压力(图3)。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们证明了SIM剂量的4毫克/公斤SIM显示良好的衰减结果疾病和不影响肝的完整性,证明安全,没有肝毒性。此外,剂量没有肝基因毒性和显示可以减少氧化应激和C57BL / 6小鼠ER应激纳什。
目前的研究表明,纳什是最重要的流行病学和临床形式的非酒精性脂肪肝。到目前为止,没有完全证明治疗纳什。他汀类药物是一种重要的类制剂治疗血脂异常,但仍不情愿使用这种药物在建立或疑似患者慢性肝脏疾病,包括纳什。本研究寻求证据SIM在肝脏疾病使用。
第一点是评估基因毒性引起的SIM卡。我们测试了三种不同剂量的SIM卡。在初步研究中,DNA损伤的增加动物的肝脏接受剂量的观察7和10毫克/公斤(数据没有显示)。我们的数据表明,有一个高剂量与毒性之间的关系就是明证的DNA损伤率高。显著增加在DNA损伤肝脏纳什组的观察,表明这种疾病可以减少肝脏中基因组的稳定性,确凿的一项研究[14]。最有可能的是,这些影响与NASH的发病机制,特别是关于ROS的生成主要由氧化应激损伤(24]。研究表明,genoprotective或基因毒性的影响SIM(存在剂量依赖的相关性25]。在这里,4毫克/公斤剂量测试没能引起DNA损伤由彗星试验评估。动物与纳什表明DI,增加与SIM和治疗减少了23%,表明DNA的保护作用。此外,DI值纳什+ SIM 4组没有统计学上不同于公司+ V集团加强这个剂量是无法在纳什小鼠诱导DNA损伤,相反,它可以发挥保护作用。
认识到4毫克/公斤的剂量nongenotoxic,我们确定的AST和ALT水平。他们对肝细胞损伤敏感的酶。血液中这些酶可能与小叶中心的坏死,肝脏的退化和降低性能状态(26]。在评价肝细胞损伤,转氨酶变化被观察到的动物收到了MCD饮食。有报告病例statin-related肝毒性,但尽管转氨酶升高接受他汀类药物的患者中并不少见,严重肝损伤从他汀类药物在临床实践中很少见到27]。使用SIM在动物与纳什减少这些酶的水平,降低了肝细胞损伤。
纳什感应的MCD饮食是一个很好的模型,导致脂肪变性由于减少出口的低密度脂蛋白(VLDL)、胆碱和蛋氨酸等前兆的磷脂磷脂酰胆碱衬里VLDL [10]。在缺乏胆碱,VLDL不是分泌和三酰甘油(甘油三酸酯)堆积在肝脏细胞溶质。这些VLDL片段是证实了我们的数据,显示血浆甘油三酯和胆固醇水平下降以及广泛的肝脏脂质积累。因此,量化的肝甘油三酯和胆固醇水平表明,MCD食源性肝脂质积累被SIM减毒治疗。这降低肝脂质积累的结果是非常重要的疾病。减少脂肪在肝脏允许减少膨胀和纳什的组织学特点,改善肝功能,降低ALT和AST证明了这一点。在纳什的MCD膳食模式,动物肝病发展,展示功能组织学上类似于人类的临床病理学特征的纳什(14]。符合我们预期,政府C57BL / 6小鼠的MCD饮食导致古典病理生理的纳什,microvesicular和微小脂肪,表明干扰脂质代谢、炎症细胞积累在肝脏的多个焦点,和不断膨胀的。
阿托伐他汀等他汀类药物在临床研究和SIM与降低肝脂肪变性,可以抑制纳什的发展28- - - - - -30.],他汀类药物改善间接标记的肝脏脂肪变性,如血清glyceraldehyde-derived晚期糖化终产物(31日]。治疗SIM导致显著降低肝细胞膨胀学位的MCD饮食的老鼠的肝脏。许多研究认为肝细胞膨胀纳什的主要组织学特征和常见的纳什的诊断,它甚至可以被视为一个预后标记(19,32]。
氧化DNA损伤是最常见的威胁基因组的稳定性。有强有力的证据暗示ROS的生成和相应的反应氧化应激作为关键因素在一些疾病的发病机理14,33,34]。我们的研究表明,SIM肝DNA的损伤指数下降。我们认为,DNA是强烈的保护与SIM的抗氧化作用有关。然后,我们评估氧化应激和网在肝脏的压力。我们的研究显示动物显著增加法律外包纳什四周MCD饮食引起的。这种损害可以引起活性氧的增加在肝脏组织。在纳什,在某些组织氧化应激增加可能导致法律流程外包的速度上升。类似的数据是在其他研究报告的纳什MCD饮食诱导的(14]。SIM的肝组织管理水平显著降低TBARS动物喂MCD饮食。这些结果与以前的研究调查的影响协议SIM (10,25,35,36]。上述结果表明,仿真可以起到抗氧化作用,保护组织的脂质过氧化代理因为抗氧化剂或自由基的清除剂能抑制氧化反应与法律流程外包。氧化应激参与了纳什的开发和发展,和高水平的ROS,由于抗氧化防御系统的不足,可能导致细胞功能的破坏和膜氧化损伤,提高他们对脂质过氧化反应(4,5]。
