文摘

神经胶质瘤复发频率高,但缺乏有效的治疗方法和药物抗性普遍引起兴趣探索和开发新的代理商。巴黎巴黎polyphyllins从根茎中提取的单体重楼var.将云南。在这里,我们首先报道,polyphyllin七世(PP7)表现出对神经胶质瘤细胞细胞毒性的影响。PP7显著抑制的可行性和诱导细胞死亡U87-MG U251细胞24小时后,与IC50值 和 ,分别。凋亡和自噬过程参与的细胞毒性效应PP7, PP7 Bcl2 /伯灵顿通路激活和抑制自噬部分获救PP7在神经胶质瘤细胞的毒性。此外,发现了一种蛋白激酶的抑制/ mTORC1活动PP7政府后,和似乎生产过剩的活性氧(ROS)负责这一效应。即清除ROS的NAC治疗减轻PP7-induced细胞死亡,自噬及其影响AKT / mTORC1信号。此外,一种组合试验的PP7 (TMZ),最常用的化疗对于神经胶质瘤患者,导致合作执行,而PP7 TMZ减少阻力通过抑制管理表达式。因此,我们的研究报告PP7作为神经胶质瘤治疗的潜在代理并揭示其潜在的作用机制。

1。介绍

神经胶质瘤是最常见的原发性肿瘤在大脑中,占30%的大脑和中枢神经系统肿瘤和恶性脑瘤(80%的1]。神经胶质瘤的复发和死亡率相当高,导致预后不良。尽管在神经外科的进展和广播,化疗,神经胶质瘤患者的死亡率仍然很高,最近的报告显示(2,3]。神经胶质瘤患者的中位生存时间是12 - 15个月,高档的神经胶质瘤患者生存1年多低于30%,诊断后5年生存率是5%4,5]。烷化剂的temozolomide (TMZ)是最常用的治疗神经胶质瘤手术切除,放疗后4]。TMZ O甲基化DNA⁶鸟嘌呤的地位,这可能会导致不匹配而导致的鸟嘌呤和胸腺嘧啶,而非胞核嘧啶配对hypermutation和基因组不稳定性,最终导致细胞死亡6]。然而,TMZ被广泛报道的副作用,如白细胞计数低、发热、牙龈肿胀,呼吸困难,和许多其他电子药物纲要(英国)7,8]。之前的数据显示,TMZ-induced hypermutation与耐药有关(9]。因此,越来越多的工作需要完成勘探和开发更有效的代理神经胶质瘤的治疗,或与TMZ定义新的联合治疗,减少其副作用(10]。

Polyphyllins一类皂甙是从中国传统的粉末herb-Paris重楼var.将云南(所谓的根茎paridis) (11]。各种polyphyllins发现了以前的研究,包括polyphyllin我(PPI) polyphyllin II (PPII) polyphyllin C (PPC) polyphyllin D(产后抑郁症),polyphyllin VI (PP6)和polyphyllin七世(PP7),和一个广泛的这些皂甙的药理作用也报道,如抗炎、immunity-enhancing,尤其是抗肿瘤活性(12,13]。已经证明,PPI抑制肿瘤细胞的增殖率,如非小细胞肺癌细胞、肝癌细胞,卵巢癌细胞,骨肉瘤细胞(14- - - - - -17]。产后抑郁症在体外抑制乳腺癌细胞的生长和减少异种移植由这些细胞的体积(18]。PPI和产后抑郁症都能增加神经胶质瘤细胞的细胞凋亡(19,20.]。polyphyllins的抗肿瘤特性的机制是不同的,和以前的研究已经表明,活性氧产量的增加,自噬,激活细胞死亡过程和干扰了细胞周期分布导致行动的polyphyllin机制可能在一个相关的方式15,21]。

