细胞毒性的影响Artemisia Annua.L.和纯青蒿素在D-17甘氨酸骨肉瘤细胞系上

摘要

Artemisia Annua.在传统中医中已经使用了几个世纪。尽管用作抗疟药物，其活性化合物青蒿素和半合成衍生物的抗癌特性也被研究，有有趣和有前景的结果。这项研究的目的是评价(1)从青蒿素中提取的纯青蒿素和水乙醇提取物的细胞毒性和抗增殖作用A. Annua.在D-17甘氨酸骨肉瘤细胞系和（ii）与细胞毒性效应的细胞内铁浓度及其相关性。青蒿素和水醇提取物均以剂量依赖性方式诱导细胞毒性作用。纯青蒿素导致S相中的细胞增加，而水醇提取物诱导显明增加G₂/ m阶段。与未处理的细胞相比，用纯青蒿素和水醇提取物处理的D-17细胞中测量铁浓度的显着降低。总之，尽管初步，本研究中获得的数据表明水醇提取物的含量比纯青蒿素更有效的细胞毒性，表明植物霉素的可能协同作用和涉及铁的作用机制和可能的糖蛋白。考虑到人和犬骨肉瘤之间的相似性，深化知识和改善治疗方案的进展可能与互惠翻译药物的模型中的两种物种都相关。

1.介绍

自古以来，Artemisia Annua.L.已被用作治疗中药中几种疾病的药用植物[1］．迄今为止，声誉A. Annua.与抗疟疾活性有关。2015年，屠呦呦因从青蒿素中分离出活性分子而获得诺贝尔奖A. Annua.．目前，青蒿素，其衍生物和青蒿素组合治疗（ACT）属于全球疟疾的既定标准治疗方法[2］．超过600种植物化学物质已被鉴定为A. Annua.，但其植物化学以辛咪萜类化合物，黄酮类化合物和香豆素与酶（如β牛乳糖和β-葡萄糖苷酶)和类固醇(例如，β-谷甾醇和豆甾醇)[1］．然而，A. Annua.与其他200种的不同之处艾蒿属只含有青蒿素，即存在于干叶子中的活性化合物(世卫组织专论)[3.］．青蒿素是一种倍半萜三氧烷内酯，它含有对其生物活性至关重要的过氧化物内桥。从该植物中提取的青蒿素含量低，水溶性和脂溶性低，生物利用度有限，严重限制了该药物的标准化和商业化。在过去的30年里，人们用不同的策略开发了几种半合成青蒿素衍生物，包括基因工程[1那4.那5.］．虽然已经开发为抗疟药，但也已经针对许多其他治疗性能进行了抗疟疾及其半合成衍生物，例如抗病毒，抗菌剂和抗炎活动[6.］．然而，自20世纪90年代后期以来，孕术的抗癌特性是众所周知的，并且已经迅速增加在体外和体内青蒿素抗肿瘤特性的研究、病例报告和临床试验[7.］．内过氧化物部分对青蒿素类药物的生物活性具有战略意义。它的分裂导致活性氧(ROS)的形成和诱导氧化应激。此外，在亚铁或还原亚铁血红素存在时，青蒿素可以转化为细胞毒性碳中心自由基，这是一种高效的烷基化剂，诱导对癌细胞的直接氧化损伤[2那7.］．实际上，据报道，阿尔胺蛋白诱导细胞凋亡和脱裂病变，通过细胞周期停止降低细胞增殖，并抑制血管生成和肿瘤的组织侵袭，以及癌症转移[2那6.那7.］．