核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)是一种转录因子,细胞抗氧化防御系统中起着重要的作用。它与所谓的抗氧化剂反应元素(战神)和调节许多保护性基因的表达以应对氧化应激与亲电试剂。在基础条件下,Nrf2保留在细胞质中绑定到Keap1促进蛋白酶体降解。在接触ROS或其他诱导物,Nrf2从Keap1释放出来,把原子核,它刺激抗氧化基因的表达,如NAD (P) H:醌氧化还原酶1 (NQO1),保护细胞免受活性氧的有害的影响(37- - - - - -39]。然而,Nrf2表达式与纳什动物大大减少。根据杉et al。40),Nrf2导致快速的发生和恶化的损失性脂肪肝动物模型的纳什。我们的研究表明,通过Nrf2 SIM激活抗氧化酶。Habeos et al。41)表明,Nrf2,抗氧化防御的关键调节器,由SIM卡激活。
氧化应激可能与ER应激有关。呃是细胞细胞器的细胞功能和生存的必要条件。条件干扰ER的激活函数导致的蛋白质反应(UPR),自我调节的信号网络,协调ER的恢复功能,并未能适应ER应激导致细胞凋亡。
ER应激反应最近提出了发挥着至关重要的作用在这两种脂肪变性的发展和发展为纳什(42]。ER应激反应是通过激活介导的转录因子6 (ATF6)和一个女伴,glucose-regulated蛋白GRP78。在没有压力的状态,GRP78必将这些跨膜受体。然而,当展开蛋白质积聚在急诊室,GRP78优先结合UPR [40]。
这些标记在动物诱导纳什由于使用MCD饮食,因为这种饮食与一个ER应激通路的激活。GRP78最近显示发挥核心作用调节的敏感性和持续时间UPR [43]。ATF6通路在压力诱导脂质积累中也扮演了重要的角色44]。我们的研究表明,SIM抑制ER应激小鼠肝脏的纳什。尽管采取行动,这种效应的机制还没有完全阐明,城市等。44]表明,SIM预处理对衰减ER应激反应的神经保护作用,同时伴随着ATF6和XBP-1蛋白表达在大鼠急性缺血和再灌注期间,提出了一种新颖的他汀类药物对动脉粥样硬化的保护作用的基础上,发现steraric酸诱导ER应激在巨噬细胞35,43,45]。
总之,辛伐他汀可以帮助治疗NASH和措施建立满足改善心血管和肝脏参数,除了安全、廉价的药物。我们的研究结果支持SIM减少肝损伤的治疗与衰减的氧化应激和ER应激。然而,pleotropic效应背后的分子机制还没有完全阐明和进一步的研究应该进行调查其他的分子机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
手稿是基于格拉罗德里格斯博士的论文。
的利益冲突
本文的作者宣称他们没有利益冲突。
作者的贡献
GR、某人AJM、ASM和ES构想并进行实验。GR、AJM TRP, JNP和GH分析数据。GR和FCD写的手稿。凸轮和NPM构思实验和评估数据。
确认
本研究由巴西支持机构Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),底部de Incentivo尽管e Eventos (FIPE)医院的丹尼·德·阿雷格里港(HCPA), Fundacao德帕罗尽管带动做南里奥格兰德(FAPERGS),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq) Laboratorio de Estresse Oxidativo ULBRA, Laboratorio实验de Hepatologia e Gastroenterologia HCPA / UFRGS。