Polyphyllin七世(PP7)是一个活跃的pennogenyl皂素与大分子量比其他polyphyllins识别。研究人员最近在癌症治疗,关注其生物活性和有效的抗癌特性,PP7被发现在肝、肺癌、乳腺癌、结直肠癌细胞(21- - - - - -24]。然而,PP7的抗癌活性和其潜在的机制与神经胶质瘤仍然是未知的,而且没有很好的定义。在这项工作中,我们的目标是调查PP7神经胶质瘤细胞的敏感性在体外,评估其结合TMZ的可能性,并进一步揭示这些过程背后的分子机制。我们的研究旨在为PP7应用程序显示一个新的视角在神经胶质瘤的治疗,这可能为神经胶质瘤患者是有益的。

2。材料和方法

2.1。试剂

PP7从成都必须购买生物技术有限公司有限公司(中国)成都,PPI的纯度≥98%。N-acetyl-L-cysteine (NAC)从Sigma-Aldrich购买(默克公司,达姆施塔特,德国)。胰岛素样生长因子1 (igf - 1)和表皮生长因子(EGF)从PeproTech购买(美国落基山)。3-methyladenine (3-MA S2767)和bafilomycin A1 (Baf-A1 S1413)来自Selleck化学品(美国休斯顿,德克萨斯州)。TMZ是由助教制药有限公司(天津)。细胞计数Kit-8 (CCK-8)从Dojindo购买分子技术(熊本、日本)。Hoechst33342 /π装备,细胞线粒体隔离设备,dihydroethidium由Beyotime生物技术研究所(海门,中国)。

2.2。细胞培养

神经胶质瘤细胞株U87-MG和U251来自上海生物科学研究所,中国科学院(中国上海)。U87-MG U251细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;HyClone,通用电气医疗集团生命科学,洛根,UT,与10%胎牛血清(美国)补充的边后卫;Gibco;热费希尔科学公司,penicillin-streptomycin沃尔瑟姆,美国马)和1%(表达载体;热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,美国马)。细胞被维持在37°C在湿润的气氛中(5%股份有限公司₂)。

2.3。细胞生存能力分析

细胞生存能力是由CCK-8化验报告之前(1]。细胞被播种密度 细胞/ 96 -孔板和孵化,在37°C,在完全培养基(与10%的边后卫DMEM)系列稀释的PP7 24 h。CCK-8被添加到每个的96孔板(CCK-8,加上新鲜培养基的固定比率1:10,100μ信用证),其次是进一步孵化1 h。吸光度测量在450 nm使用标(热费希尔科学,Inc .)。half-maximal抑制浓度(IC50),定义为细胞生长受到抑制的药物剂量50%,测量使用GraphPad棱镜软件5.0版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。使用的公式如下:

2.4。赫斯特33342 / Propidium碘(π)染色

赫斯特33342年和propidium碘(PI)双重染色根据制造商的说明进行。简而言之,U87-MG或神经胶质瘤U251细胞在12-well镀板的密度 细胞/好,对待PP7在37°C 24 h。这些细胞被洗了三次PBS和孵化Hoechst33342 / propidium碘(PI)解决方案(10μg / ml) 30分钟在4°C。最后,荧光显微镜用于观察U87-MG的π和Hoechst-positive信号或神经胶质瘤U251细胞在15个不重叠的领域,和细胞死亡速率的定量计算PI-positive细胞赫斯特33342 -阳性细胞。分析了对于每一个治疗组,≥1000个细胞,一式三份。

2.5。活性氧(ROS)检测

ROS分析工具从Beyotime购买使用生物技术研究所根据制造商的指示和以前的报告25]。Dihydroethidium准备为10毫米的解决方案。U251 U87-MG神经胶质瘤细胞治疗与PP7 37°C 24 h。然后,细胞孵育10μM dihydroethidium (Eth)在DMEM 37°C 30分钟。最后,荧光显微镜用于观察神经胶质瘤U251细胞的活性氧产量。Eth的荧光强度分析Image-Pro +软件,然后每个实验组的荧光强度值与对照组的荧光强度值相比,得到一个相对价值和量化GraphPad棱镜软件5.0版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。