在狗的自发性骨肉瘤（OSA）具有临床介绍，生物行为，治疗的反应，以及类似人类OSA的疾病进展[8.-10］．OSA是狗和人类中最常见的骨骼的主要恶性肿瘤。在狗的血症中显着更普遍，狗的发病率比人民高27倍。OSA常常发生在旧狗（中位年龄7岁），而在人类中更常见于青春期（10至14岁的年龄组）[8.那11］．儿童和狗的OSA发病部位惊人地相似，都倾向于长骨的承重部位。大约75%的犬OSA发生在阑尾骨骼，最常见的部位在桡骨远端和肱骨近端。在人类OSA中，长骨受影响的病例高达90%，股骨远端、胫骨近端和肱骨近端是最常见的位置[9.那11］．此外，在两种物种中发现了参与OSA的细胞生成的特异性基因的突变，包括肿瘤抑制基因P53，RB1和PTEN中的突变和癌基因MYC的改变并达到[8.］．然而，治疗失败在狗和人类中经常发生，主要是由于多种抗性和转移扩散的发展，使得开发新的疗法必不可少。

因此，为支持其抗癌活性提供新的科学依据A. Annua.本研究的第一个目的是评估纯青蒿素和水乙醇提取物的细胞毒性和对细胞周期的影响A. Annua.在犬骨肉瘤细胞系(D-17)上。考虑到铁对青蒿素活性的重要作用，第二个目标是确定细胞内铁浓度及其与观察效果的可能相关性。

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

所有试剂均来自Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)，如果没有特别说明，均为超纯级，包括98%纯度的青蒿素(CAS号:63968-64-9)。最低必需培养基(MEM)、热灭活胎牛血清(FBS)和Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)购自Gibco-Life Technologies (Carlsbad CA, USA)。从…中提取的一种商业性的水醇提取物A. Annua.并由65％乙醇组成，使用20％的空中零件和水。该提取物含有生产者所宣称的2mg阿尔美辛蛋白/ ml（对应于7mm）。所有塑料支架都是从Falcon，Becton-Dickinson（Franklin Lakes，NJ，USA）购买的。

2.2。细胞培养和治疗

犬骨肉瘤细胞系（D-17）购自“istituto Zooprofilattico Sperimentale Della Lombardia e Dell'emilia Romagna-Sez。布雷西亚。“在5％CO中，在用2mM L-谷氨酰胺和FBS（5％）中加入的最低必需培养基（MEM）中培养细胞₂37°C的气氛。在T-75组织培养瓶中总是进行解冻后的第一次播种（ 细胞/烧瓶），随后的实验在T-25烧瓶（细胞循环分析和铁定量）和96孔测定板（细胞毒性）中进行。氨羟锡溶解在DMSO中，得到50mM的储备溶液，然后在培养基中稀释以获得所需浓度。水醇提取物A. Annua.在培养基中直接稀释以获得所需浓度。对于每个处理，使用相同浓度的特定载体作为对照，对青蒿素使用DMSO，对水醇提取物使用65%乙醇溶液。在没有治疗的培养基中生长在培养基（MEM + 5％FBS）中的细胞被认为是“未处理的细胞”。

2.3。细胞毒性

将细胞/孔接种在96孔板中，并暴露24小时，以增加纯青蒿素的浓度（50,100,250,500,750,1000和2000μ.m）或增加剂量A. Annua.对应于阿尔美霉素浓度为14,35,70,140,​​280,420和700的水醇提取物μ.M，根据在水乙醇提取物中所宣布的2 mg青蒿素/ml的浓度。对于每个处理，使用相同浓度的特定载体作为对照，对青蒿素使用DMSO，对水醇提取物使用65%乙醇溶液。用四唑盐(体外毒理学测定试剂盒，基于MTT的）。使用Infinite®F50/机器人吸收微孔板读卡器，TECAN（寿命科学），在570nm的波长下测量甲藻吸光度。还测量了690nm处的多壁板的背景吸光度，并从570nm测量中减去。50％抑制细胞活力所需的氨化蛋白浓度（IC_50.）通过Prism GraphPad软件和IC计算_50.值用于后续实验。