2.6。免疫印迹分析

西方墨点法根据标准程序执行之前报道(1]。从培养细胞中提取的蛋白质被用在裂解缓冲(2% SDS蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)。每个提取的蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备(热科学皮尔斯)。等量的蛋白质提取被加载到每个车道SDS凝胶和分开的页面。蛋白质被转移到PVDF膜使用标准程序。膜被封锁与脱脂奶粉5% TBST (TBS 0.1%渐变20,pH值7.6)1小时在室温下(RT)和孵化隔夜尊重主要抗体在4°C。在RT 3洗TBST后10分钟每一洗,膜被孵化1小时1:10000稀释适当的二次抗体稀释TBST在沿膜清洗的另一个3 * TBST在每个洗RT 10分钟,然后发现蛋白质和ECL试剂(热科学皮尔斯),和膜暴露在电影(柯达)。的抗体实验包括伯灵顿(Abcam ab232479 1: 1000稀释),bcl - 2 (Abcam ab32124 1: 1000稀释),caspase-3 (Abcam ab197202 1: 1000稀释),裂解caspase-3 (Abcam ab32042 1: 300稀释),细胞色素C (Abcam ab133504 1: 1000稀释),prohibitin (Abcam ab75766 1: 2000稀释),一种蛋白激酶(细胞信号技术,9272年代,1:2000稀释),pAKT (S473)(细胞信号技术,4060年代,1:2000稀释),pAKT (T308)(细胞信号技术,2965年代,1:2000稀释),魔法石第六章(S240/244)(细胞信号技术,2215年代,1:2000稀释),p4EBP1 (T37/46)(细胞信号技术,9459,1:1000稀释),pS6K (T389)(细胞信号技术,9205,1:1000稀释),SQSTM1 / P62 (Abcam ab91526 1: 2000稀释),LC3B (Abcam ab192890 1: 500稀释),GAPDH(微孔MAB374 1: 2000稀释),β肌动蛋白(博士德BM0627 1: 1000稀释),山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L)二级抗体(皮尔斯,31460 1:10000稀释),和山羊anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)二级抗体(皮尔斯,31430 1:10000稀释)。我们使用ImageJ软件量化西方的屁股。首先,我们测量了灰度值通过使用ImageJ的印迹。其次,规范化的每个示例使用一个标准化者(蛋白质如GAPDH或管家β肌动蛋白,如上面所提到的),然后每个实验组的归一化值与对照组的归一化值相对价值。最后,我们使用GraphPad软件直方图。

2.7。细胞线粒体隔离

我们使用一个细胞线粒体隔离设备(Beyotime生物技术、C3601) U87-MG细胞和U251细胞的线粒体隔离。首先,我们用PBS洗细胞,细胞收获与trypsin-EDTA解决方案,离心机在100 - 200 g在室温下5 - 10分钟,收集细胞。其次,我们添加了1 - 2.5每20 - 50毫升线粒体分离试剂百万细胞,然后轻轻地暂停放在冰10 - 15分钟。第三,细胞悬液被调到一个合适大小的玻璃均质器,均质化细胞10 - 30倍。第四,均质化后,细胞悬液离心10分钟600 g在4°C。第五,上层是小心翼翼地转移到新管和离心10分钟11000 g在4°C。沉淀分离线粒体的细胞。接下来,上层清液小心地转移到新管和离心10分钟12000 g在4°C。上层清液是细胞质蛋白质移除线粒体。线粒体和细胞质蛋白质终于为世行检测细胞溶解。

2.8。GFP-LC3 Puncta成像

我们首先构建GFP-LC3向量。互补脱氧核糖核酸编码人类LC3B(基因ID: 81631)是通过从U251 cDNA PCR。引物序列如下:LC3B向前,5 - - - - - -TCG GCG ACCA TGC CGT CGG AGA AGAC-3和反向,5 - - - - - -GCG CGG 20 CTT ACA CTG ACA ATT TCAT-3 。正向引物包括Sal1限制性内切核酸酶限制站点和反向引物包括Not1限制性内切核酸酶限制站点。首先,使用U251 cDNA作为模板,通过添加Taq2x LC3B编码序列克隆混合酶和一对引物的PCR扩增体系。其次,PCR产品受到核酸电泳和LC3B cDNA纯化核酸凝胶。第三,LC3B cDNA和pEGFP-C1向量受到Sal1 / Not1双限制性内切酶消化,然后LC3B cDNA插入pEGFP-C1向量T4 DNA连接酶。第四,结扎前一步变成了的产品大肠杆菌主管细胞,然后提取质粒的克隆选择和获取GFP-LC3质粒。最后,质粒测序进行识别。