２.４.细胞周期分析

为了分析流式细胞术中细胞周期，24小时后处理，等分试样 每种治疗的细胞一式两份，并且用于用作控制的特定车辆（IC_50.标准的artemisinin，IC_50.A. Annua.用相同浓度的DMSO提取青蒿素，用65%的乙醇溶液提取氢醇提取物)从生长培养基中洗涤，240 x g离心10分钟。然后，所产生的颗粒被重悬在1毫升的溶液中，该溶液含有0.1%的柠檬酸钠，0.1%的Nonidet, 10μ.g / ml rnase和50 μ.G / ml碘化丙啶（最终浓度 细胞/ ml）。在黑暗中在37℃下30分钟后，通过使用配备有XE / HG灯的BRYTE HS流式细胞仪（BIO-RAD）分析分离的核，并在488nm处获得激发。在600nm的线性刻度上收集PI荧光，通过Modfit软件（Varity，USA）分析DNA分布。对于显微镜评估，将细胞（7000个细胞/孔）接种在八个井室幻灯片上（BD Falcon，Franklin Lakes，NJ）。治疗24小时后，用Hoechst 33342 15染色细胞μ.在5％CO中获得30分钟的G / ml₂培养箱在37°C。在DPBS中3次洗涤后，使用配备有尼康数码相机的Eclipse E600 ePiforeary显微镜和用于图像捕获的ACT-2U软件（尼康，东京，日本）进行分析细胞。通过计算至少400个核来分析图像以评估凋亡者的百分比。

2.5。铁量化

用于铁的测定，使用配备GTA-96石墨管雾化器和样品分配器的AA-20光谱原子吸收光谱仪(瓦里安)。分析方法优化如下:Tüzen [12]有微小的变化。使用的石墨管被涂覆的GTA管（Agilent Technologies，德国），中空阴极灯电流为7mA，并且使用0.2nm的光谱狭缝宽度在248.3nm共振线下进行测量。在分光光度计读数期间，分隔石墨管中的内部氩流量保持在300ml / min，并在雾化阶段中断。斜坡和保持时间用于干燥，热解，雾化和清洁温度被优化，以获得最大吸光度，而无明显的背景吸收;因此，没有必要的背景校正。

通过将1mg / mL标准储备溶液用毫Q水稀释1mg / ml标准储备溶液来获得校准曲线，以获得含有0,20,40和60ng / ml铁的工作标准，并通过绘图抵抗铁浓度为248.3nm的吸光度。曲线的等式是 那计算得到的回归系数( ）是0.993。该方法经标准参考物质(英国普尔BDH Chemicals)验证，以定量化值的百分比计算，方法的准确度为105%。

细胞内铁的定量，细胞生长在T-75烧瓶( 直到融合细胞)。然后用IC处理细胞_50.标准的artemisinin和IC_50.A. Annua.水醇提取物，24小时。对于每个处理，使用相同浓度的特定载体作为对照，对青蒿素使用DMSO，对水醇提取物使用65%乙醇溶液。之后，等分试样 收获每种处理的细胞，计数，并以800×g离心10分钟。用DPBS洗涤颗粒两次，然后重新悬浮在1M HNO的溶液中_3.以最终集中的 细胞/ ml，在室温下消化直至完全溶解，最后用于Sargenti等人报告的铁定量。[13］．检测限(LOD)为0.8 ng/ml，定义为6个空白的3倍标准偏差对应的浓度。铁的浓度被报道为ng 细胞。

2.6。统计分析

通过单向分析的差异（ANOVA）进行分析MTT和IROT的数据，然后进行后HOC.Dunnett的多重比较测试。通过双向分析（ANOVA）分析细胞周期的数据，然后进行Bonferroni多重比较。至少的差异 被认为是显着的。使用棱镜GraphPad软件进行统计分析。