U251细胞和U87-MG细胞被播种密度 细胞/在12-well盘子和孵化在完全培养基(与10%的边后卫DMEM)一夜之间,然后用GFP-LC3转染质粒用Lipofectamine™2000(表达载体)。简单地说,对于每个12-well的板块,我们稀释2μg GFP-LC3质粒到50μl中没有血清管和稀释2μl (Lipofectamine™2000到50μl培养基无血清管B,在室温下培养5分钟。然后,我们添加了50μl B管一管,在室温下混合,和孵化20分钟允许DNA-Lipofectamine™2000复合物形成。这DNA-Lipofectamine™2000复杂(100μl)是直接添加到每个盘子包含细胞和混合。转染24小时后,相应的治疗进行了8 h。最后,荧光显微镜的观察GFP-LC3 puncta像之前描述的那样神经胶质瘤U251细胞(26]。每个细胞的数量GFP-LC3B puncta为10个不重叠的领域的评估和衡量Image-Pro +软件,然后我们计算平均LC3 puncta每个细胞在这10个不重叠的领域和图形由GraphPad棱镜软件。治疗3-MA U251, U87-MG细胞治疗PP7 (2μ米和4μM U251细胞,3μ米和6μM U87-MG细胞)8 h, 3-MA(5毫米)添加到添加PP7 U251和U87-MG细胞3小时后,然后puncta进行评估。CCK-8化验,U251 U87-MG细胞处理PP7 (4μM U251细胞,6μ米U87-MG细胞)单独或结合3-MA(5毫米)24 h。治疗bafilomycin A1, U251 U87-MG细胞治疗PP7 (4μM U251细胞,6μ米U87-MG细胞)单独或连同bafilomycin A1 (10 nM) 24 h。

2.9。实时聚合酶链反应

总RNA提取的U251细胞和U87-MG细胞使用试剂盒试剂(表达载体;热费希尔科学,Inc .),根据制造商的指示处理后表示PP7或TMZ的浓度。在每一组,2μg是反向转录成RNA cDNA使用恢复援助合成第一链cDNA工具包(热费希尔科学,Inc .)所描述的rt - pcr(前1]。1微升cDNA添加总量的20倍μl。PCR扩增系统使用执行qPCR SYBR预混料交货Taq™II工具包(豆类生物技术有限公司,大连,中国)。相对折叠水平测定使用GAPDH基因作为标准化者控制。qPCR结果分析了Bio-Rad大型经理3.0软件CFX,每个实验组的归一化值与对照组的归一化值相对价值。阈值周期(Ct)值应该在范围内 每个引用基因在所有样本,以确保类似cDNA收益率从每个RT反应。引物序列如下:管理mRNA, 5 - - - - - -ACC GTT TGC广汽TTG GTA CTT-3和反向,5 - - - - - -GGA GCT TTA TTT GACC-3甘氨胆酸资本利得税 。GAPDH mRNA, 5 - - - - - -太极拳CTC GGA GCG AGA CAA AAT 3和反向,5 - - - - - -GGC TGT TGT猫行动TCT猫GG 3 。

2.10。统计分析

统计评估使用SPSS 19.0进行(IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)为Windows包软件。数据来自西方的屁股,LC3色斑量化了的 ,而其他人了 。差异由单向方差分析多个组比较,两组比较,差异的学生 - - - - - -测试。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。PP7减少U87-MG和U251细胞的可行性