结果

3.1。效果Artemisia Annua.对细胞活力的水醇提取物和氨化蛋白

青蒿素的影响和A. Annua.MTT法测定水醇提取物对D-17细胞的作用。在所有浓度下，青蒿素和水乙醇提取物均可诱导细胞活力下降，并以剂量依赖的方式发挥细胞毒作用(图)1（a）和1（b）)．24小时后，两种产品都激发了圆形形状和细胞质成分的凝聚量增加的分离细胞，在水醇提取物存在下更明显（图1（d）和1（e）)．从MTT分析获得的数据被详细地用于评估50%抑制细胞活力(IC)所需的青蒿素浓度_50.）：值对应于548μ.M标准和65 μ.用于水醇提取物（图1（a）和1（b）)．

３．２．效果Artemisia Annua.在细胞周期上的水醇提取物和青蒿素

的效果A. Annua.通过流式细胞术评估D-17细胞周期上的水醇提取物和氨化蛋白，并用MODFIT软件分析数据。未经处理的细胞呈现了二倍体细胞群的典型细胞图（图2（a）A和2 (d))．如图所示2（a）C和E2 (d)，在纯青蒿素和水醇提取物的存在下确定D-17细胞周期的显着变化。显着减少（ ）g中的细胞_0./ G₁两种治疗后观察相。纯青蒿素的含量显著增加( ）在S期细胞，而水醇提取物诱导显着（ ）G细胞的增加₂/ m阶段。DNA分布的模式仅在用水醇提取物处理的样品中显示出亚g1种群的显着增加。非常可变措施的DNA片段表明存在碎片，典型的坏死性死亡而不是紧密的亚g1暗示凋亡。这些结果也得到了与重要核污染Hoechst 33342染色的细胞的微观检查，其中检测到几乎没有碎片核，凋亡的不同形态标记（图2（a）e和2（c）)．车辆，DMSO和乙醇65％，没有显着影响细胞周期（图2（a）B和D和2 (d))．

3.3。效果Artemisia Annua.细胞内铁的水醇提取物和氨化蛋白

图中报道了D-17细胞中的铁浓度3.．未处理的D-17细胞内平均铁浓度为 细胞。暴露于纯青蒿素的细胞和A. Annua.与未处理的细胞相比，水醇提取物的细胞内铁浓度显著降低( ）（图3(一个)和3 (b))．用萃取液处理的细胞浓度低于用纯青蒿素处理的浓度较低;这种差异没有统计学意义。暴露于相同浓度的细胞的细胞细胞的细胞内的铁细胞浓度，用于蒿蛋白的DMSO和65％乙醇用于水醇提取物的溶液，与未处理细胞的溶液没有统计学不同。

4.讨论

骨肉瘤(OSA)是人类和狗中最常见的原发性骨肿瘤，其特征是局部侵袭性和高度转移性行为[8.那9.］．新药的发展是改善治疗结果的必要药物，特别是在多种抗性和转移性OSA存在下。因此，本研究的第一个目的是研究阿尔胺蛋白的细胞毒性作用与从中获得的水醇提取物相比A. Annua.，在犬骨肉瘤细胞系(D-17)上。我们的结果表明，青蒿素和水乙醇提取物的细胞毒性作用均呈剂量依赖性。特别是,集成电路_50.而青蒿素则为548μ.m用于水醇提取物，该值显着降低（65 μ.m）。对于青蒿素，所得值在人肿瘤细胞系中报道的那些值中;事实上，experth等人。[14]报告了广泛的IC_50.纯青蒿素对一组不同的人类细胞系的价值，从57.1μ.M代表白血病细胞到1602μ.m hela细胞。2014年，Jirangkul等人。[15)报道,集成电路_50.两种人骨肉瘤细胞系，MG63和148B的纯青蒿素的值，用IC_50.167 μ.米和178μ.M,分别。据我们所知，只有二氢青蒿素(DHA)的细胞毒性评估犬OSA细胞系。特别是细谷等人[16]研究了DHA对犬OSA四种细胞系D-17、OSCA2、OSCA16和OSCA50的细胞毒性作用，报告了IC_50.分别为8.7、43.6、16.8和14.8μ.M,分别。