评估PP7的细胞毒性效应,两个人类神经胶质瘤细胞系(U87-MG和U251)暴露在PP7在不同浓度为12日,24日,CCK-8试验前和36 h。如数据所示1(一)和1 (b)、细胞生存能力U87-MG和U251细胞被PP7压制,而最明显的剂量依赖性效应是实现24小时后IC50值 和 ,分别。根据这些IC50值,浓度的3μ米和6μM PP7 U87-MG细胞,以及2μ米和4μM PP7 U251细胞,选择最下面的实验。U87-MG和U251细胞的细胞生存能力下降PP7治疗后细胞死亡引起感应根据实验由Hoechst33342 / propidium碘(π)双重染色(数字1 (c)- - - - - -1 (e))。歧视的细胞死亡类型,我们分析了bcl - 2家族蛋白的表达以及裂解半胱天冬酶3,发现PP7 bcl - 2蛋白水平的降低,伴随着增加伯灵顿和裂解caspase-3 U87-MG和U251细胞(数字1 (f)- - - - - -1 (k))。此外,伯灵顿和细胞色素C的sublocalizations线粒体和细胞质之间的比较,显示出显著富集的伯灵顿在线粒体细胞色素C在细胞质分数(数据更丰富1(左)- - - - - -1 (o))。这些结果表明,PP7神经胶质瘤细胞的生存能力下降是介导的诱导细胞凋亡。

3.2。PP7促进活性氧(ROS)生产U87-MG和U251细胞

潜在的抗癌化合物能促进肿瘤细胞的活性氧的生产有很好的前景进一步临床调查。在我们的研究中,我们发现显著增加活性氧积累U87-MG U251细胞PP7治疗后,由荧光测量dihydroethidium (Eth)标签(数字2(一个)离开了,2 (b),2 (c))。研究PP7引起的活性氧产量和细胞毒性效应之间的关系,我们进一步执行ROS间隙(NAC)常见的抗氧化剂防治作用。如乙所示标签,活性氧积累NAC治疗后下降(数字2(一个)对的,2 (b),2 (c))。此外,显著增加细胞活力检测到CCK-8化验U87-MG和U251细胞暴露于南汽/ PP7联合治疗(数字2 (d)和2 (e))。这些结果表明,生产过剩的活性氧参与PP7神经胶质瘤细胞的细胞毒性。

3.3。ROS产生PP7治疗诱发自噬U87-MG和U251细胞

调查是否活性氧的生产过剩PP7-treated神经胶质瘤细胞诱导细胞自噬,自噬markers-LC3和SQSTM1广泛使用的蛋白质含量(p62)都进行了分析。在我们的研究中,SQSTM1 (p62)蛋白质含量显著降低,同时增加LC3 II / LC3我比观察U251和U87-MG细胞在一系列PP7增加浓度和在不同的时间点(数据3(一)-3(左))。为了进一步证实了这一发现,GFP-LC3质粒转染到U251 U87-MG细胞。我们观察到大量的荧光puncta U87-MG和U251细胞的细胞质中形成PP7治疗后,显示LC3接合的存在,被认为是一个标志性事件在自噬过程(数据3(m)左右3(n)。这些结果表明,PP7的确诱发自噬在神经胶质瘤细胞。调查ROS在PP7-induced自噬的作用,我们进一步执行ROS清除实验与南汽的管理。我们发现的形成GFP-LC3 puncta引起PP7 NAC治疗很容易压制,这表明PP7-stimulated ROS生产过剩与随后的自噬过程(数据3(m),3(n),3(o)和3(p))。

3.4。在神经胶质瘤细胞自噬对PP7细胞毒性效应

评价自噬是否还涉及PP7-suppressed神经胶质瘤细胞生存能力,3-methyladenine (3-MA)应用作为一个自噬抑制剂。我们发现PP7-induced自噬可以通过3-MA U87-MG和抑制U251细胞,如图所示,增加SQSTM1 (p62) LC3II蛋白水平下降,减少LC3 II / LC3我比(数字4(一)- - - - - -4 (f))。此外,大大减少LC3 puncta观察神经胶质瘤细胞系暴露于PP7和3-MA联合治疗(数字4 (g)- - - - - -4(我))。最重要的是,细胞毒性引起PP7部分获救U87-MG 3-MA治疗和U251细胞(数字4 (j)和4 (k))。加强我们的观察,我们进一步进行实验与另一个广泛使用的自噬inhibitor-bafilomycin A1 (Baf-A1) U87-MG和U251细胞。结果表明,PP7细胞毒性效应也由bafilomycin A1治疗(数字部分获救4(左)和4(米))。因此,自噬细胞死亡和细胞凋亡,参与antiglioma PP7的效果。

3.5。PP7抑制U251 mTORC1 / AKT信号通路和U87-MG细胞

考虑一种蛋白激酶,促进凋亡和protumorigenic活动,我们调查的影响PP7 AKT激活。U251细胞的治疗与PP7导致显著的一种蛋白激酶磷酸化水平降低,而AKT的总水平保持不变,建议PP7抑制AKT通路的活性数据5(一个)和5 (b))。此外,我们表明,抑制一种蛋白激酶磷酸化可以获救生长因子(igf - 1和EGF)(数据5 (c)和5 (d))。一种蛋白激酶信号参与mTORC1活动的监管;因此,PP7 mTORC1活动进一步的影响进行了分析。PP7治疗后我们发现抑制AKT活动引起的抑制mTORC1复杂的活动,在图中以减少磷酸化水平的mTORC1效应器,4 e - bp1 pS6K, S6(数字5 (e)和5 (f))。此外,我们进一步评估的影响PP7 AKT / mTORC1 U87-MG细胞信号,发现同样的模式在U251细胞(数字5 (g)和5 (h))。为了调查是否抑制反应一种蛋白激酶/ mTORC1信号也依赖ROS,南汽在结合PP7管理,导致恢复磷酸化水平的mTORC1效应器和AKT(数字5(我)和5 (j))。因此,我们的工作表明,AKT / mTORC1信号通路参与PP7 antiglioma效果。

3.6。协同PP7和TMZ组合在U251细胞毒性效应和U87-MG细胞

Temozolomide (TMZ)是主要的神经胶质瘤化疗用于治疗严重的副作用。因此,代理可以安全的功效TMZ当应用于组合,减少其副作用减少了有效剂量将为神经胶质瘤的治疗是有价值的。为了评估潜在的PP7神经胶质瘤治疗结合TMZ, PP7无效的浓度低(0.2μM和0.4μ0.4 M U251,μM和0.8μM U87-MG)是结合不同浓度梯度的TMZ,显示没有统计上显著的U251细胞毒性和U87-MG细胞(数字6(一),6 (b),6 (e),6 (f))。合并后的治疗持续了24小时。我们发现PP7和TMZ显著增加U251细胞毒性和U87-MG细胞,特别是0.4μM PP7应用结合TMZ U251细胞(数字6 (c)和6 (d))和0.8μ米U87-MG细胞(数字6 (g)和6 (h))。此外,赫斯特33342 / PI染色证实了协同PP7和TMZ的神经胶质瘤细胞死亡感应(0.4μPP7与90μ对U251和0.8米μPP7与150μM U87-MG)(数据6(我)- - - - - -6(左))。这些数据表明,即使是低浓度的PP7 TMZ可以增加细胞毒性,这对于PP7提供了广阔的应用前景。

3.7。PP7减少TMZ抗性在U251 U87-MG细胞,抑制管理的表达

除了副作用,TMZ阻力造成的异常表达管理也是一个重要因素影响神经胶质瘤的治疗。在我们的研究中,我们发现管理表达的诱导U251 TMZ治疗后和U87-MG细胞,可以抑制这感应与TMZ PP7(数据的综合治疗7(一)- - - - - -7 (d))。AKT通路被证明是参与管理的转录调控,我们进一步研究了PP7在一种蛋白激酶磷酸化的影响是增加了TMZ治疗U251 U87-MG细胞(数字7 (e)- - - - - -7 (h))。这些结果表明耐药性将抑制如果PP7结合TMZ应用。