按照experth等。[14]在Hela细胞中报道A. Annua.提取物比纯青蒿素更细胞毒素，我们的结果表明了IC_50.对于植物提取比纯青蒿素低一种数量级。同样的作者测试了十四个不同的提取物A. Annua.不同地理来源的制剂。他们用二氯甲烷或甲醇提取植物，并评估提取物对HeLa细胞的活性，获得IC_50.取值范围为54.1 ~ 275.5μ.对二氯甲烷提取物的G / mL，276.3至1540.8 μ.G /ml甲醇提取物。通过GLC-MS对提取物进行植物化学研究，发现所有提取物中都含有青蒿素、青蒿素B和东莨菪素，证实了这一点在体外构成植物络合物的化合物混合物的协同作用。Breuer和Efterth [172014年报道成功使用Herba A. AnuaLuparte®作为兽医肉瘤治疗的辅助治疗。他们发现这种提取物含有大量的微蛋白，而青蒿素仅代表次要成分。Scopoletin可以促进本研究中植物饲料的抗癌活动，如其他作者所建议的[18］．还据报道，来自乙醇提取物Artemisia Nileagirica不含青蒿素的抗肿瘤活性[19］．因此，似乎不太可能是水醇提取物的显着更高的细胞毒性效应是由于野生素蛋白，但更可能是由于植物细胞不同分子的协同效应，这应该在未来的研究中更加关注和仔细表征。

在文献中，有关于青蒿素及其衍生物对细胞周期阻滞作用的不同结果的报道。据报道，青蒿素及其衍生物主要在G中引起细胞周期阻滞_0./ G₁细胞周期素E、细胞周期素D1和细胞周期素依赖性激酶2和4在几种肿瘤细胞系(包括人乳腺癌细胞)中的下调[20.，胆囊癌细胞系[21]， 成神经细胞瘤 [22]、肺癌细胞(A549)、非小细胞肺癌细胞(H1299) [23］．在D-17甘氨酸骨肉瘤细胞系中，纯青蒿素略微但显着增加了S期细胞的数量，并且在Beekman等人的En2肿瘤细胞中也观察到这一点。[24］．另一方面，水醇提取物导致g处的D-17细胞显着增加₂/ m阶段。其他作者发现，氨化蛋白衍生的药物诱导g₂/ m细胞周期逮捕。特别是，二氢氨基蛋白诱导g₂在人骨肉瘤细胞系内的阻滞[25]，卵巢癌细胞系[26和肝癌细胞系[27]，而artesunate诱导g₂在乳腺癌细胞中被捕[28，大鼠垂体腺瘤细胞系[29]和肾癌细胞系[30.］．然而，纯化合物的作用可能与植物提取物的作用不同，植物提取物的复杂性必须加以考虑[31.］．A. Annua.提取物可能含有几种分子，它们的组成可能会因提取策略而改变，也可能因植物收获的时间和地点而改变[32.那33.］．Kim等人[34.评估…的效果A. Annua.提取物对人结肠癌细胞系HCT116，发现细胞周期停滞发生在G₁/ S相由AKT / MTOR途径介导。后来，他们证明了这一点A. Annua.通过调控Bax、Bak、细胞色素等特定蛋白诱导细胞凋亡C在PDK1 / AKT信号传导途径通过PTEN / P53独立的方式[35.］．在这项工作中，细胞循环分析表明，在处理的细胞中发生了循环的不同阶段的修饰细胞分布，观察到的亚g1峰是由于细胞碎片而不是分段的DNA，这是典型的细胞凋亡。细胞周期阶段停滞的差异可能归因于提取物的植物化学复杂性，其中不同化合物的协同作用可能导致妨碍一种途径的替代分子相互作用。需要更多的研究来解开基础的复杂机制A. Annua.提取细胞周期。