4所示。讨论

PP7据报道在一些癌症类型中表现出很强的抗癌活性。张等人报道,PP7诱导HepG2细胞死亡通过抑制mTOR / PI3K / AKT通路(22),而林等人发现了一个感应的G2 / M细胞周期阻滞和细胞凋亡PP7-treated肺癌细胞(21]。在神经胶质瘤细胞,polyphyllin D(产后抑郁症)据报道通过物U87细胞诱导凋亡通路(20.],PP1报道诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在U251细胞也通过物途径(19]。然而,PP7在神经胶质瘤细胞的抗癌活性及其机制尚未定义。在这个工作中,我们显示PP7-induced ROS生产镇压活动的一种蛋白激酶信号诱导U251细胞死亡和U87-MG细胞。细胞凋亡是一个主要的细胞死亡相关的通路,和bcl - 2家族负责释放proapoptotic因素,如细胞色素C、触发mitochondria-related和caspase-3依赖的细胞凋亡27]。凋亡bcl - 2蛋白(例如,bcl - 2和BCL-xL)函数直接绑定和抑制proapoptotic bcl - 2蛋白(例如,巴克斯)28]。自噬是一个监管的溶酶体通路长寿的关键蛋白质和细胞器降解和回收29日]。自噬在癌症的角色是复杂的,和有争议的研究报告发表30.,31日]。然而,大量的工作支持自噬的抗癌特性,当自噬基因Beclin-1被证明是一个肿瘤抑制,而肿瘤抑制基因p53和PTEN证明诱导自噬(32- - - - - -34]。在我们的研究中,我们发现伯灵顿水平增加,细胞色素C的释放,诱导自噬在PP7-treated神经胶质瘤细胞,这表明PP7-induced神经胶质瘤细胞死亡可能是由于增加细胞凋亡和自噬细胞死亡。同时,U251细胞更敏感比U87-MG PP7细胞,这可能是由于它们之间不同的关键基因的表达。例如,U87-MG WT p53表达,而U251包含突变型p53,以及谷胱甘肽的表达S-transferaseω₁,谷胱甘肽S-transferase超家族中的一员,参与肿瘤细胞的耐药性,更高U87-MG细胞比U251细胞(35,36]。

生理、ROS是正常的代谢产生的副产品或酶的过程(1]。令人信服的证据表明,ROS作为重要的监管机构不仅在正常细胞,而且在许多肿瘤细胞为多个细胞信号通路(1]。为了保持增殖代谢率高,肿瘤细胞维持ROS比正常多了。尽管众多生理ROS已报告的角色,尤其是在信号分子参与细胞生长、分化、肿瘤恶化。癌症细胞的氧化还原平衡是至关重要的,和过多的活性氧积累是灾难性的癌症细胞(37]。此外,活性氧的抗肿瘤特性近年来引起了利益。研究人员报道,ROS被卷入选择性杀死肿瘤细胞(38),但清楚地了解这些过程的机制仍然是难以捉摸的。mTOR / AKT通路起着至关重要的作用在调节细胞增殖、细胞周期、生存和代谢(39]。ROS AKT / mTOR的影响被广泛研究,产生冲突的结果。一些研究报道的放大AKT / mTOR活动通过ROS PTEN的失活(40- - - - - -42),而其他人发现ROS能够调节AKT本身具有抑制作用,特别是在高剂量(43- - - - - -46]。在我们的研究中,我们发现了一种蛋白激酶的磷酸化和mTORC1下游效应器被PP7政府大幅下调,这反应可以逆转NAC治疗。这些结果与最近的出版物关于负氧化还原调控的一种蛋白激酶/ mTORC1和提供证据表明通过ROS-dependent PP7 mTORC1 / AKT介导的抑制机制(43- - - - - -46]。

自噬与肿瘤发生之间的关系。自噬可以为肿瘤细胞提供额外的能量或营养物质在某些特定时期,它也作为一个细胞死亡和肿瘤抑制机制(47]。虽然生理水平的自噬是细胞内稳态的关键维护在不同压力条件下,过度或不受控制的水平,能够诱导自噬细胞死亡(30.]。此外,随着不同分类的细胞死亡,细胞凋亡和自噬细胞死亡显示彼此之间复杂的相互关系。在一些情况下,协同效应的细胞凋亡和自噬可以发现,而在其他情况下,自噬可以只有当触发凋亡抑制,表明不同类型的细胞死亡可能会与此同时应对不同压力条件下(47,48]。同时,活性氧积累之间的关系和自噬被广泛研究近年来,和相信ROS的重要诱导自噬(29日]。在我们的研究中,我们发现PP7可以诱导细胞凋亡和自噬在神经胶质瘤细胞,这是依赖ROS的生成。除了协调能源和生长信号,mTORC1已经证明调节细胞自噬(49]。最少、抑制mTORC1活动导致自噬的诱导胶质瘤细胞,证明了LC3的积累和减少p62 PP7-treated细胞水平。此外,LC3积累进一步证明检测自噬puncta GFP-LC3转染神经胶质瘤细胞PP7对待。我们的研究还发现,细胞死亡在PP7-treated神经胶质瘤细胞,可以得到部分获救3-MA Baf-A1,自噬抑制剂(50,51),从而提供明确的证据PP7-induced自噬作用的神经胶质瘤细胞死亡。

手术切除、放疗和TMZ化疗是标准治疗神经胶质瘤患者,但是说真的,副作用(52)和抗TMZ由于管理导致的表达限制这种治疗的效果。O⁶methylguanine-DNA甲基转移酶(管理)是一种酶,这种酶能够把methyl-adduct从O⁶鸟嘌呤半胱氨酸残基,有效修复DNA的改变在肿瘤细胞复制之前,53]。因此,管理的存在被认为是肿瘤细胞的耐药性的主要原因烷基化剂。李等人曾表明,TMZ可以诱导管理在神经胶质瘤细胞的转录54]。一些管理抑制剂,如PaTrin-2, O⁶-benzylguanine和链脲霉素,分析了与TMZ联合治疗,导致更少的活动管理,但有严重药物毒性反应或系统(54- - - - - -56]。因此,迫切需要开发代理结合TMZ可以抑制的活动管理和减少TMZ阻力。在目前的研究中,PP7被证明是有效的在一个与TMZ联合治疗,通过抑制管理仅靠TMZ治疗诱导的表达,这种效应也可能通过一种蛋白激酶信号的调制,AKT通路被证明是参与转录调控管理(54,57]。我们的数据表明,结合PP7 TMZ可以被认为是一个有效的治疗神经胶质瘤,但是仍然需要进一步的工作来证明PP7 antiglioma效应在活的有机体内。

总之,我们提供首次证明PP7能够诱导细胞死亡在神经胶质瘤细胞,通过细胞凋亡和自噬的诱导细胞死亡通过ROS-induced AKT / mTORC1活动抑制(图8(左)。此外,联合治疗与TMZ PP7导致更有效的细胞毒性和减少管理表达式,可以预见作为一个策略来减弱神经胶质瘤细胞的修复能力TMZ-induced DNA甲基化,因此减少TMZ的阻力(图8,对吧)。因此,我们的结果显示一个新颖的基于PP7治疗神经胶质瘤的治疗策略。然而,仍存在局限性。首先,目前尚不清楚如何PP7刺激在神经胶质瘤细胞ROS的生成。然后,需要提供进一步证据理解结合使用PP7和TMZ是否有效的在其他神经胶质瘤细胞系。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

李Dejiang彭日成,曹国伟,澄澄阳同样这项工作做出了贡献。

确认

这项研究是由国家重点支持技术支持计划(2014 bai03b01 Z.C)和部分由中国国家自然科学基金(31501200刘昀)和从四川省教育部重点研究项目,中国(16 za0029刘昀)。