通常肿瘤细胞呈现出改变的铁代谢和比正常细胞更高的铁摄入量，以处理其增强的代谢需求，从而呈现增加数量的转移素受体[6.那36.那37.］．因此，细胞内铁浓度的测定是任何进一步分析的先决条件，并且可以为该金属的参与提供重要的支持。在本研究中，在未处理的D-17细胞中测定的铁浓度落入不同哺乳动物细胞中其他作者报告的那些的范围内[38.[尽管不同的准备方案，分析方法和测量系统在许多情况下阻碍了数据的直接比较。在纯青蒿素存在下孵育后A. Annua.提取物，确定D-17细胞中铁代谢的改变，即细胞内总铁的显着降低。在先前的纸张的基础上，众所周知，在铁离子存在下，阿尔胺蛋白诱导的细胞毒性级联的前导事件通过通过产生碳中心的内透铁氧化物桥的切割来表示分子的激活激进能诱导细胞内氧化损伤[2那7.］．然而，调节铁代谢的复杂分子机制与青蒿素的抗癌活性之间的联系A. Annua.提取物远未澄清。在分析青蒿素对Heara癌细胞蛋白质组的影响时，周等人。[39.发现青蒿素主要针对膜运输、蛋白质运输、细胞死亡和存活以及核酸代谢等79种蛋白。作者假设在这些蛋白转铁蛋白受体中，它们在一些肿瘤细胞中过度表达[36.那37.，可以被烷基化，然后被青蒿素灭活，导致癌细胞中的铁选择性耗尽。本研究中发现的细胞内铁的减少支持了这一假设，并为青蒿素和青蒿素引起的铁代谢的改变提供了新的证据A. Annua.提取物。

铁获得和失去电子的能力使这种过渡金属对生命必不可少，但也使铁参与潜在的有害反应;因此，细胞内的铁浓度被精细地调节[40］．特别地，细胞内存在一个受控制的不稳定铁池，例如一个松散结合的氧化还原活性铁池，并充当细胞内铁代谢的十字路口[41.］．在正常细胞中，该游泳池保持在窄的浓度范围内，而在癌细胞中，铁蛋白铁储存的还原可以增加这种不稳定的铁池和氧化应激的风险，这最终可以确定细胞的死亡[36.］．对D-17细胞的检查没有显示细胞核碎片，但显示许多死亡细胞，呈清晰的圆形和“气球”表型，特别是在处理后A. Annua.提炼。该表型最近被报告为一种新型铁依赖性细胞死亡模式的标志，即硬化，[42.］．恶性凋亡是一种规范的细胞死亡，其特征在于，通过自由细胞内铁的增加，然后是脂质氢过氧化物的铁依赖性积累和形态学上与凋亡和坏死相关的特定表型不同[43.］．到目前为止，不同类型的肿瘤对铁下垂表现出敏感性[44.那45.];然而，铁在这种新型细胞死亡中的作用远远完全阐明。在处理的D-17细胞中，可以假设由于转铁蛋白受体的烷基化，触发了低的总细胞内铁，触发了可以通过自噬发生的铁蛋白降解的活化[46.或蛋白质的溶酶体降解[47.］．反过来，这一事件可能有助于增加不稳定的氧化还原活性铁池，确定随后的铁驱动脂质过氧化和裂解性的活化。需要进一步分析来验证这一具有挑战性的假设。

5.结论

总体而言，本研究报告的结果表明，水醇提取物的纯青蒿素在D-17甘氨酸骨肉瘤细胞系上表现出更有效的细胞毒性，表明其他生物活性分子的可能协同效应。这些发现提供了有关青蒿素的生物活性的额外证据A. Annua.提取他们可能并更安全的治疗用途。而且，它们支持狗作为骨肉瘤研究的自发动物模型。尽管通过敏感和具体技术检测了细胞内的总铁，但透明证明了铁代谢的改变，但本文受到限制的影响，即缺乏关于铁相关基因表达和ROS参与裂解子的缺乏调查．因此，未来的研究应专注于这些关键主题和铁稳定池的作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了博洛尼亚大学（RFO）到GI，GA和MF的补助金。

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